用噬菌体展示技术分析G-CSF受体的配体结合位点

目的：分析粒细胞集落刺激因子（G－CSF）受体中参与配体结合的关键性氨基酸残基。方法：以G－CSF为靶分子，对随机噬菌体文库进行筛选，阳性噬菌体克隆进行序列测定并与G－CSF受体进行同源性比较和分析。结果：得到一个保守性的序列模式SXXRVX，其中第4位氨基酸是高度保守的Arg，表明Arg在与G－CSF的结合中可能起重要作用。将此模式与G－CSF受体进行同源性比较和序列分析，发现G－CSF受体中第288位的Arg也是参与配体结合的关键性氨基酸。结论：模拟小肽和G－CSF 体中高度保守的Arg的存在，说明Arg在G－CSF受体与其配体的结合中起重要作用。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

层黏连蛋白α4链中αvβ3整合素结合肽的精细鉴定与功能分析

目的 利用点突变、缺失突变及功能实验确定αvβ3整合素在已鉴定人层黏连蛋白α4链(human laminin alpha4,LNα4)G19肽段中的最小结合位点及关键氨基酸残基.方法 采用同源序列比较确定G19肽中的保守氨基酸残基,点突变确定其中的关键氨基酸残基,缺失突变确定αvβ3整合素结合的最小肽段,并通过人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管样结构形成实验及鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)实验验证鉴定肽的生物学功能.结果 同源性比较分析发现,G19肽中共存在10个保守性氨基酸残基位点.点突变分析发现第4位的I、第10位的H及第16位的Y是αvβ3整合素结合的关键位点,缺失突变分析确定G1124-1137肽段(G14肽)是αvβ3整合素结合的最小肽段, 合成的G14肽可以浓度依赖性地促进HUVEC管样结构的形成及CAM的血管生成.结论 成功鉴定了αvβ3整合素在LNα4中的最小结合位点及关键氨基酸残基.所鉴定的肽段具有促HUVEC成管样结构及促CAM血管生成的生物学功能.     

结合肽抑制鸭乙型肝炎病毒复制作用的研究

目的:探讨与鸭乙型肝炎病毒多聚酶(DHBVP)特异结合的结合肽,对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的原代鸭肝细胞中DHBV复制的抑制作用.方法:应用噬菌体表面展示技术(PDT)筛选出与DHBVP特异结合的结合肽,经测序得知其核苷酸序列,推论出其氨基酸序列,据此合成结合肽,将其作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,分时段检测细胞核、细胞浆及培养上清中的DHBV-DNA.结果:应用噬菌体展示技术筛选3轮后共筛到7条结合肽,根据推论出的氨基酸序列合成结合肽,作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,其中3号肽、6号肽的培养上清及胞浆中的DHBV-DNA含量低于对照组(P<0.05).结论:与DHBVP特异结合的结合肽对DHBV的复制有抑制作用.     

生物信息学方法推测脊椎动物血红蛋白相互作用机制

目的 通过分析脊椎动物血红蛋白(Hb)分子进化过程,解释Hb相互作用的现象并推测作用机制.方法 采用NCBI、PDB等在线生物信息学网站及SMS、ANTHEPROT 5.0、Clustalx 2.0、MEGA 4、Vector NTI 9等软件包对比脊椎动物门各纲羊膜和非羊膜动物Hb氨基酸多序列的同源相似性,查找保守位点,构建分子进化树,预测二级结构,对比三级结构模型,推测Hb相互作用现象的发生机制.结果 氨基酸多序列对比显示,非羊膜动物α链没有保守氨基酸(cAA),β链有3个cAA,羊膜动物α链、β链分别有27个和68个cAA;分子进化树显示非羊膜动物Hb氨基酸每位点替代值(SpS)远大于羊膜动物(P<0.01);预测二级结构分析Hb作用面发现非羊膜动物α链40位氨基酸主要参与无规则卷曲结构,羊膜动物α链40位和β链94位氨基酸均主要参与α螺旋结构;对比空间结构模型发现羊膜动物α链均有一个苏氨酸(41位)与β链的组氨酸(98位)形成氢键,而非羊膜动物不能形成此氢键.结论 脊椎动物Hb相互作用发生的关键可能在于是否存在α链苏氨酸(41位)与β链组氨酸(98位) 形成的氢键.     

