丹参酮ⅡA体外促进黑素瘤A375细胞自噬及信号通路的实验研究

目的：探讨丹参酮ⅡA体外对黑素瘤细胞A375细胞自噬的影响及其信号通路研究。方法0.5、1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h后,噻唑蓝（MTT）比色法检测A375细胞的增殖活性。1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞48 h,采用流式细胞仪检测细胞自噬小体的数量,Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin?1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）?Ⅱ蛋白及磷酸肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p70S6激酶1（p70S6K1）蛋白的表达水平。结果 MTT分析显示,0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h,均能抑制A375细胞的增殖能力,且抑制作用呈剂量和时间依赖性（F=2564.12、1235.25,均P<0.05）。流式细胞仪显示,1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后,细胞内自噬小体比例分别为6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%,均明显高于对照组（0.41%±0.02%）,各组间差异有统计学意义（均P<0.05）。Western印迹显示,1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后,细胞自噬相关蛋白Beclin?1和LC3?Ⅱ表达水平随丹参酮ⅡA浓度增加而升高,各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义,且高于对照组（均P<0.05）。而PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路中PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度增加而下降,各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义,且低于对照组（均P<0.05）。结论丹参酮ⅡA可通过抑制P13K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路,促进黑素瘤细胞发生自噬。     

白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路相关分子表达的影响

目的观察白藜芦醇对病理性瘢痕成纤维细胞mTOR信号通路关键分子PI3K、Akt、mTOR表达的影响。方法应用免疫荧光检测PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕及正常皮肤组织成纤维细胞中的表达;病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度白藜芦醇处理后,分别应用RT-PCR、Western Blot检测PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的表达。结果免疫荧光检测结果显示,PI3K、Akt、mTOR在病理性瘢痕成纤维细胞中表达明显增强,且主要表达于细胞核,而在正常皮肤组织成纤维细胞中未见明显表达;RT-PCR及Western Blot检测结果显示,病理性瘢痕成纤维细胞经不同浓度的Res干预后,Akt和mTOR mRNA和蛋白表达量降低,并且呈剂量依赖关系,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05),而PI3K mRNA和蛋白表达量降低不明显,与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。结论白藜芦醇抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖的机制可能与其下调mTOR信号通路关键分子Akt、mTOR表达有关。     

骨髓间充质干细胞对狼疮鼠B淋巴细胞AKT/GSK3β信号通路影响的检测

目的:研究骨髓间充质干细胞(BM-MSC)对MRL/lpr狼疮鼠B淋巴细胞活化及AKT/GSK3β信号通路的影响。方法:从C57/BL6小鼠骨髓细胞中分离培养BM-MSC,用不同剂量的BM-MSC移植治疗MRL/lpr狼疮鼠,4周后免疫磁珠分选出B淋巴细胞,流式细胞仪检测细胞周期,Western Blot检测AKT/GSK3β信号通路相关蛋白表达变化。结果:狼疮鼠B淋巴细胞体外刺激后S期比例明显增多,中、高剂量BM-MSC移植治疗能降低刺激后的狼疮鼠B淋巴细胞S期比例,并增加细胞周期蛋白p27Kip1的表达。BM-MSC移植治疗能抑制B淋巴细胞phospho-AKTThr308及phospho-GSK3βSer9的表达。结论:中、高剂量BM-MSC移植治疗能抑制狼疮鼠B淋巴细胞的异常活化,并抑制AKT/GSK3β信号通路的异常活化。     

阿维A通过下调Th17细胞相关因子改善硬皮病小鼠模型皮肤及肺组织纤维化程度

目的通过对系统性硬皮病(systemic scleroderma,SSc)小鼠模型外周血、皮肤和肺部Th17和Treg细胞及相关细胞因子表达的检测,探讨阿维A治疗SSc小鼠皮肤和肺纤维化病变可能的作用机制。方法 32只BALB/c小鼠随机均分为PBS对照组、博来霉素模型组、阿维A低剂量(6mg/kg)组和高剂量(12mg/kg)组,给药4周后处死。观察小鼠皮肤及肺部炎症和纤维化的病理切片,流式细胞仪检测外周血中Th17和Treg在CD4~+T细胞比例,通过ELISA检测小鼠血清IL-17A,IL-10,IL-6,TGF-β1的水平,RT-PCR检测皮肤和肺组织中IL-17A,RORγT,IL-6,TGF-β1,Fox P3 mRNA的表达,并分析这些结果的相关性。结果与模型组相比,高/低浓度阿维A组小鼠皮肤厚度和炎症评分均有明显的下降(P0.01),肺部的纤维化评分和炎症评分也有显著降低(P0.05)。流式细胞仪检测发现,经阿维A干预的两组小鼠外周血中Th17细胞比例都有显著增加(P0.01),而Treg细胞比例的变化差异无统计学意义(P0.05)。ELISA检测发现,与模型组比较,治疗组小鼠外周血中IL-17A,TGF-β1,IL-6水平均有显著下降(P0.05),而IL-10的表达均未发生明显变化(P0.05)。RT-PCR检测发现,治疗组皮肤和肺组织中Th17细胞相关因子IL-17A,RORγT,IL-6,TGF-β1表达水平显著下降(P0.05),而皮肤和肺组织中Treg相关的Fox P3 Treg mRNA表达在阿维A干预前后没有明显变化(P0.05)。结论阿维A能够通过降低Th17相关细胞因子的水平,减轻免疫炎症反应,改善硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化的程度。     

