16S rDNA序列分析在临床不常见细菌鉴定中的初步应用

目的建立细菌16S rDNA序列分析技术并探讨其在临床不常见细菌鉴定中的应用价值。方法收集经全自动微生物分析系统鉴定其可靠率在99%及以上的常见细菌10株和常规方法难以鉴定或少见菌17株,通过PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段并进行序列测定,序列与16SpathDB 2.0数据库上已知细菌的16S rDNA序列进行比对分析确定细菌种属。当v3-v4序列片段不能明确鉴定细菌时,结合16S rDNA长片段测序及管家基因dnaJ和rpoB的序列做进一步分析。结果经16S rDNA v3-v4区序列分析,10株(100%)临床常见菌都能鉴定到种水平,其可靠性大于98.0%。17株不常见菌株中,10株(58.8%)细菌只与1种菌相似性大于98.0%,成功鉴定到单个种水平;6株(35.3%)细菌与不止1种菌的相似比大于98.0%;1株菌与已知菌相似性在96.0%~98.0%之间只能鉴定到属(棒状杆菌)。进一步结合16S rDNA长片段及管家基因dnaJ和rpoB的序列分析,所有菌株均可鉴定到单个种水平。结论结合16S rDNA和管家基因序列分析,可用于临床常见及不常见细菌的分子鉴定。     

啮齿类螺杆菌的分离鉴定

目的对分离自啮齿类实验动物的17株螺杆菌进行鉴定,以期获得生物学、遗传学特性典型的菌株作为模式菌株。方法通过生物学特性、16S rRNA序列测定、系统发育树及超微结构分析,对螺杆菌进行种的鉴定。结果确定所分离的17株菌株分为两大类,其中一类为胆汁螺杆菌(H.bilis);另外一类属于螺杆菌属成员。结论所分离到的菌株分别是胆汁螺杆菌和未鉴定到种的螺杆菌,其中胆汁螺杆菌与ATCC51630模式菌株16SrRNA序列比较,相似性达99.6%,可作为检测用的模式菌株。     

抗真菌活性放线菌P-127菌株的生物学特性及多相分类鉴定

目的：从土壤中分离到1株具有较强抗真菌活性的放线菌P－127菌株,对分离菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征、16SrDNA序列进行了系统的研究。方法：采用琼脂扩散法研究P－127菌株的抗真菌活性;形态观察、培养特征、生理生化特征观察采用放线菌分类鉴定常规培养基;采用16SrDNA序列分析法构建系统发育树进行分子生物学分类鉴定。结果：该菌株对啤酒酵母、白色念珠菌以及小麦赤霉病菌等6种真菌具有显著的抑菌活性;形态特征、培养特征、生理生化特征表现出链霉菌属的典型特征,归于金色类群。在系统发育树中,该菌株的序列与Streptomyces padanus的序列完全相同（相似性100％）。结论：结合形态、培养特征、生理生化特征及16SrDNA序列比对分析将菌株P－127鉴定为Streptomyces padanus。     

小连翘内生真菌种群分布及其抗菌性研究

目的 分析小连翘(Hyperioums sampsonii Hance)内生真菌的分布特征和抗菌活性.方法 采用内生菌分离法分离菌株,双培养法对峙试验测定其抗菌性.结果 从小连翘的根、茎、叶等不同的器官中分离得到81株内生真菌,经形态学分类鉴定分属于4个目,5个科,26个属,其中头孢霉属(Cephalosporium sp.)和丝核菌属(Rhizoctonia sp.)为优势菌群.不同部位内生真菌的类型、数量和分布存在差异,根部有31株,分属于12属;茎部有12株,分属于10属;叶部有38株,分属于13属.通过平板对峙实验发现,从小连翘所分离的内生真菌中54.32%对某些植物病原真菌有拮抗活性.结论 小连翘内生真菌及其代谢产物中具有潜在活性物质,值得深入研究.     

树鼩粪便细菌分离培养与鉴定

目的 了解人工饲养树鼩粪便菌群多样性,为树鼩的正常饲养繁殖和微生物质量控制标准化提供依据。方法 随机采集10份树鼩粪便样品,利用有氧及厌氧培养基进行细菌分离培养,提取细菌基因组DNA后PCR扩增16SrRNA基因并测序鉴定。结果 本实验从树鼩粪便样品中,经有氧培养分离鉴定出25株、12种细菌,经厌氧培养分离鉴定出25株、10种细菌,包括变形杆菌属、肠球菌属、埃希菌属、志贺菌属、葡萄球菌属、气单胞菌属、拉恩氏菌属、拉乌尔菌属、微小杆菌属、链球菌属、明串珠菌属。结论 树鼩肠道好氧菌及厌氧菌具有丰富的种属多样性,普通变形杆菌群、费格森埃希菌群和屎肠球菌群可能是树鼩肠道的主要寄生菌群。     