恶性疟原虫EBA-175与血型糖蛋白A结合位点的鉴定

目的 探索EBA-175与GPA之间的结合信息,为疟疾短肽疫苗及拮抗药物的研制奠定基础.方法 以EBA-175重组蛋白为靶,采用亲和筛选法对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选,通过ELISA、竞争抑制试验、Dot-ELISA及Western blotting等方法鉴定获得的噬菌体短肽与EBA-175之间的结合特性.对阳性克隆进行DNA序列测定,推导其十二肽的氨基酸序列并与GPA氨基酸全序列进行了同源性比较.结果 经3轮亲和筛选后,结合噬菌体得到良好富集.从第3轮洗脱液铺制的琼脂板中随机挑取30个噬菌体单克隆,ELISA检测有27个为阳性,阳性率达90%.竞争性ELISA显示多数阳性噬菌体能竞争抑制EBA-175与其单抗结合.DNA及氨基酸序列分析表明24个噬菌体展示十二肽中共有序列IRR与GPA的114-116位氨基酸同源.结论 阳性噬菌体表达的短肽是EBA-175所识别的模拟表位,IRR几位氨基酸可能对EBA-175与GPA的结合起重要作用.     

杜氏盐藻核基质附着区结合蛋白cDNA片段的克隆及序列分析

目的:克隆杜氏盐藻核基质附着区(MAR)结合蛋白片段.方法:根据多种生物MAR结合蛋白氨基酸的高度保守序列EWYGWHF和KYGLIYQ,设计一对简并引物,以杜氏盐藻的cDNA为模板,进行PCR扩增,PCR产物与T载体相连,转化大肠杆菌JM109后,筛选鉴定,对阳性菌落进行测序分析.将测序结果推导成氨基酸序列,与GenBank上其他物种MAR结合蛋白序列进行同源性分析.结果:在杜氏盐藻中得到的cDNA片段,核苷酸长度为474 bp,编码158个氨基酸(GenBank收录号为DQ124215).推导的氨基酸序列与稻、莲、拟南芥、豌豆、烟草、酵母、果蝇和蟾的MAR结合蛋白相比较,同源性分别为74%、73%、73%、73%、71%、70%、68%和67%.结论:所克隆的序列可能为杜氏盐藻MAR结合蛋白片段.     

利用定点突变研究CCR5膜外襻上与HIV gp120结合的关键残基

目的:研究CCR5在作为Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-Ⅰ)进入细胞的辅助受体时,发挥关键作用的氨基酸.方法:通过定点突变对CCR5膜外各襻上的某些氨基酸进行突变,将非极性氨基酸变为极性氨基酸,疏水氨基酸变为亲水氨基酸,芳香族氨基酸变为非芳香族氨基酸,通过将其与gp120分别表达,进行结合实验,寻找与病毒结合活性降低的突变型.结果:当CCR5膜外第一襻用Tyr替代Cys,第三襻用Ser替代Pro后,CCR5与病毒表面糖蛋白gp120的结合活性极大降低.而对其他膜外襻上的氨基酸进行突变后,结合活性无明显改变.结论:病毒进入受体细胞需要受体和辅助受体的介导.CCR5作为辅助受体,主要是通过膜外特定的氨基酸与病毒的gp120发生识别,寻找到这些识别氨基酸就可以为AIDS的预防和治疗提供一定的靶点.     

脂多糖结合蛋白/CD14结合位点的初步定位

目的 应用噬菌体随机12肽库、DNAStar分析软件、亲和实验及竞争抑制实验初步定位脂多糖结合蛋白(1ipopolysaccharide binding protein,LBP)与CD14的结合位点.方法 以CD14为筛选分子,联合应用噬菌体肽库展示技术、噬菌体ELISA鉴定、LBP竞争抑制实验及DNA测序推导LBP/CD14结合位点的展示肽序列,采用DNAStar分析软件比对所获展示肽序列与LBP一级结构,初步定位LBP/CD14结合位点并人工合成其模拟肽.采用ELISA检测该模拟肽与CD14的亲和力及与LBP的竞争抑制活性.结果 DNAStar比对结果表明,经噬菌体肽库筛选获得的8条展示肽氨坫酸序列与LBP第252～263位氨基酸有一定相似性.LBP第252～263位氨基酸具有结合位点的特性,即有良好的亲水性、可及性、可塑性及抗原性,该部位可能是LBP/CD14的结合位点.体外活性实验表明,模拟肽FHRNHRSPVTLL可与CD14有良好的亲和力,有较强的与LBP竞争结合CD14的活性.结论 LBP第252～263位氨基酸的模拟肽FHRNHRSPVTLL与CD14有良好的亲和力及有较强的与LBP竞争结合CD14的活性,具有LBP/CD14结合位点的生物学特性,LBP/CD14结合位点初步定位在该区域.     

对脂多糖结合蛋白致炎的多肽序列分析

目的应用噬菌体随机12肽库探讨脂多糖结合蛋白(LBP)致炎作用的多肽序列.方法以LPS为目标分子,对噬菌体12肽库进行亲合筛选,4轮筛选后,检测随机挑取的噬菌体克隆的结合活性和抑制活性,将得到的16个可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆进行生物学功能检测,对获得的9个阳性克隆进行测序,并与LBP序列比较.结果9个阳性克隆展示多肽的核心序列为WKXRKXFXKXXG,与LBP的91～102位氨基酸序列有较高同源性.结论LBP的91～102位氨基酸可能为其致炎作用部位.