p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的 构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法 采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果 通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重...     

一种靶向HER2嵌合抗原受体CAR THP-1细胞系的构建

目的 获得稳定转染靶向人类表皮生长因子2(HER2)的嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)。方法 构建靶向HER2的CAR慢病毒载体并感染人单核细胞白血病细胞系(THP-1)。通过分选流式细胞仪分选出含有绿色荧光标记的CAR THP-1细胞并在体外继续培养。将此靶向HER2的CAR THP-1细胞与HER2表达阴性(-)及阳性(+)的子宫内膜癌细胞系Ishikawa分别共培养，通过成像流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬，通过流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬比例。结果 CAR慢病毒感染THP-1细胞效率较低；与癌细胞共培养后，流式细胞术及成像流式细胞术结果显示，CAR THP-1组与空载体组相比，CAR THP-1细胞对HER2阳性的Ishikawa细胞吞噬能力增强(P<0.01)。结论 通过构建CAR慢病毒载体并转染THP-1细胞，成功建立了靶向HER2的CAR THP-1细胞系，且其能通过特异性靶向吞噬HER2阳性Ishikawa细胞。     

FNDC5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染THP-1细胞系

目的：构建过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5, FNDC5）基因的慢病毒载体,获得稳定转染FNDC5的THP-1细胞系。方法：PCR扩增目的基因FNDC5,将目的基因构建入pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro慢病毒载体中,在DH5α感受态细胞中进行扩增,测序及鉴定合格后利用四质粒包装系统转染293T细胞,包装成过表达慢病毒颗粒并测定病毒滴度。Western blot检测重组慢病毒中FNDC5的表达情况后,将获得的重组慢病毒转染THP-1细胞系,荧光显微镜观察并计算其转染效率。经嘌呤霉素筛选建立FNDC5过表达的稳转细胞系后,将细胞分为3组,分别为空白组、空载组和FNDC5组,用Western blot及RT-PCR检测其FNDC5的表达情况。通过油红O染色后观察FNDC5过表达对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的影响。结果：PCR产物鉴定及测序结果显示成功构建FNDC5过表达慢病毒载体;转染293T细胞后可检测到绿色荧光,Western blot检测FNDC5-Flag标签有表达,包装后病毒的滴度为1.32×109 TU/mL;Western blot及RT-PCR检测重组慢病毒转染THP-1细胞系,与空载组对比,FNDC5组中FNDC5蛋白表达明显增加[（238.0±24.9）％],有统计学意义（P=0.000）;与空载组对比,FNDC5组中FNDC5 mRNA表达水平明显增加[（228.5±3.4）％],有统计学意义（P=0.000）。FNDC5过表达转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中的脂质蓄积减少。结论：本实验成功构建了FNDC5基因的过表达慢病毒载体,通过FNDC5过表达慢病毒感染建立了FNDC5稳转的THP-1细胞系,证明FNDC5可明显减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的脂质蓄积,为后续研究奠定基础。     

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定.方法:针对筛选确定的人STUB1 基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I 和EcoR I 酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA 慢病毒载体.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒.结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒.结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体.     

膀胱癌组织JARID1B表达及其慢病毒表达载体的构建及功能研究

目的 研究膀胱癌组织及人膀胱癌细胞株T24中组蛋白去甲基化酶JARID1B的表达.构建JARID1B慢病毒表达载体并进行相关鉴定;观察经包装后慢病毒感染的T24中JARID1B表达情况.方法 Western blotting检测T24和6例膀胱癌及其癌旁组织JARID1B蛋白表达.利用真核表达质粒pcDNA3.1(-)-JARID1B,将JARID1B基因连接入含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒表达载体pLv-EGFP中,构建重组慢病毒表达载体pLv-EGFP-JARID1B,将经酶切和DNA测序鉴定的重组质粒通过脂质体转染至T24,荧光显微镜观察GFP表达,RT-PCT检测JARID1B mRNA表达.包装慢病毒并感染T24,Western blotting检测目的 蛋白JARID1B表达.结果 膀胱癌及其癌旁组织JARID1B蛋白表达阳性率分别为16.7%和66.7%,且前者表达强度较弱;T24 JARID1B蛋白表达阴性.重组质粒经酶切和DNA测序证实目的基因插入正确;pLv-EGFP-JARID1B转染T24,荧光显微镜观察发现细胞表达GFP,RT-PCR显示T24表达JARID1B mRNA.包装慢病毒再感染T24后Western blotting分析显示,细胞表达目的蛋白JARID1B.结论 膀胱癌组织JARID1B表达下调.成功构建JARID1B慢病毒表达载体,包装慢病毒感染T24后细胞过表达JARID1B.     