大庆林甸温泉嗜热菌分离及鉴定

目的对大庆林甸温泉嗜热菌进行分离、鉴定,并对其特性进行研究。方法应用常规的稀释涂布法分离和纯化嗜热菌,采用全菌体蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结合细菌形态学及生理生化指标对分离的菌株进行鉴定,并对分离的菌株进行生长特性研究。结果分离纯化出的3株嗜热菌,均为革兰氏阳性菌,菌体杆状,直或接近直,均有芽孢、荚膜、鞭毛,V-P试验、触酶试验、氧化酶试验均阳性,均能降解淀粉。3株菌生长温度范围为35～65℃,pH值范围为4.5～11.5。结论 3株嗜热菌初步鉴定为芽孢杆菌属。     

Isolation and identification of thermophiles from hot springs in Lindian, Daqing

目的 对大庆林甸温泉嗜热菌进行分离、鉴定,并对其特性进行研究.方法 应用常规的稀释涂布法分离和纯化嗜热菌,采用全菌体蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结合细菌形态学及生理生化指标对分离的菌株进行鉴定,并对分离的菌株进行生长特性研究.结果 分离纯化出的3株嗜热菌,均为革兰氏阳性菌,菌体杆状,直或接近直,均有芽孢、荚膜、鞭毛,V-P试验、触酶试验、氧化酶试验均阳性,均能降解淀粉.3株菌生长温度范围为35 ～ 65℃,pH值范围为4.5～11.5.结论 3株嗜热菌初步鉴定为芽孢杆菌属.     

基因扩增联合测序法对痰标本分离的60株真菌病原学鉴定

目的:应用PCR扩增真菌ITS2区基因,结合基因测序法对痰标本中分离的60株真菌进行病原学鉴别。方法:收集痰标本分离的真菌菌落60份及2种真菌标准菌株(白色念珠菌,烟曲霉菌)培养菌落,分别提取基因组DNA,半巢式PCR扩增ITS2区,扩增产物经测序后,结果与NCBI基因库中的核酸序列进行比对,确定致病菌的种属,并对其分布特征进行分析。结果 :2种真菌标准菌株的ITS2区基因序列比对结果与种属一致。痰标本中60株真菌测序鉴定结果为:曲霉菌属24株(其中烟曲霉菌17例、黑曲霉菌3例、黄曲霉菌2例、土曲霉菌1例、变色曲霉1例),青霉菌属3株(小刺青霉菌1株、娄地青霉菌1株、产黄青霉菌1株),念珠菌属29株(白色念珠菌20株、热带念珠菌3株、近平滑念珠菌2株、光滑念珠菌2株、鲁西坦念珠菌1株、季也蒙毕赤酵母菌1株),其它丝状菌还有暗孢节菱孢菌2株,淡紫拟青霉菌1株和串珠状赤霉菌1株。结论:基因测序法能快速、简便、准确地鉴别痰培养的真菌种属,为本地区呼吸道真菌性疾病病原菌流行病学调查及个性化治疗奠定基础。     

一株抗金黄色葡萄球菌肺衣内生真菌的分离与鉴定

目的对一株从肺衣(Lobaria pulmonaria)分离的具有抗金黄色葡萄球菌活性的内生真菌进行形态学和分子生物学鉴定,确定其种属。方法通过组织分离法在肺衣中分离内生真菌,用金黄色葡萄球菌检验抗菌活性;提取内生真菌总DNA,利用PCR方法扩增ITS序列并测序,通过NCBI比对、系统进化树分析和形态学特征鉴定内生真菌。结果从肺衣中分离得到一株内生真菌,并命名为21A1,形态学表明该菌与Lecythophora fasciculata(带油瓶霉)相似,ITS序列分析表明该菌与Coniochaeta velutina(锥毛壳属真菌)同源性较近,L.fasciculata与C.velutina为同一种真菌不同的命名。结论肺衣内生真菌21A1为C.velutina,具有抗金黄色葡萄球菌的作用。     

桃儿七内生真菌分离及其抑菌活性初步研究

目的 探明桃儿七内生真菌资源多样性及其抑菌活性特征。方法 通过组织块法对内生真菌进行分离,并选择5种植物病原真菌和4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。结果 从桃儿七根、茎、叶中分离出49株内生真菌,根部最多,22株,其次为茎部,18株,叶部最少,9株;经形态学分类鉴定归于2个目,3个科,9个属,梭孢霉属为优势菌属;有22株菌对1种或多种供试植物病原真菌有不同程度的抑制作用,占分离菌株数的44.8%,有8株菌对2种或多种供试植物病原真菌有明显的抑制作用,其占所分离菌株总数的16.3%,有3株菌对4种或多种供试植物病原真菌有明显抑制作用,2株内生真菌分别对2种供试指示细菌具有明显的抑制作用。结论 桃儿七内生真菌具有多样性和明显的抗外源真菌活性,抑菌活性菌株主要分布在曲霉属、单孢枝霉属、梭孢霉属,其内生真菌的研究和开发具有重要的生态和经济意义。     

