miR-21靶向Atg5对非小细胞肺癌A549细胞自噬调控促进细胞增殖、迁移和侵袭的实验研究

目的  探讨miR-21通过靶向作用自噬相关靶基因5（Atg5）调控非小细胞肺癌（NSCLC）自噬的作用机制及其在A549细胞增殖、迁移及侵袭中的作用。方法  无义核酸序列NC（NC组）、miR-21 模拟物（miR-21 mimics组）、miR-21抑制物（miR-21 抑制组）分别转染A549细胞, CCK-8检测细胞增殖情况;划痕实验检测细胞迁移能力; Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。双荧光素酶报告实验验证miR-21和Atg5之间的靶向关系。Western blotting检测LC3B-II、p62和Atg5蛋白的表达。结果  与NC组比较,miR-21 mimics组细胞增殖、迁移、侵袭能力均上调,miR-21 抑制组细胞增殖、迁移、侵袭能力均下调（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-21显著抑制野生型Atg5 3’-UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性（P＜0.05）,但对突变型Atg5 3’-UTR的基因报告质粒与miR-21 mimics共转染之后,并未对荧光素酶活性产生影响。NC组LC3B-II蛋白表达量为1.24±0.059,低于miR-21 mimics组的1.98±0.077,高于miR-21抑制组的0.52±0.021（P＜0.05）;NC组p62蛋白表达量为0.62±0.021,高于miR-21 mimics组的0.45±0.020,低于miR-21抑制组的0.79±0.031（P＜0.05）;NC组Atg5蛋白表达量为1.17±0.025,高于miR-21 mimics组的0.38±0.014,低于miR-21抑制组的1.40±0.039（P＜0.05）。与NC组比较, 3-MA处理降低miR-21 mimics转染诱导的A549细胞增殖能力（P＜0.05）;划痕实验和Transwell实验表明,3-MA处理抑制了miR-21mimics转染诱导的A549细胞的迁移和侵袭,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论  miR-21靶向Atg5调控NSCLC自噬促进细胞增殖、迁移和侵袭。     

miR-625 通过负向调控Resistin 的表达抑制非小细胞肺癌细胞的恶性生物学行为及其机制

目的：探究miR-625 和Resistin 对NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移及裸鼠移植瘤生长的影响及其可能的机制。方法：qPCR 实验检测80 例NSCLC 及癌旁组织（标本收集自2018 年3 月至2019 年10 月于新疆维吾尔自治区人民医院手术治疗的NSCLC患者）和4 种细胞系中miR-625 与Resistin 的表达，生物信息学预测两者的靶向关系并用双荧光素酶基因报告实验进行验证；通过脂质体转染技术在NSCLC细胞中过表达或抑制miR-625 及Resistin 表达，实验分为miR-625 mimic 组、miR-625 inhibitor组、si-Resisitin 组、miR-625 inhibitor+si-Resisitin 组和NC组，利用CCK-8、Transwell 及划痕实验检测miR-625 与Resistin 对NSCLC细胞增殖、侵袭及迁移的影响，Western blotting 实验检测两者对NSCLC细胞中EMT相关的PI3K/AKT/Snail 通路蛋白表达的影响，裸鼠成瘤实验观察两者对A549 细胞移植瘤生长的影响。结果：miR-625 在NSCLC组织和4 种细胞系中呈低表达、Resistin呈高表达（均P<0.01），两者表达水平呈负相关（r=-0.7183，P<0.01），且Resistin 的表达与NSCLC分化程度、临床分期及淋巴结转移相关。Resistin 是miR-625 的靶基因。在NSCLC 细胞系A549 和H226 的增殖、侵袭、迁移能力及裸鼠移植瘤的生长方面，与Blank 组和NC组相比，miR-625 mimic 组与si-Resistin 组能力均显著降低（均P<0.05），miR-625 inhibitor 组显著提高（均P<0.05）；miR-625 inhibitor+si-Resistin 组显著低于miR-625 inhibitor 组（均P<0.05）；NC组与miR-625 inhibitor+si-Resistin 组之间无显著差异（均P>0.05）；p-AKT、p-PI3K、Snail、Twist1、Vimentin 等蛋白表达变化也有相同的趋势（均P<0.05），E-cadherin 蛋白表达则发生相反的改变（P<0.05）。结论：miR-625 在NSCLC组织和细胞中均呈低表达，其能负向调控Resistin 表达从而抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移及裸鼠移植瘤生长，其机制可能与PI3K/AKT/Snail信号通路有关。     