人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

目的克隆人NESG1基因,构建与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体pGC-FU-NESG1-EGFP,包装慢病毒,感染293FT细胞并进行鉴定。方法以NESG1全长克隆为模板扩增其编码框序列,通过限制性内切酶AgeI酶切、T4 DNA连接酶连接,将NESG1插入慢病毒载体pGC-FU-EGFP,构建pGC-FU-NESG1-EGFP重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系293FT,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293FT细胞,荧光显微镜下观察感染效率,Western blot方法检测NESG1-EGFP融合蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pGC-FU-NESG1-EGFP,三质粒共转染293FT细胞后可见大量绿色荧光;浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293FT细胞,感染效率在90%以上。Western blot证实细胞表达NESG1。结论成功构建NESG1慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染鼻咽癌细胞,探索其在鼻咽癌发生和发展中的作用奠定了基础。     

Osteopontin特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及其在U251胶质瘤细胞中OPN的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)对人胶质瘤细胞U251骨桥蛋白(osteopon-tin,OPN)表达的影响,为后续的以OPN基因为靶点的神经胶质瘤基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出2条针对OPN基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建2个重组慢病毒表达载体LV-OPNshRNA1,LV-OPNshRNA2;将连接产物转化到DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-OPNshRNA,pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的2种重组慢病毒分别感染U251细胞,实时定量PCR和Western印迹检测U251细胞OPN mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:2个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×1010TU/L和5×1010TU/L.感染U251细胞后,OPN基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降.结论:成功构建针对OPN基因的2个慢病毒载体OPN...     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞增殖诱导配体的表达

目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)表达的影响,为后续的以APRIL基因为靶点的胰腺癌基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出3条针对APRIL基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建3个重组慢病毒表达载体LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2、LV-APRIL shRNA3;将连接产物转化到DH5 α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-APRIL shRNA、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的3种重组慢病毒分别感染CFPAC-1细胞,实时定量PCR和Western印迹检测CFPAC-1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:3个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107 TU/ml.感染CFPAC-1细胞后,APRIL基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(P＜0.05),其中LV-APRIL shRNA1、LV-APRIL shRNA2作用较明显,使mRNA表达分别下降73%和68%,蛋白表达分别下降66%和59%(P＜0.05);而未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无统计学差异.结论:成功构建针对APRIL基因的3个慢病毒载体LV-APRILshRNA,体外感染CFPAC-1细胞后可有效抑制APRIL基因和蛋白的表达.     

双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

目的：构建携带人双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1,DUSP-1)基因的过表达慢病毒载体并包装病毒,感染人肾癌细胞株A498后观察DUSP-1的过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭能力的影响。方法从pCMV6-XL5-DUSP-1质粒上获得目的基因片段,采用DNA重组技术将DUSP-1基因插入到慢病毒表达载体质粒Plv-EGFP(2A)Puro中,获得重组plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1载体。重组慢病毒表达质粒及辅助包装质粒pH1、pH2共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒上清并感染肾癌细胞株A498,利用Western blot检测细胞DUSP-1蛋白的表达情况。用MTS法检测细胞增殖能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果成功构建携带DUSP-1过表达载体。包装病毒后成功感染A498细胞株,DUSP-1蛋白表达较对照A498细胞株显著上调。重组质粒组细胞在490 nm吸光值明显上升(P＜0.05);细胞侵袭试验中,重组质粒组的穿膜细胞数明显高于空载体组(P＜0.05)。结论成功构建了人DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1,进行病毒包装后成功培养稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株;DUSP-1基因的过表达具有促进肾癌细胞株A498增殖和侵袭的作用。     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的：构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数（MOI）为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果：PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10⁸ TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%（t=11.44,P=0.0076）。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%（t=6.374,P=0.0078）。结论：成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平明显降低。     