1株具有低营养抗逆特性的嗜麦芽寡养单胞菌的分离和鉴定

目的分离和鉴定贮留在流式细胞仪流动室中的YL08菌株。方法从流式细胞仪流动室中活化、分离和纯化得到YL08分离株,接种于LB培养基和PBS缓冲液中,鉴定YL08分离株的形态和营养抗逆特性,通过16S rDNA的序列测定及构建系统发育进化树分析鉴定YL08分离株的种属。结果镜检显示YL08分离株呈短小杆状,革兰染色阴性;YL08分离株具有较强的低营养抗逆特性,在无营养的PBS缓冲液中可以生存6个月以上;序列比对及系统进化树分析证实YL08分离株为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenortrophomonas maltophilia）,同源性≥99％。结论从流式细胞仪流动室中分离得到1株具有低营养抗逆特性的嗜麦芽寡养单胞菌YL08株,为流式细胞仪的消毒维护及YL08分离株的低营养抗逆保护机制研究奠定基础。     

一起流脑爆发菌株脉冲场凝胶电泳的分子分型研究

目的 运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对一起C群流脑爆发疫情所分离的菌株进行同源性分析.方法 对分离的脑膜炎奈瑟菌进行血清学鉴定后,并进行PFGE分析和确定分子分型.结果 在疫情中分离的6株C群脑膜炎奈瑟菌菌株的PFGE谱型相同,聚类图谱分析相似性为100%,而与韶关翁源1株从健康人分离到的菌株谱型完全不同.结论 PFGE可以作为爆发流行中对细菌进行鉴定和确定菌株的感染来源.     

地黄内生菌的分离鉴定及其抑菌活性测定

对河南焦作产鲜地黄的内生菌进行分离、纯化,对其形态学、生化、16S r DNA序列进行分析及抑菌活性进行测定,初步了解该菌的相关特性并为其资源的开发利用提供参考。方法:对鲜地黄用营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基培养,用划线法进行分离与纯化,然后用革兰氏染色、生化管、16S r DNA序列分析鉴定、药敏试纸抑菌实验对内生菌及其抑菌性进行鉴定。结果:筛选得到的鉴定菌在革兰氏染色及镜检后鉴定显示1号、2号和3号菌均为梭状细菌,4号为杆状细菌;生化管实验的颜色变化显示1号、2号和3号菌为梭菌属细菌,4号菌为土壤农杆菌;16S r DNA的鉴定结果表明3号菌为苏云金芽孢杆菌,3号菌对三种病原微生物的抑菌作用不明显。结论:地黄中分离纯化得到的3号菌的抑菌活性不显著。     

红树内生细菌的分离及皮肤病菌拮抗菌株的筛选

目的从红树健康植株体分离内生细菌对热带常见致皮肤病真菌进行拮抗菌株筛选。方法通过表面消毒组织分离法从红树植物秋茄(Kandelia candel)、白骨壤(Auicennia marina)、无瓣海桑(Sonneratia apetala)的540块组织中分离到内生细菌菌株90株。以致皮肤病真菌须癣毛癣菌(Trichophy mentagrophytes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、犬小孢子菌(Microsporum canis)和石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)为指示菌,采用对峙培养法进行筛选。结果大多数的内生细菌菌株表现一定的拮抗性,对4种病原菌都有拮抗作用的菌株有12株,占总测试菌株的13.33%。其中AC2、SR10、SR17菌株对白色念珠菌(C.albicans)有较强的拮抗作用,而AC2菌株的作用最强,抑制率达72.38%,与其他菌株有极显著性差异。AC2初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。结论从3种红树中共分离获得90株内生细菌。大多数的内细菌菌株表现对致皮肤病真菌一定的拮抗性,以AC2菌株的作用最好,具有应用前景。     

山豆根内生真菌的分离与鉴定

目的从山豆根中分离鉴定内生真菌。方法利用PDA培养基对山豆根进行内生真菌的分离,采用分子生物学手段进行鉴定,通过16S rRNA基因序列分析,比对结果。结果从山豆根中分离得到35株内生真菌,共9属13种,镰刀菌属、间座壳属、刺盘孢属和青霉属均为优势菌属。结论山豆根中含有丰富的内生真菌资源,进一步开发利用山豆根中内生真菌资源具有重要意义。     