miR-155在非小细胞肺癌组织和细胞中的表达及对细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的:探讨miR-155在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭的影响机制。方法:通过生物信息学网站预测miR-155的可能靶基因,双荧光素酶报告基因实验进行验证;采用qRT-PCR测定NSCLC组织及细胞中miR-155和ZIC3的表达;通过LipofectamineTM2000试剂盒向A549细胞中分别转染miR-155 mimic和mimic NC,共转染miR-155 mimic+pMIR-ZIC3;Western blot检测转染miR-155 mimic对ZIC3蛋白表达的影响;MTT法、划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测miR-155对A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响。结果:生物信息学网站预测显示ZIC3-3' UTR与miR-155存在结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证ZIC3是miR-155的靶基因,ZIC3表达受miR-155的负向调控。NSCLC组织及细胞中miR-155显著低表达,ZIC3显著高表达（P＜0.05）;过表达miR-155抑制了ZIC3蛋白的表达水平（P＜0.05）。转染miR-155 mimic显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力（P＜0.01）;共转染miR-155 mimic+pMIR-ZIC3逆转了miR-155 mimic对NSCLC细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用（P＜0.05）。结论:NSCLC中miR-155显著低表达,其过表达可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭;miR-155可能通过靶向负调控ZIC3影响NSCLC细胞的生物学行为。     

长链非编码RNA SNHG7靶向微小RNA-186-5p及对肝癌细胞迁移侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因7(SNHG7)靶向微小RNA-186-5p(miR-186-5p)对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及潜在机制。方法基于UALCAN网站分析TCGA数据库中肝癌组织的SNHG7水平,应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析SNHG7水平与肝癌预后的关系;采用实时荧光定量PCR检测人正常肝上皮细胞HL-7702和肝癌细胞(HCCLM3、Hep3b、HepG2、HuH-7)的SNHG7水平。选择HuH-7细胞并转染靶向SNHG7的小干扰RNA(si-SNHG7组)或阴性对照序列(si-NC组)并以未转染的细胞为对照组,MTT、划痕实验和Transwell小室实验分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭情况。双荧光素酶报告基因实验验证SNHG7与miR-186-5p及miR-186-5p与AKT3间的靶向关系,Western blotting检测磷酸化PI3K调节亚基p85α(p-PI3K p85α)和磷酸化AKT(p-AKT)的水平。结果肝癌组织的SNHG7水平较正常组织升高且与肿瘤分期和分级有关(P<0.05);肝癌组织的SNHG7水平与无进展生存期(PFS)有关,其中SNHG7低水平者的中位PFS为25.13个月,优于高水平者的15.07个月(P<0.05)。肝癌细胞的SNHG7水平高于HL-7702细胞(P<0.05);与对照组和si-NC组相比,si-SNHG7组的细胞活力降低,划痕愈合率和穿膜细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-186-5p是SNHG7的作用靶点,且miR-186-5p表达受SNHG7负调控;miR-186-5p能够靶向负调控AKT3表达。与对照组和si-NC组相比,si-SNHG7组HuH-7细胞的p-PI3K p85α和p-AKT水平降低(P<0.05)。结论SNHG7可能通过调控miR-186-5p/PI3K/AKT3轴来促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果为探究肝癌转移提供一种新机制。     