CPLX2在30例肝癌组织的表达及其对体外细胞增殖与侵袭的影响

目的 检测人复合素2(CPLX2)在肝癌组织中的表达,探讨其对肝癌细胞增殖与侵袭的影响。 方法 采用RT-qPCR和Western blotting方法检测30例配对肝癌组织和癌旁组织中CPLX2 mRNA和蛋白水平的表达。利用Lipofectamine 2000转染两条CPLX2小分子干扰RNA(siRNA)至肝癌Huh7细胞,RT-qPCR和Western blotting方法验证转染后的干扰效率。细胞实验分4组:空白组、对照siRNA组,CPLX2 siRNA1组和CPLX2 siRNA2组。噻唑蓝(MTT)法和Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力。采用成组t检验分析siRNA干扰效果和细胞侵袭能力的差异,双因素方差分析法两两多重比较各组细胞增殖能力的差异。 结果 CPLX2在肝癌组织(22.69±14.78)中的表达高于癌旁组织(4.03±2.65),差异有统计学意义(t=5.941, P<0.001)。CPLX2 mRNA在两siRNA干扰组的表达量分别为0.34±0.02和0.48±0.01,均低于对照siRNA组(0.88±0.02)和空白组(1.00±0.05),差异有统计学意义(P<0.001),mRNA和蛋白水平均显示siRNA干扰效果较好。MTT实验证实CPLX2两siRNA干扰组的细胞增殖能力低于对照siRNA组(P<0.001)和空白组(P<0.001)。Transwell migration实验显示每个检测视野CPLX2 siRNA1组细胞的穿膜细胞数(37.0±2.0)和CPLX2 siRNA2组细胞的穿膜细胞数(46.3±2.5)低于空白组(88.0±2.0)和对照siRNA组(77.0±4.4)。Transwell invasion实验结果显示,每个检测视野CPLX2 siRNA1组细胞的穿膜细胞数(29.7±2.5)和CPLX2 siRNA2组细胞的穿膜细胞数(41.0±2.6)低于与空白组(74.7±3.1)和对照siRNA组(68.7±1.5),差异有统计学意义(P<0.001)。 结论 CPLX2在肝癌组织中表达升高,下调其表达可抑制肝癌细胞Huh7的增殖和侵袭,CPLX2可能在促进肝癌的发生发展过程发挥重要作用。     

CHA2DS2-VASc评分对心源性短暂性脑缺血发作鉴别诊断价值的研究

目的 探讨CHA₂DS₂-VASc评分及ABCD2评分对心源性短暂性脑缺血发作(TIA)的鉴别诊断价值。方法 回顾经临床诊断为心源性TIA和非心源性TIA的60例患者的临床资料及ABCD2、CHA₂DS₂-VASc评分结果,进行对比分析。结果 两组性别、年龄、伴发病及持续时间、临床症状、既往卒中病史等基线特征未发现明显差异,CHA₂DS₂-VASc评分有显著差异(t=2.70, P<0.05),CHA₂DS₂-VASc评分诊断心源性TIA ROC曲线下面积为0.682(95%CI:0.526～0.837,P<0.05)。结论 CHA₂DS₂-VASc评分在临床TIA的实际管理中能够作为参考指标帮助鉴别心源性TIA的可能,从而指导及早院内干预。     

利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株实验研究

目的　利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株,为探讨Nfe2l2基因在结缔组织成纤维细胞细胞外基质（ECM）重构中的作用奠定实验基础。方法　2014年12月—2015年5月,通过双酶切将Nfe2l2目的基因连接到GV341载体（Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin）,经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提,将携带目的基因的工具GV341载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞,完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-Nfe2l2,病毒感染L929细胞72 h后筛选稳定表达的细胞株L929/LV-Nfe2l2,采用Real-time qPCR测定Nfe2l2的表达。结果　经比对,构建的LV-Nfe2l2阳性克隆序列与目的基因Nfe2l2相符;L929细胞达到80%感染效率的最佳感染条件为：在ENi.S培养基中进行感染,设定感染复数（MOI）为8~10,感染时间为72 h。Real-time qPCR结果显示,经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞中Nfe2l2基因表达丰度为高（ΔCt值≤12）。结论　本研究成功构建了一种过表达Nfe2l2基因的慢病毒载体;LV-Nfe2l2感染L929细胞后可实现目的基因的高表达,经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞株可用于后续实验研究。     