1株滇重楼内生真菌的研究——抑真菌活性及分离鉴定

目的 分离滇重楼内生真菌,研究其抑制病原性真菌的作用并进行分类鉴定.方法 从滇重楼植株中分离培养内生真菌.在体外,用指示菌株金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、大肠埃希菌及白色念株菌进行抑菌活性筛选.对具有抑制白色念珠菌的内生真菌菌株进行培养,观察显微形态特征,确定其分类地位.结果 从滇重楼的根中分离到一株内生真蒲菌株,对白色念株菌有较强抑制作用,鉴定为尤孢菌群.结论 滇重楼内生真菌无孢菌群菌株LRF4具有抑制白色念珠菌的作用.     

两株蜚蠊肠道内生放线菌抗真菌活性初步研究和分类鉴定

目的检测蜚蠊肠道内生放线菌WA2-4和WA2-5的抗真菌活性,并对菌株进行初步分类学鉴定。方法采用牛津杯法测定菌株WA2-4和WA2-5发酵液对白色念珠菌和红色毛癣菌等真菌生长的影响,扫描电子显微镜观察菌株发酵液对受试真菌形态的影响,利用16S rDNA测序、Blast比对和构建系统发育树等方法,结合菌株形态学特征对菌株WA2-4和WA2-5进行初步分类学鉴定。结果菌株WA2-4和WA2-5发酵液对白色念珠菌和红色毛癣菌的生长均有抑制作用;扫描电子显微镜结果显示菌株WA2-4和WA2-5发酵液破坏了白色念珠菌的细胞膜结构,使红色毛癣菌的菌丝断裂成碎片;初步分类学鉴定结果显示,菌株WA2-4和WA2-5分别为链霉菌属和戈登氏菌属,与其各自亲缘菌株的16S rDNA序列同源相似性分别为93.5%和92.3%,均低于98.2%,因此推断该两株菌株很有可能是新菌种。结论蜚蠊肠道WA2-4和WA2-5放线菌具有抗真菌活性。     

千层塔内生真菌分离鉴定的初步研究

目的从治疗老年痴呆药用植物千层塔中分离内生真菌，并进行初步鉴定。方法用PDA平板培养基分离菌株，对照真菌鉴定手册，根据菌株的菌落形态、大小、颜色、生长速率、质地、生长培养基颜色变化以及菌丝体和孢子的形态特征进行鉴定。结果从千层塔的茎中分离出4株内生真菌，分别属于顶孢霉属、单轴霉属、酵母和青霉属。结论首次从千层塔中分离和鉴定出4株内生真菌。     

海单胞菌1株的分离和系统发育分析

目的 对从双齿围沙蚕消化道内分离出的菌株Y5进行系统鉴定.方法 通过形态学、生理学、气相色谱法、(+C)mol%、16S rRNA基因序列测定以及系统发育分析,鉴定该细菌的种属.结果 菌株Y5为革兰阴性细菌,直杆状,无芽孢,无鞭毛,大小为(0.5～1.0)μm×(1.5～3.0)μm;生长温度范围～0 ℃;具有嗜盐性,NaCl耐受范围10～130 /L;氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸双水解试验阳性,不还原硝酸盐;可利用葡糖糖、麦芽糖且为惟一碳源;精氨酸脱羧试验阳性;细胞主要脂肪酸成分C18:1ω7c为1.0%、C16:1ω7c为25.5%、C16:0为12.9%,C10:0 3-OH为7.8%.DNA的(+C)mol%为7.5%.菌株Y5 16S rRNA基因序列与9种已确定的海单胞菌相似度为93%～97%.根据16S rRNA基因序列构建的系统发育树显示,该菌株与其他海单胞菌位于系统发育树的同一类群中.结论 该细菌属海单胞菌属,并且可能为海单胞菌属的一个新种,暂命名为沙蚕海单胞菌(M. aibuhitensis sp. nov).     

毛脉酸模内生真菌分布特征及其优势菌群化学成分相似度分析

目的分离得到毛脉酸模内生真菌并分析其优势菌群化学成分相似度。方法分别从毛脉酸模根、茎、叶中分离得到内生真菌,并采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)"分析菌群化学成分相似度。结果自1年生毛脉酸模中共分离得到42株内生真菌,通过形态鉴定初步确定了4目、5科、8属;其中曲霉属(23.8%)、链格孢属(21.4%)以及丝核属(16.7%)为优势菌群;化学成分分析结果表明:相同种属的内生真菌中,化学成分相似度较高的都分离自宿主同一部位。结论毛脉酸模内生真菌具有一定的生物多样性,其分布表现出一定的组织特异性,且同一种属内生真菌的化学成分与其分离部位有一定相关性。