丹皮酚通过下调miR-21并抑制PI3K/AKT通路抑制Hela细胞侵袭、转移及增殖

目的:探讨丹皮酚对Hela细胞增殖、侵袭及迁移的影响及可能机制。方法:使用不同浓度（50、100、200 和400 mg/L）丹皮酚处理Hela细胞株,分为正常对照组（NC组）、不同浓度丹皮酚组、miR-NC组、miR-21组、丹皮酚+miR-NC和丹皮酚+miR-21组。PI3K的激动剂740Y-P (25 μg/mL)加入丹皮酚组、 NC组,分别定义为丹皮酚+740Y-P组、740Y-P组。MTT检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力;实时荧光定量PCR检测细胞miR-21表达水平;Western blot检测细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）、MMP9水平。结果:丹皮酚可抑制Hela细胞增殖能力（P＜0.05）,抑制作用与浓度呈正相关。选择200 mg/L的丹皮酚进行后续研究。与NC组比较,丹皮酚组侵袭及迁移细胞数量、MMP2蛋白、MMP9蛋白、miR-21表达水平明显降低（P＜0.01）。与NC组比较,丹皮酚组细胞凋亡率增加,G1期延长,S期、G2期缩短（P＜0.01）。与NC组、miR-NC组相比,48、72 h 时miR-21组细胞活力明显升高（P＜0.05）,克隆、侵袭及迁移细胞数量明显升高(P＜0.05)。与丹皮酚组、丹皮酚+miR-NC组比较,丹皮酚+miR-21组克隆、侵袭及迁移细胞数升高（P＜0.05）。与NC组比较,丹皮酚组细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平明显下降（P＜0.01）;与丹皮酚+miR-NC组比较,丹皮酚+miR-21组细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。与丹皮酚组比较,丹皮酚+740Y-P组克隆、侵袭及迁移细胞数升高（P＜0.01）,与740Y-P组比较,丹皮酚+740Y-P组克隆、侵袭及迁移细胞数降低（P＜0.01）。结论:丹皮酚可下调miR-21,抑制PI3K/AKT通路,进而抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移。     

miRNA-139-5p通过靶向调控CXCR4/CXCL12信号通路逆转非小细胞肺癌A549细胞顺铂耐药

目的:探讨miRNA-139-5p对非小细胞肺癌A549细胞顺铂（cisplatin,DDP）耐药的影响,及其可能的分子机制。方法:采用DDP浓度递增法诱导A549细胞建立DDP耐药细胞株A549/DDP,将miR-139-5p mimics、无义序列（mimics-NC）、CXCR4过表达质粒（pcDNA3.1-CXCR4）、pcDNA3.1空载质粒（Vector）转染至A549/DDP细胞中,将细胞分为mimics-NC组（转染无义序列）、mimics组（转染miR-139-5p mimics）、mimics+Vector组（共转染miR-139-5p mimics和空载质粒）和mimics+CXCR4组（共转染miR-139-5p mimics和CXCR4过表达质粒）,另设置空白对照组（blank）。不同浓度DDP处理,MTT法检测细胞增殖活性,并计算IC50值和耐药指数（resistance index,RI）;qRT-PCR法检测细胞中miR-139-5p和CXCR4 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MRP1）及CXCR4/CXCL12信号通路相关蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-5p与CXCR4的靶向关系。结果:不同浓度DDP处理24 h后,耐药株A549/DDP及其亲本A549细胞IC50值分别为（208.87±27.89）μmol/L和（31.66±6.30）μmol/L,RI=6.59。与亲本A549细胞比较,耐药株A549/DDP中miR-139-5p的表达水平明显降低（P＜0.05）,而CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。与mimics-NC组比较,mimics组A549/DDP细胞增殖活性明显降低（P＜0.05）,细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）,细胞中CXCR4 mRNA和蛋白以及P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT/AKT等蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与mimics+Vector组比较,mimics+CXCR4组A549/DDP细胞增殖活性显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）,而细胞中CXCR4、P-gp、MRP1、PI3K（p110α）和p-AKT等蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-139-5p靶向负调控CXCR4表达。结论:miRNA-139-5p通过靶向下调CXCR4表达,提高非小细胞肺癌DDP耐药细胞株A549/DDP对DDP的药物敏感性。     