淋球菌经NLRP3途径调节小鼠脾细胞Th17/Treg平衡

目的研究NLRP3对小鼠脾细胞淋球菌感染模型中Th17/Treg平衡的调节作用。方法体外分离、培养小鼠脾细胞后,分为如下4组:空白对照组、NLRP3拮抗剂(MCC950)组、淋球菌感染组、淋球菌+MCC950组。培养48 h后收集细胞,采用细胞内染色流式细胞术检测Th17/Treg细胞比例,利用实时荧光定量PCR检测NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA表达水平,Western blot检测NLRP3、RORγt、Foxp3蛋白表达。ELISA法检测脾细胞培养上清中Th17/Treg相关细胞因子IL-17、TGF-β、IL-10水平。结果脾细胞在淋球菌的刺激下,Th17细胞和Treg细胞比例增多,细胞内NLRP3、Th17/Treg特异性转录因子RORγt、Foxp3 mRNA和蛋白表达水平升高,细胞培养上清中IL-17、TGF-β、IL-10含量增高(P0.01);加入MCC950预处理后,Th17细胞比例、细胞内NLRP3、RORγt mRNA和蛋白表达、细胞培养上清中IL-17含量明显降低,Treg细胞比例、细胞内Foxp3 mRNA和蛋白表达、细胞培养上清中TGF-β、IL-10含量明显增高,与淋球菌感染组比较差异有统计学意义(P0.01)。结论淋球菌通过NLRP3途径诱导小鼠脾细胞向Th17细胞分化,调节Th17/Treg细胞平衡。     

Akt和mTOR在皮肤基底细胞癌中的表达

目的 检测Akt和雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）在皮肤基底细胞癌( basal cell carcinoma, BCC)中的表达情况,探讨Akt/mTOR信号通路在BCC发病机制中的作用及其临床意义。方法 免疫组织化学方法检测37例BCC以及16例正常皮肤标本中的Akt和mTOR蛋白的表达情况。结果 BCC中Akt蛋白的阳性表达率为62.2%,mTOR蛋白的阳性表达率为83.8%,与正常皮肤组织中Akt蛋白的阳性表达率12.5%和mTOR蛋白的阳性表达率37.5%相比,显著增高(均为P<0.05)。Akt和mTOR的表达水平在BCC中存在正相关,有统计学意义(均为P<0.05)。结论 Akt和mTOR在BCC中的过度表达,提示Akt/mTOR通路可能是BCC发生发展的机制之一。     

IL-35在特应性皮炎样小鼠模型中的表达

目的：检测IL-35在特应性皮炎小鼠模型中的表达。方法：将30只BALB/c小鼠随机分为模型组及对照组,每组15只,使用丙酮：橄榄油3：1溶液作为基质配置0.5% 2,4-二硝基氟苯（DNFB）经皮致敏建立特应性皮炎样小鼠模型。造模成功后使用ELISA法检测小鼠血清中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17的水平,采用RT-PCR法检测皮肤组织中IL-12p35mRNA及EBI3mRNA水平。结果：模型组小鼠背部皮肤出现明显炎症,病理表现为表皮增厚、海绵水肿、真皮浅层炎细胞浸润。模型组小鼠血清中IL-35水平明显低于对照组（P<0.05）,IL-4、IL-17水平明显高于对照组（P<0.05）且IL-35与IL-17水平呈负相关（P<0.05）;模型组小鼠背部皮损组织中IL-12p35及EBI3mRNA水平均低于对照组（P<0.05）。结论：IL-35可能在特应性皮炎发病中发挥作用。     

