人胚神经干细胞的培养与基因修饰后体内的表达

目的 分离培养人胚神经干细胞(human neural stem cells, hNSCs),建立人胚神经干细胞株;体外通过逆转录病毒转染人胚神经干细胞,观察其生物学特性及在脊髓损伤(spinal cord Injury,SCI)模型体内的表达.方法 分离孕10～20周(平均13周)人胚脑皮层来源的神经干细胞并连续传代培养,通过克隆试验、免疫组织化学等方法检测其生长特性与增殖能力;用构建了增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的逆转录病毒转染神经干细胞并检测其生物学特性;制备兔T9全横断脊髓损伤模型,观察携带EGFP基因的人胚神经干细胞在体内的表达情况.结果 从胎龄10～20周的人胚脑皮层中成功分离出人胚神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力及多分化潜能,能表达干细胞及分化细胞的特异性抗原;逆转录病毒转染后,仍然保持未分化状态并能自我更新形成新的神经球;移植入兔脊髓损伤模型后,可在体内存活较长时间,高效表达转基因蛋白.结论 人胚脑皮层中存在能连续传代培养的神经干细胞,转基因及移植入体内后能高效表达目的基因蛋白并保留干细胞的基本属性,发挥治疗作用.     

人胚神经干细胞的长期培养与基因修饰

目的 通过逆转录病毒将增强绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因转染人胚神经干细胞,观察其生物学特性与体内表达情况.方法 分离孕10～20周人胚脑皮层来源的神经干细胞并连续传代培养,通过克隆试验、免疫组织化学等方法检测其生长特性及增殖能力;使用构建了EGFP基因的逆转录病毒转染神经干细胞并检测其生物学特性;制备兔T9全横断脊髓损伤模型,观察携带EGFP基因的人胚神经干细胞在体内的表达情况.结果 从胎龄10～20周的人胚脑皮层中成功分离出人胚神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力及多分化潜能,表达干细胞及分化细胞的特异性抗原.转染EGFP基因后,仍保持未分化状态,能够自我更新形成新的神经球;移植入兔脊髓损伤模型后,仍高效表达转染基因蛋白,并在体内发生增殖、迁移.结论 人胚脑皮层中存在能长期传代培养的神经干细胞;转染EGFP基因后仍保留神经干细胞的基本特性;移植人体内能持续、高效表达EGFP,有利于观察其存活、迁移情况,并为功能基因修饰与移植研究提供了方法.     

海马神经干细胞的分化特征及鉴定

目的从新生SD大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞.方法分离新生SD大鼠海马组织,经机械吹打后,加入含有20 ng/mL的b-FGF以及B27的DMEM/F12无血清培养基悬浮培养具有自我更新和多向分化能力的细胞群,7 d后将一部分细胞固定并采用免疫细胞化学技术检测这些细胞中神经上皮干细胞巢蛋白(Nestin)的表达;另一部分细胞加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基使其贴壁分化生长7 d后固定并检测特异性成熟神经元抗原Tuj1以及星形胶质细胞抗原GFAP,少突胶质细胞抗原Galc的表达.结果从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达神经上皮干细胞特异性巢蛋白,它们分化成熟后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.结论从新生SD大鼠海马分离出具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞群,它们有很强的分裂、增殖能力,是中枢神经系统的干细胞.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养

目的探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法分离新生SD大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入试验,免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化,分别用神经元特异性核抗原(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。     

大鼠海马神经干细胞的分离培养与免疫荧光鉴定

目的分离培养新生SD大鼠神经干细胞,并对其生物学特性进行鉴定。方法采用无血清培养联合应用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对大鼠海马神经干细胞分离培养,采用免疫荧光的方法检测神经干细胞的nestin抗原。结果从新生大鼠海马齿状回分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球,并且呈nestin阳性表达,具有多向分化能力。结论分离培养的细胞是中枢神经系统的干细胞。     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养和鉴定

目的建立神经千细胞分离、培养方法。方法从新生大鼠海马组织分离神经干细胞，进行体外培养、传代，应用免疫荧光细胞化学方法观察鉴定神经干细胞和分化后神经细胞抗原的表达。结果从海马组织中分离出的神经千细胞具有增殖能力，可进行传代培养，获得的细胞克隆表达Nestin阳性，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。绪论分离堵养的细胞具有自我更新、增殖和多分化潜能，是神经干细胞。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及其鉴定

目的:通过培养了解神经干细胞(neural stem cell,NSC)生物学特性,为深入研究其体内外分化奠定基础.方法:分离培养大鼠胎脑NSC.通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力、增殖能力和生物学特性;免疫细胞化学检测NSC特征性标志nestin表达和分化能力;BrdU掺入实验检测细胞增殖状态;并比较EGF、bFGF对鼠NSC增殖刺激作用.结果:体外传代培养获得的NSC具有多向分化能力、很强的自我更新能力、表达nestin;NSC扩增迅速;传代培养的NSC性能稳定;联合运用EGF、bFGF对NSC增殖作用较单用强.结论:成功培养扩增了大鼠NSC;EGF、FGF联合作用能促进大鼠NSC增殖.     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法，探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞，并用EGF和血清诱导其分化，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成，但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞，细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化