miR-30a对卵巢癌细胞PTEN/PI3K/AKT/mTOR自噬通路及顺铂耐药性的影响

目的:探究miR-30a对人卵巢癌SKOV3细胞自噬及顺铂耐药性的影响,并初步研究其作用机制。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞和人卵巢癌细胞（耐药）细胞（SKOV3/DDP）;将SKOV3/DDP细胞随机分为对照组、miR-30a 阴性对照（NC）组和miR-30a模拟（mimics）组,SKOV3细胞作为正常组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞miR-30a表达情况;CCK-8法检测各组细胞顺铂耐药性;Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞凋亡情况;蛋白印迹分析法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3 I/II（LC3I/II）、p62、磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）表达情况;双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-30a与PTEN的靶向关系。结果:与对照组和miR-30a NC组相比,miR-30a mimics组SKOV3/DDP细胞miR-30a表达水平、凋亡率、p62、p-PI3K、p-AKT及p-mTOR水平显著升高（P＜0.05）,IC50值、LC3II、PTEN蛋白表达水平及LC3II/LC3I比值显著降低（P＜0.05）;与正常组相比,对照组SKOV3/DDP细胞上述各指标变化趋势完全相反;mirbase数据库预测显示,miR-30a与PTEN mRNA 3' UTR区有结合位点,与PTEN-3' UTR-WT+miR-30a NC组比较,PTEN-3' UTR-WT+miR-30a inhibitor组荧光素酶活性降低（P＜0.05）。结论:miR-30a可能通过靶向抑制PTEN表达,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路调控人卵巢癌细胞自噬,降低卵巢癌细胞的顺铂耐药性。     

miR-769-5p在非小细胞肺癌中的表达及其对细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响

目的 探讨微小RNA-769-5p （miR-769-5p） 在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株中的表达及其对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）技术检测miR-769-5p 在5种NSCLC细胞（A549、NCI-H1299、NCI-H157、ANIP-973和GLC-82）中的相对表达量,选择相对表达量最低和最高的细胞株分别转染miR-769-5p mimics／miR-769-5p inhibitor,另设miRNA mimics control／inhibitor control对照组;采用MTS 实验、克隆形成实验及Transwell 小室实验检测miR-769-5p对NSCLC 细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力的影响。结果 miR-769-5p在A549、NCI-H1299、NCI-H157、ANIP-973 及GLC-82细胞中的相对表达量分别为 0.06、0.40、0.09、1.04和2.31。在miR-769-5p表达水平最低的A549细胞中瞬时转染miR-769-5p mimics,在miR-769-5p表达水平最高的GLC-82细胞中瞬时转染miR-769-5p inhibitor。MTS结果显示,与对照组比较,miR-769-5p mimics 能够抑制A549细胞的增殖 （P＜0.05）,而miR-769-5p inhibitor能够促进GLC-82细胞的增殖 （P＜0.05）。平板克隆实验结果显示,与对照组比较,miR-769-5p mimics 能够抑制A549细胞的平板克隆形成数 （124.7±14.7 vs. 399.4±46.0,P＜0.05）;而miR-769-5p inhibitor能够促进GLC-82细胞的平板克隆形成数 （555.7±29.7 vs. 366.3±28.7,P＜0.05）。Transwell实验结果显示,与对照组迁移和侵袭跨膜细胞数比较,miR-769-5p mimics能够抑制A549细胞的迁移和侵袭 （94.4±18.1 vs. 157.8±22.9,84.4±15.1 vs. 135.6±16.7,P＜0.05）;miR-769-5p inhibitor能够促进GLC-82细胞的迁移和侵袭 （226.7±40.3 vs. 153.3±38.7,196.7±39.1 vs. 138.9±40.4,P＜0.05）。结论 miR-769-5p可以抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移,可能成为NSCLC的潜在靶点。     