寻常型银屑病皮损中Th17细胞相关因子的表达

目的:研究Th17细胞相关因子在银屑病发病机制中的作用.方法:用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)半定量分析寻常型银屑病患者皮损区、非皮损区及正常人皮肤组织中Th17细胞相关因子IL-17和IL-23(p19/p40)、IL-6 mRNA的表达.结果:银屑病患者皮损中IL-17、IL-23p19、IL-23p40和IL-6的 mRNA平均相对表达量分别为1.231±0.843、1.166±0.142、1.125±0.104和1.186±0.222.皮损组织中该4种细胞因子mRNA表达水平均高于非皮损组和正常皮肤组,非皮损组四者表达高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05).结论:Th17细胞相关因子在银屑病患者皮损中过度表达,提示Th17型细胞因子在银屑病的免疫发病机制中可能起着非常重要的作用.     

五倍子瘢痕膏对瘢痕疙瘩miR-21/mTOR信号通路相关分子表达的影响

目的观察五倍子瘢痕膏对瘢痕疙瘩miR-21/mTOR信号通路关键分子miR-21、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、10号染色体张力缺失蛋白磷酸酶(PTEN)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达的影响。方法将36只裸鼠瘢痕疙瘩模型随机分成治疗组和对照组,每组18只。治疗组涂抹五倍子瘢痕膏,对照组仅涂抹制作五倍子瘢痕膏的基质,3次/d,连续30 d。然后分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化技术检测治疗组、对照组及正常皮肤组中miR-21和PI3K、PTEN、Akt、mTOR的表达。结果RT-PCR检测结果显示,治疗组和正常皮肤组miR-21相对表达量差异无统计学意义(P>0.05,t=1.24),但二者与对照组相比均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,t=2.76、2.81);免疫组化检测结果显示,PI3K、Akt、mTOR在对照组中高表达,而在治疗组和正常皮肤组中低表达;PTEN在对照组中低表达,而在治疗组和正常皮肤组中高表达。结论五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的机制可能与其通过抑制miR-21表达而上调PTEN表达,进而下调mTOR信号通路中PI3K、Akt、mTOR表达有关。其中PTEN是负反馈调节因子;下游的核糖体蛋白S6激酶(S6K)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(4EBP),二者均是蛋白翻译的关键调节因子。     

PI3K/Akt/mTOR通路在SLE发病机制中的研究进展

PI3K/Akt/mTOR通路高度保守,广泛参与细胞增殖、分化及蛋白合成等活动,近年研究发现该通路的激活在系统性红斑狼疮的发病中起到重要作用,影响T、B淋巴细胞、巨噬细胞及间充质细胞等免疫功能,参与自噬调节。因此,该通路抑制剂的药物研发为SLE治疗提供新思路。本文从PI3K/Akt/mTOR通路组成和作用机制、与SLE发病的密切关系及该通路抑制剂的最新研究进展进行概述。     

CD70 mRNA及其蛋白在SLE患者T淋巴细胞中的表达

目的通过研究SLE患者T淋巴细胞CD70mRNA及其蛋白的表达,探讨CD70在SLE发病机理中的作用。方法用定量RT-PCR方法测定15例活动期、15例非活动期SLE患者和15例正常人对照组外周血T淋巴细胞CD70mRNA转录水平。用流式细胞仪检测各组的CD70+CD4+T淋巴细胞阳性率。结果活动期、非活动期SLE患者及正常对照组T淋巴细胞CD70mRNA转录水平分别为(0.82±0.12),(0.73±0.11)和(0.45±0.09),活动期、非活动期SLE患者明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01),且活动期显著高于非活动期SLE患者,差异有统计学意义(P<0.01)。活动期、非活动期SLE患者及正常人外周血CD4+CD70+T淋巴细胞阳性率分别为(80.30±11.04)%,(66.80±3.98)%和(12.48±3.45)%,活动期、非活动期SLE患者明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01),且活动期显著高于非活动期SLE患者,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CD70的过度表达在SLE的发生发展中起着重要的作用,并且CD70过度表达可以作为SLE疾病活动的一个指标。     