静脉盐负荷对高血压盐敏感者肾脏PGI2及TXA2的影响及盐敏感性高血压的胰岛素抵抗

目的 观察急性静脉盐水负荷对高血压盐敏感者肾脏PGI₂及TXA₂的影响及盐敏感性高血压的胰岛素抵抗情况。方法 测定53例已确定盐敏感性的高血压患者急性盐水负荷前后24h尿6-酮PGF₁α及TXB₂的排泄量,并在受试者中进行葡萄糖耐量及胰岛素释放试验。结果 静脉盐水负荷后,盐敏感者24h尿6-酮PGF₁α的排泄量明显较盐不敏感者为低[(316±57)vs(371±68)pg/min,P<0.01],负荷后的减少幅度前者明显高于后者[(197±99)vs(136±101)pg/min,P<0.01]。而盐负荷后盐敏感者尿TXB₂的排泄量及负荷后的增加幅度均明显较盐不敏感者为高[(394±32)vs(359±44)pg/min,P<0.01;(80±47)vs(47±45)pg/min,P<0.01]。盐敏感者空腹及糖负荷后各时点血糖、血胰岛素水平均显著高于盐不敏感者(P<0.05),而胰岛素敏感性指数则明显低于盐不敏感者(0.013±0.003vs0.018±0.004,P<0.01)。结论 急性静脉盐水负荷对高血压盐敏感及盐不敏感者肾脏PGI₂及TXA₂代谢的影响有明显差异,使高血压盐敏感者肾源性PGI₂减少而TXA₂增加,此异常可能与盐敏感性高血压的发病有关;盐敏感者胰岛素抗性较盐不敏感者高。     

蒿鳖养阴软坚方通过Nrf2/γ-GCS信号转导通路抑制酒精性肝纤维化作用及其机制

目的:研究不同提取方案的蒿鳖养阴软坚方对肝纤维化大鼠肝组织中Nrf2/γ-GCS信号转导通路的影响,探讨不同提取方案的蒿鳖养阴软坚方对大鼠肝纤维化的治疗作用。方法:健康Wistar 大鼠随机分为8组:正常组、模型对照组、先水后醇60%提取方案组(0.09 mg.kg^-1.d^-1)、先水后醇95%提取方案中、高剂量组(2.59 g.kg^-1.d^-1、8.2 g.kg^-1.d^-1)、水提醇沉中、高剂量组(2.59 g.kg^-1.d^-1、8.2 g.kg^-1.d^-1)及复方鳖甲软肝片组(0.09 mg.kg^-1.d^-1),每组10只大鼠。酒精性肝纤维化大鼠模型制备成功后,各组按相应药物剂量分别开始治疗,正常组和模型组给予同体积蒸馏水,每日1 次,造模10周后处死大鼠,留取标本。酸水解法测定肝组织中胶原蛋白含量; Western blotting 检测肝组织Nrf2蛋白与γ-GCS蛋白的表达;光镜观察肝组织免疫组化染色结果。结果:(1) 肝组织中羟脯氨酸含量:与正常组比较,模型组大鼠肝组织胶原蛋白含量增高 (P<0.01);与模型组比较,先水后醇60%提取方案组、先水后醇中、高剂量组以及复方鳖甲软肝片组大鼠肝组织胶原含量均降低 (P<0.05)。(2) 肝组织Nrf2蛋白与γ-GCS蛋白的表达:与正常组比较,模型组大鼠肝组织Nrf2蛋白与γ-GCS蛋白表达增高 (P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠肝组织Nrf2蛋白与γ-GCS蛋白表达增高 (P<0.01)。(3) 肝组织免疫组化染色结果: 模型组的Nrf2和γ-GCS蛋白主要在细胞浆中表达,各用药组Nrf2和γ-GCS蛋白均多数在细胞浆和细胞核中表达,汇管区附近也有所表达,但表达量不及胞浆和胞核。结论:提取工艺优化后的蒿鳖养阴软坚方可能通过上调肝组织Nrf2/γ-GCS信号转导通路,增加Nrf2蛋白和γ-GCS蛋白的表达,降低大鼠肝组织肝纤维化程度从而发挥抗肝纤维化的作用。     