lncRNASNHG11通过吸附miR-193a-5p促进NSCLC细胞A549的恶性生物学行为

目的： 探讨lncRNA SNHG11对非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能机制。 方法:qPCR检测人胚肺细胞HEL-1和NSCLC细胞A549、H1299、HCC827中lncRNASNHG11和miR-193a-5p的表达水平,向A549细胞中转染SNHG11小干扰RNA（si-SNHG11）、miR-193a模拟物（miR-193a mimic）或miR-193a抑制剂（miR-193a inhibitor）后,CCK-8法检测其对细胞增殖的影响,Transwell小室和细胞划痕实验检测对细胞侵袭和迁移的影响,WB法检测对细胞增殖抗原Ki67、细胞周期蛋白D1 （cyclin D1）表达的影响,双荧光素酶报告实验验证lncRNASNHG11与miR-193a-5p的靶向关系。 结果： 与人胚肺细胞HEL-1相比,NSCLC细胞A549、H1299、HCC827中lncRNA SNHG11均呈高表达、miR-193a-5p呈低表达（均P<0.05）;沉默lncRNA SNHG11可抑制A549细胞的增殖、侵袭和迁移,降低细胞中Ki67和Cyclin D1蛋白的表达水平（均P<0.05）;过表达miR-193a-5p可抑制A549细胞增殖和侵袭迁移（均P<0.05）。lncRNASNHG11可靶向吸附miR-193a-5p,抑制miR-139a-5p可部分逆转沉默lncRNA SNHG11对A549细胞增殖、侵袭和迁移的作用（均P<0.05）。 结论：lncRNA SNHG11通过吸附miR-193a-5p促进NSCLCA549细胞的增殖、侵袭和迁移。     

miR-101-3p在胃癌中的表达及其靶向STC-1基因调控PI3K/AKT信号通路对癌细胞侵袭转移和血管生成的影响

目的 探究miR-101-3p在胃癌中的表达及其靶向STC-1基因调控PI3K/AKT信号通路对癌细胞侵袭转移、血管生成的作用机制。方法 qRT-PCR检测胃癌组织及BGC-823细胞中miR-101-3p和STC-1 mRNA的表达,并分析miR-101-3p表达与患者临床病理因素的关系;通过LipofectamineTM 2000将miRNA模拟物和质粒分别或者联合转染细胞;TargetScanHuman预测及双荧光素酶报告验证miR-101-3p对STC-1的靶向调控关系;划痕实验、Transwell小室实验、Matrigel体外成管实验及Westernblot检测验证miR-101-3p靶向STC-1基因对癌细胞的侵袭转移和血管生成的影响及可能的机制,并通过裸鼠致瘤实验检测移植瘤的发展。结果 胃癌组织中STC-1的表达水平高于正常组织。与正常胃组织和GES-1细胞相比,胃癌组织和BGC-823细胞中miR-101-3p下调,STC-1 mRNA上调,且miR-101-3p水平与STC-1水平负相关,miR-101-3p水平与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移显著相关（P<0.05）;过表达miR-101-3p可抑制STC-1的表达,下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、MMP-2、MMP-9、VEGF、Ang2水平,抑制肿瘤细胞的侵袭转移和血管生成,降低移植瘤体积和重量（P<0.05）。结论 miR-101-3p在胃癌中表达下调,能够靶向STC-1基因调控PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞BGC-823的侵袭转移和血管生成及体内移植瘤的进展。     

miR-182激活PI3K/AKT信号通路促进肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的:探讨miR-182通过PI3K/AKT信号通路对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法:将体外培养的HepG2细胞分为对照组(未转染)、阴性组(转染阴性对照)、模拟物组(转染miR-182模拟物)和模拟物+抑制剂组(转染miR-182模拟物后,加入PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002),采用RT-PCR检测各组细胞中miR-182的表达水平,Western blot检测各组细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达,采用MTT法、克隆形成实验和Transwell小室分别检测各组细胞的增殖、侵袭和迁移能力。结果:与对照组相比,模拟物组细胞的存活率、克隆形成率和侵袭细胞数、迁移细胞数均明显升高,细胞中p-PI3K、p-AKT和MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达水平也均明显上升(P<0.05);而阴性组和对照组细胞相比无显著性差异(P>0.05)。与模拟物组相比,模拟物+抑制剂组细胞的存活率、克隆形成率和侵袭细胞数、迁移细胞数明显降低,细胞中p-PI3K、p-AKT和MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达水平也均明显下降(P<0.05)。结论:miR-182可通过激活PI3K/AKT信号通路上调MMP-9、c-Myc、VEGF蛋白的表达促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。     