Th17在SLE的组织定位和外周血单一核细胞中的比例

目的 探讨产生IL-17的CD4+T细胞(Th17)在SLE患者组织中的定位,以及与狼疮活动的关系.方法 共聚焦显微镜、免疫荧光双标技术、免疫组化和HE染色,分析Th17细胞业群在4例活动期SLE患者和2例正常人外周血单一核细胞中、皮损组织和肺组织中的定位.流式细胞仪检测50例SLE患者和15例正常人对照外周血Th17的比例,RT-PCR检测相关细胞因子基因表达,用ELISA检测血清中IL-17的分泌水平.结果 在活动期狼疮患者外周血单一核细胞中可见有Th17细胞,其IL-17的荧光强度为(127.6±20.5),明显高于正常人IL-17荧光强度,其值为(40.6±11.1),P＜0.001.在活动期SLE患者受损的皮肤组织和肺组织中可见有Th17细胞的浸润,而正常人皮肤未见有Th17细胞的浸润.活动期SLE患者外周血中Th17比例明显增加,且与SLE活动指数(SLEDAI)呈正相关.相关细胞因子IL-17A和IL-17F mRNA表达明显增加,血清中的不IL-17水平分泌增加,活动期SLE患者中Th17增加与血管炎的发病呈正相关,经过治疗后Th17随病情缓减而减少.结论 Th17细胞亚群在活动期SLE患者体内扩增,其扩增与SLE活动密切相关,可能参与SLE 血管炎的发生.     

CD70在SLE患者外周血T淋巴细胞中表达的研究

目的 通过研究共刺激分子CD70在SLE患者外周血T淋巴细胞的表达水平,以及DNA甲基化抑制剂氮杂胞苷对正常人外周血T淋巴细胞表达CD70分子的影响,探讨DNA甲基化在SLE患者外周血T淋巴细胞表达CD70分子中的调控作用。方法 用流式细胞仪检测了10例活动期、10例非活动期SLE患者和10例正常人对照外周血T淋巴细胞以及甲基化抑制组（氮杂胞苷处理正常人T淋巴细胞）的CD70+CD4+ T淋巴细胞阳性率;用RT-PCR方法测定了各组外周血T淋巴细胞的CD70 mRNA转录水平。结果 正常人外周血CD4+CD70+ T淋巴细胞阳性率为14.55% ± 5.49%,活动期、非活动期SLE分别为85.25% ± 14.08%和77.65% ± 18.77%,甲基化抑制组为81.54% ± 8.71%,与正常人对照组相比,活动期、非活动期SLE患者和甲基化抑制组CD70+CD4+ T淋巴细胞阳性率均明显升高（P < 0.01）,其外周血T淋巴细胞CD70 mRNA表达水平亦明显增加（P < 0.05）;SLE患者外周血CD70+CD4+ T淋巴细胞阳性率与SLE疾病活动度呈显著正相关（r = 0.72,P < 0.05）。结论 CD70的过度表达在SLE的免疫紊乱中起着重要的作用,并且CD70过度表达可以作为SLE疾病活动的一个指标。     

共刺激分子在系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞中的表达

目的：研究CD80CD86及CD28共刺激分子在SLE发病中的作用。方法：采用流式细胞仪检测40例不同病程系统红斑狼疮（SLE）患者外周血淋巴细胞上CD80、CD86及CD28的表达水平。结果：SLE活动组及静止组淋巴细胞上CD80及CD86的表达水平均明显高于正常对照组，活动组又显著高于静止组，且与SLE DAI呈正相关；而CD28的表达水平与正常对照组差异无显著性，且与SLEDAI亦无相关关系，结论：SLE的发生与发展与B7／CD28共刺激途径异常有关。     

间质干细胞对SLE患者外周血T细胞的免疫抑制作用

目的 探讨体外骨髓间质干细胞(MSC)对SLE患者外周血T淋巴细胞(T细胞)的免疫调节作用及可能机制.方法 分离培养健康人骨髓MSC并鉴定其纯度,分离SLE患者外周血T细胞,在植物血凝素(PHA)刺激下,用不同比例的MSC与T细胞作用.分为T细胞、T细胞+MSC_1(T:MSC_1=1:0.02)、T细胞+MSC_2(T:MSC_2=1:0.2)3组.采用MTF法检测T细胞增殖,流式细胞仪检测T细胞CD152~+和CD28~+的表达,实时PCR测定IFN-γ和IL-6 mRNA的表达水平.结果 MSC可明显抑制SLE患者T细胞增殖.T细胞增殖在T细胞组A值为0.765±0.036,T细胞+MSC_1组为0.484±0.032,T细胞+MSC_2组为0.308±0.025,与对照组相比,A值均明显降低(P＜0.05),T细胞+MSC_1组和T细胞+MSC_2组之间差异也有统计学意义(P＜0.05).T细胞组CD28~+细胞百分比为(74.73±3.74)%,T细胞+MSC_1组为(60.39±3.92)%,T细胞+MSC_2组为(45.05±3.46)%,与对照组相比均明显降低(P＜0.05),T细胞+MSC_1组和T细胞+MSC_2组之间差异也有统计学意义(P＜0.05).MSC对T细胞CD152+表达无显著影响.MSC明显抑制T细胞IFN-γ、IL-6 mRNA表达(P＜0.05),并且随着MSC数昔的增加,抑制作用增强.结论 MSC对SLE患者T细胞有免疫抑制作用,可能与抑制T细胞增殖、抑制T细胞CD28~+表达和抑制T细胞IFN-γ、IL-6 mRNA表达有关.     