B7-H3基因敲降ES-2细胞系构建及其对细胞增生的影响

目的 构建B7同系物3(B7 homolog 3,B7-H3)敲降的ES-2细胞系并探究B7-H3基因对ES-2细胞系增生的影响。方法 利用慢病毒介导的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术在ES-2细胞中敲降B7-H3,利用荧光显微观察、实时荧光定量PCR 技术(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)及流式细胞术验证B7-H3敲降效果,并利用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检验细胞活性改变。结果 感染不同的shRNA,可呈现不同程度的B7-H3降低,CCK-8检测结果显示,敲除B7-H3后细胞增生速率明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 使用慢病毒介导的shRNA干扰技术能成功构建B7-H3敲降的ES-2细胞系,B7-H3敲降后ES-2细胞增生速率显著降低。     

过表达ODC抑制氧化应激诱导大鼠心肌细胞凋亡的研究

目的构建过表达鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因慢病毒载体,并研究其对氧化应激诱导大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠ODC基因pHIV-ODC过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其侵染效率;包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞;72 h后观察其侵染效率,RT-PCR法检测细胞ODC mRNA的表达,利用CCK-8、Hochest33258染色检测ODC对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果酶切及测序鉴定ODC序列正确插入慢病毒过表达载体。侵染H9C2细胞72 h后ODC mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高。过表达ODC能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较差异均有统计学意义(P<0.001)。结论成功构建的过表达ODC慢病毒,上调H9C2细胞中ODC的表达,过表达ODC能显著抑制氧化应激诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1S248A突变体通过增加ATP6V0C表达促进前列腺癌的侵袭

目的: 探讨LASS2/TMSG1及其突变体在前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的分子作用机制。方法: 构建表达LASS2/TMSG1全长及其4个突变体的pcDNA3真核表达载体,并稳定转染到高转移潜能前列腺癌PC-3M-1E8细胞系中;采用qPCR和Western blot法鉴定稳定转染效果,并分析不同点突变体对LASS2/TMSG1和ATP6V0C表达量的影响;采用生长曲线测定、四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入实验、软琼脂集落形成实验、细胞划痕修复实验、Matrigel穿膜侵袭实验和流式细胞术研究LASS2/TMSG1及其4个点突变体的细胞生物学功能,并通过免疫双重荧光染色分析LASS2/TMSG1不同突变体和ATP6V0C的相互作用情况。结果: qPCR和Western blot检测显示LASS2/TMSG1 S248A组较LASS2/TMSG1野生型组ATP6V0C表达增加了3倍(P<0.05), 且免疫双重荧光染色结果显示LASS2/TMSG1 S248A组ATP6V0C表达明显增加;与LASS2/TMSG1野生型组相比,LASS2/TMSG1 S248A组的细胞增殖能力、锚着不依赖生长能力、细胞迁移能力 (细胞迁移率从35.3%±3.2%增加到70.3%±3%)和侵袭能力(穿膜细胞数从50.0±3.2增加到203.0±6.5)明显提高(P<0.05), G0/G1期比例增加(从51.0%增加到85.4%,P<0.05),但细胞凋亡率亦明显升高(从7%增加到15.1%,P<0.05)。结论: LASS2 /TMSG1第248位丝氨酸突变为丙氨酸后(S248A)能促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,其分子机制可能是LASS2/TMSG S248A使ATP6V0C表达量增加,进而促进前列腺癌的侵袭,提示LASS2/TMSG1蛋白第248位丝氨酸是抑制前列腺癌侵袭的重要功能位点。     

c-met慢病毒载体的构建及稳定转染骨髓间充质干细胞

构建肝细胞生长因子受体(c-met)慢病毒载体,并稳定转染骨髓间充质干细胞(BMSCs).将c-met连接到慢病毒载体GV358上,重组获得慢病毒载体GV358-c-met.再将该重组体与病毒辅助质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒并测定其滴度为2×108 TU/ml.将此慢病毒转染BMSCs,经嘌呤霉素筛药后,荧光显微镜下检测荧光阳性率达100%,且Western blot证实该细胞株表达c-met蛋白.成功构建了c-met慢病毒载体,并建立了稳定表达c-met的BMSCs.