siRNA沉默STMN1基因抑制肺癌细胞增殖与侵袭的机制探讨

目的:观察下调肺癌细胞中STMN1基因的表达对癌细胞增殖、侵袭及PI3K/AKT信号通路的影响。方法:以人正常肺细胞MRC-5作为对照,通过Western bloting检测人肺癌A549、SPC-A1和H322细胞中STMN1的蛋白表达;STMN1的siRNA转染A549细胞为实验组,另设空白组和阴性组,转染48 h后,Western bloting检测转染效果;CCK8法及Transwell小室分别检测细胞的增殖及侵袭能力;Western bloting检测增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）的蛋白表达。结果:STMN1在肺癌A549、SPC-A1和H322细胞中的蛋白表达均显著高于在MRC-5细胞中的表达（P<0.05）,选择A549细胞为研究对象。转染STMN1 siRNA的A549细胞STMN1的蛋白表达显著低于空白组（P<0.05）。与空白组比较,实验组细胞增殖及侵袭能力均显著降低,PCNA、MMP-2、PI3K、p-AKT蛋白表达均显著降低（P<0.05）。结论:siRNA沉默STMN1的表达通过下调PI3K/AKT信号通路降低肺癌细胞增殖及侵袭能力。     

黏蛋白13在肺腺癌组织中的表达及其对A549细胞恶性生物学行为的影响与可能的机制

目的：探讨黏蛋白13(MUC13)在肺腺癌组织中的表达及其对A549细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及EMT的影响与可能的机制。方法：通过癌症基因组图谱（TCGA）和高通量基因表达（GEO）数据库分析MUC13在肺腺癌组织与正常肺组织、癌旁组织中的差异表达。qPCR法和WB法检测人肺腺癌细胞NCI-H1395、NCI-H1975、H1299、A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B中MUC13 mRNA和蛋白的表达水平。利用si RNA技术敲低A549细胞中MUC13表达,实验分为si-MUC13组、NC组和si-MUC13+IGF-1组。通过克隆形成实验、流式细胞术和Transwell实验分别检测敲低MUC13对A549细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响,WB法检测敲低MUC13对A549细胞上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白表达的影响。结果：MUC13 mRNA和蛋白在肺腺癌组织和细胞中均呈高表达（均P<0.01）,选取表达水平较高的A...     

miR-509-5p通过靶向HMGA2调控非小细胞肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭及其机制探讨

目的:探讨miR-509-5p通过靶向HMGA2对非小细胞肺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用及其机制。方法:体外培养人正常肺细胞株CCD-19LU和肺腺癌细胞株A549、H1299,采用qRT-PCR检测miR-509-5p的表达;转染miR-509-5p mimics构建miR-509-5p过表达的H1299细胞后,采用MTT和克隆形成实验检测细胞的增殖能力,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力,Western blot检测TWIST1、β-catenin和AXIN1蛋白的表达。通过生物信息学分析预测HMGA2可能是miR-509-5p的靶点,并采用双荧光素酶报告基因系统和Western blot检测miR-509-5p和HMGA2的靶向关系。转染干扰质粒载体pLL2G-shHMGA2构建HMGA2沉默的H1299细胞,采用MTT实验、克隆形成实验和Transwell小室实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力,Western blot检测TWIST1、β-catenin和AXIN1蛋白的表达。结果:与CCD-19LU细胞相比,A549和H1299细胞中miR-509-5p表达明显降低（P<0.05）,且在H1299细胞中低于在A549细胞中的表达（P<0.05）。与miR-NC组相比,miR-509-5p组细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显减弱（P<0.05）,TWIST1和β-catenin蛋白的表达明显降低（P<0.05）,而AXIN1蛋白的表达明显升高（P<0.05）;野生型miR-509-5p组细胞的荧光素酶活性明显低于miR-NC组（P<0.05）,而野生型anti-miR-509-5p组细胞的荧光素酶活性明显明显高于anti-miR-NC组（P<0.05）;miR-509-5p过表达可抑制HMGA2表达,反之则促进其表达。沉默HMGA2表达后,H1299细胞的变化趋势与miR-509-5p过表达的结果相一致。结论:miR-509-5p可通过靶向HMGA2调控非小细胞肺癌H1299细胞的增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-211通过靶向下调SATB2表达促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移与侵袭