糖皮质激素对系统性红斑狼疮Th1和Th2类细胞因子的影响

目的:观察糖皮质激素(以下简称激素)治疗对系统性红斑狼疮(SLE)患者Th1和Th2细胞因子表达的影响.方法:采用反转录-聚合酶链反虚(RT-PCR)法,检测SLE患者在激素治疗前、后,外周血单个核细胞(PBMC)中Th1类细胞因子γ干扰索(IFN-γ)和Th2类细胞因子白介素(IL)-4、IL-10 mRNA水平,并与正常人群比较.结果:激素治疗前SLE患者外周血内Th1和Th2类细胞凶子均高于正常人(P＜0.05),以Th2类细胞因子增高显著;治疗后两类细胞因子均明显下降(P＞0.05),但以Th1类细胞因子下降显著.结论:SLE患者存在T辅助细胞亚群失衡,激素治疗可部分纠正分泌失衡的细胞因子.     

Vertical inhibition of the mTORC1/mTORC2/PI3K pathway shows synergistic effects against melanoma in vitro and in vivo

The phosphatidyl inositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin (PI3K/mTOR) pathway has been shown to be involved in the development of melanoma. PI-103 is a kinase inhibitor blocking PI3K class IA and mTOR complex 1 and 2. Here, we studied the effect of targeting the PI3K/mTORC1/mTORC2 pathway by PI-103 and rapamycin in melanoma cells and in a melanoma mouse model. Dual targeting of PI3K and mTOR by PI-103 induced apoptosis and cell-cycle arrest, and inhibited viability of melanoma cells in vitro. Combined treatment with PI-103 and the prototypic mTORC1 inhibitor rapamycin led to the synergistic suppression of AKT and ribosomal S6 protein phosphorylation and to the induction of apoptosis. In vivo, PI-103 and rapamycin displayed only modest single-agent activity, but the combination significantly reduced the tumor growth compared with both single agents. These data show that blocking the PI3K/mTORC1/mTORC2 pathway using the combination of two distinct small-molecule inhibitors ("vertical inhibition") leads to superior efficacy against malignant melanoma in vitro and in vivo.     

SLE患者T淋巴细胞IL-13受体α1基因表达及其调节序列甲基化状态的研究

目的 研究SLE患者外周血T淋巴细胞IL-13受体α1（IL-13Rα1）基因mRNA的表达及IL-13Rα1基因调节序列甲基化状态。方法 免疫磁珠法（MACS）分离10例SLE患者和6例正常人外周血CD4+和CD8+ T细胞，采用实时荧光定量PCR检测T细胞中IL-13Rα1 mRNA的表达，并用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测IL-13Rα1基因调节序列的甲基化水平。结果 活动期SLE患者CD4+ T细胞中IL-13Rα1 mRNA表达水平为2.224 ± 0.251，非活动期SLE患者为1.712 ± 0.132，正常人组为1.104 ± 0.044，三组间比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；CD8+ T细胞中IL-13Rα1 mRNA表达水平活动期、非活动期及正常人组分别为1.672 ± 0.142，1.410 ± 0.154，1.238 ± 0.106，活动期组与正常人组比较差异有统计学意义（P < 0.05），而非活动期组与正常人组、活动期组与非活动期组比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。CD4+ T细胞中IL-13Rα1基因甲基化指数活动期SLE患者为0.454 ± 0.023，非活动期为0.635 ± 0.065，正常人为0.844 ± 0.097，三组间比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；CD8+ T细胞中IL-13Rα1基因甲基化指数三组间比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。SLE患者外周血CD4+，CD8+ T细胞IL-13Rα1 mRNA的表达与疾病活动度（SLEDAI评分）呈正相关（r = 0.79，P < 0.01；r = 0.76，P < 0.05）；CD4+ T细胞的IL-13Rα1基因的甲基化水平与疾病活动度（SLEDAI评分）呈负相关（r = -0.89，P < 0.01）；CD4+ T细胞IL-13Rα1 mRNA表达与其调节序列的甲基化水平呈负相关（r = -0.84，P < 0.01）。结论 SLE的发生发展可能与DNA低甲基化导致SLE患者T细胞过度表达IL-13Rα1有关。