目的:探讨miR-211及SATB2基因在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织和细胞中的表达情况,探究miR-211在NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭过程中的作用及其相关机制。方法:双荧光素酶报告系统验证miR-211和SATB2的相互作用机制;qRT-PCR检测miR-211和SATB2在NSCLC组织及癌旁组织中的表达情况;向A549细胞中转染miR-211 mimics、miR-211 inhibitor和pcDNA3.1-SATB2,检验转染效率及转染后A549细胞中SATB2 mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8实验和Transwell小室分别检测miR-211和SATB2表达变化对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:双荧光素酶报告系统结果提示SATB2 3' UTR是miR-211直接结合的靶位点。NSCLC组织中miR-211表达上调,SATB2表达下调,两者表达呈线性负相关(P＜0.05)。转染miR-211 mimics显著下调A549细胞中SATB2 mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.05);转染miR-211 inhibitor和pcDNA3.1-SATB2使A549细胞中SATB2 mRNA和蛋白的表达水平增高(P＜0.05)。CCK-8实验显示,相较于对照组,miR-211过表达组的A549细胞增殖率显著增加(P＜0.05),miR-211抑制组和SATB2过表达组的A549细胞增殖能力下降(P＜0.05)。Transwell小室实验结果显示,与对照组相比,miR-211抑制组和SATB2过表达组的A549细胞迁移和侵袭能力明显降低(P＜0.05)。在miR-211过表达组共转染SATB2过表达,使miR-211介导的对A549细胞增殖、迁移及侵袭的促进作用受到抑制。结论:下调miR-211的表达可以增加NSCLC细胞中SATB2转录及转录后表达水平,从而抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

miR-4728-3p通过PI3K/AKT信号通路调控DOT1L基因抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移

目的:探讨miR-4728-3p通过调控类端粒沉默干扰体-1(disruptor of telomeric silencing 1-like,DOT1L)基因对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:使用乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231及人正常乳腺细胞MCF-10A。转染MCF-7和MDA-MB-231细胞随机分为NC组(转染miR-4728-3p-NC)和敲低组(转染miR-4728-3p-inhibitor)。利用RT-qPCR技术检测不同的细胞中miR-4728-3p和DOT1L的表达量改变情况。集落克隆形成实验和EDU实验可以同时检测体内各个细胞异常增殖的情况;TUNEL荧光标记检测法和流式细胞术实验可以同时检测不同组癌细胞的凋亡变化;划痕实验和Transwell实验可以同时检测到在各个细胞内因不同处理而可能产生的细胞迁移率和侵袭力的改变;Western blot检测与细胞凋亡状态相关细胞蛋白以及与细胞通路凋亡相关细胞蛋白p-AKT和p-PI3K相对表达的含量。结果:在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231以及SKBR3中发现miR-4728-3p和DOT1L的表达高于人正常乳腺细胞MCF-10A(P＜0.05)。转染细胞miR-4728-3p后,与NC组细胞进行实验比较,发现敲低组细胞中miR-4728-3p和DOT1L的表达量明显降低,且敲低组细胞的增殖能力明显减弱,细胞凋亡率明显升高,细胞迁移能力大大降低。敲低组的细胞凋亡活性蛋白相对表达明显发生变化。其中p-AKT与p-PI3K蛋白均被抑制激活。RT-qPCR和Western blot实验验证DOT1L是miR-4728-3p的下游靶向基因。结论:敲低miR-4728-3p可以下调DOT1L的表达从而促进乳腺癌细胞凋亡,抑制乳腺癌细胞增殖,同时使乳腺癌细胞侵袭和迁移能力减弱。     

HOTAIRM1靶向miR-129-5p对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的:研究长链非编码RNA HOTAIRM1（lncRNA HOTAIRM1）与微小RNA-129-5p（miR-129-5p）的靶向关系及其对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响。 方法:荧光定量PCR（qPCR）检测HOTAIRM1和miR-129-5p在人正常脑组织和胶质瘤组织中的表达。建立抑制HOTAIRM1表达细胞株,研究其对U251细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭;蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）、上皮钙黏素（E-cadherin）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）水平。生物学信息预测和双荧光素酶报告基因法分析HOTAIRM1和miR-129-5p之间的靶向关系。共转染si-HOTAIRM1和anti-miR-129-5p,观察抑制miR-129-5p表达对抑制HOTAIRM1表达诱导的U251细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。 结果:HOTAIRM1在胶质瘤组织中的表达明显上调（P<0.05）,miR-129-5p表达下调（P<0.05）。抑制HOTAIRM1表达显著降低U251细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白表达量（P<0.05）,明显增加U251细胞凋亡率和p21、Bax、E-cadherin蛋白表达量（P<0.05）。miR-129-5p是HOTAIRM1的靶基因。上调或下调HOTAIRM1表达明显调控miR-129-5p表达（P<0.05）。抑制miR-129-5p表达逆转了抑制HOTAIRM1表达对U251细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Cyclin D1、MMP-2、Bcl-2蛋白表达的抑制作用,并逆转了抑制HOTAIRM1表达对U251细胞p21、E-cadherin、Bax蛋白表达和细胞凋亡率的促进作用。 结论:lncRNA HOTAIRM1通过靶向miR-129-5p影响胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。     

miR-449a通过下调HDAC1表达抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移北大核心

目的:分析miR-449a对人非小细胞肺癌细胞株A549增殖、侵袭和迁移的影响。方法:通过Real-time PCR检测人肺成纤维细胞MRC-5、人非小细胞肺癌细胞株A549和HCC827中miR-449a和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)的表达水平。利用CCK-8法和Transwell法分析miR-449a对A549细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。使用生物信息软件分析miR-449a的靶向集合位点,并构建荧光素酶报告基因质粒,通过荧光素酶报告基因法分析miR-449a对HDAC1的靶向调控作用。通过Western blot分析miR-449a和HDAC1表达水平对A549细胞增殖及EMT相关分子表达水平的影响。建立裸鼠皮下瘤模型分析miR-449a和HDAC1对A549细胞体内增殖的影响。结果:miR-449a在MRC-5细胞中表达水平显著高于A549(P<0.0001)和HCC827(P<0.01);HDAC1在MRC-5细胞中表达水平显著低于A549(P<0.0001)和HCC827(P<0.01)。CCK-8法检测显示在A549细胞中转染miR-449a能够显著抑制其增殖。Transwell法检测显示在A549细胞中转染miR-449a能够显著抑制其侵袭和迁移(P<0.0001)。生物信息学预测显示miR-449a能够靶向结合HDAC1的3'-UTR;双荧光素酶报告基因分析显示,miR-449a能够靶向作用于HDAC1的3'-UTR抑制萤光素酶表达,Real-time PCR的结果表明过表达miR-449a能够显著抑制HDAC1的表达。在A549细胞中转染miR-449a或针对HDAC1小干扰RNA(siRNA)均能够下调HDAC1的表达,抑制细胞体内、外增殖;同时E-cadherin和ZO-1的表达水平下降,而N-cadherin、Fibronectin和Vimentin的表达水平增加。结论:miR-449a通过靶向抑制HDAC1的表达,抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。