目的构建LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化技术平台,为进行体内移植携带报告基因的神经干细胞研究奠定基础.方法利用无血清培养基,分离并体外培养LaZ转基因胚胎小鼠腹侧中脑神经干细胞,连续稳定传代20代后,以免疫荧光、免疫细胞化学法及组织化学方法检测神经球Nestin和分化后细胞中神经纤维（NF）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、Galc和半乳糖苷酶（X-Gal）的表达.结果从LaZ转基因小鼠腹侧中脑分离的细胞群具有连续形成神经球的能力,其Nestin表达阳性.分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.所有细胞半乳糖苷酶组织化学均为阳性.结论LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞可稳定扩增,具有多向分化潜能,分化后细胞携带LaZ报告基因,可用于进一步的移植实验研究.     

人类神经干细胞的长期培养和传代

【目的】探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。【方法】采用机械方法从胎脑中分离神经细胞 ,应用N2培养基进行培养 ,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)刺激细胞扩增 ;传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养 ;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。【结果】从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞 ,培养条件下呈悬浮状态生长 ,形成神经球 ,绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物 ;这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞 ,早期的培养有少量的少突胶质细胞 ;在这种培养条件下 ,神经干细胞生长速度较慢 ,而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系 ,神经干细胞可获得较大的扩增速度。【结论】体外的培养条件下 ,可从胎脑组织中培养出神经干细胞 ,它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及分化研究

目的:研究大鼠胚胎神经干细胞体外分离、培养的条件及增殖、分化特性。方法:取胎龄15~17 d的SD大鼠胎脑海马及室周组织,在含碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF),表皮生长因子(EGF),B27、N2添加剂的无血清培养基中培养,用有限稀释法进行克隆、传代,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞克隆球及诱导分化后的细胞。结果:大鼠胎脑能在体外培养获得大量神经干细胞,并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:胚胎脑组织有丰富的神经干细胞,可在体外长期培养并保持干细胞特性,能分化为神经元、胶质细胞等终末细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞培养方法的比较

用多种方法培养大鼠胚胎神经干细胞并诱导其分化 ,应用相差显微镜和免疫荧光染色方法对其进行观察和比较。发现在培养液中同时加入bFGF和EGF ,并采用较高的细胞种植密度 ,干细胞增生速度最快。提示 2种神经生长因子对加快干细胞的增生具有协同作用 ,适当提高干细胞的种植密度可加快其增生速度     

胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞的培养及鉴定

目的:探讨胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞(neural stem cell,NSCs)的分离、培养、传代及鉴定的方法。方法:分离E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织,用机械吹打方法形成细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(ep i-derm al growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(fibrob last growth factor-basic,bFGF)、B27(B27 sup lem ent)的DMEM/F12(1∶1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球,并且进行B rdu和Nestin检测;然后取培养细胞诱导分化后行GFAP,NeuN,TH检测。结果:E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织细胞培养两周后可以形成较多的悬浮生长的神经球,经单细胞克隆和传代扩增后得到大量的同源细胞克隆球。经过B rdu和Nestin的免疫细胞化学检测90%以上的细胞呈阳性;诱导分化后细胞呈GFAP,NeuN阳性,少量细胞呈TH阳性。结论:从E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力,是胚胎大鼠中枢神经系统的NSCs,并可以分化为TH阳性神经元。     

组织块法体外培养人胚胎神经干细胞

目的：探讨体外分离、培养人胚胎脑组织神经干细胞的实用方法。方法：从人胚胎脑额叶皮层分离组织块，采用DMEM／F12＋N2无血清培养基，进行体外培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化后的其他细胞表型。结果：从人胚胎脑额叶皮层分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞中大部分为Nestin表达阳性的细胞。诱导分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论：用上述方法分离培养的细胞具有神经干细胞的特性，并表达Nestin蛋白，认为是神经干细胞。此方法是一种具有实用价值的体外培养人胚胎脑神经干细胞的技术。     

EDS对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的观察在不同剂量蜕皮甾酮（ecdysterone,EDS）作用下,体外培养的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖、分化情况。方法原代培养新生SD大鼠海马NSCs,经EDS处理后,传代细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑盐比色法观察神经干细胞增殖能力的变化,免疫荧光细胞染色技术、流式细胞术检测神经干细胞分化情况。结果与对照组相比,中低剂量组（50、100、200mg／L）,对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的EDS（400mg／L及800mg／L）干预组则明显抑制了NSCs的增殖。在分化条件下,EDS200mg／L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,其余各组无统计学差异。结论EDS能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。     

表皮生长因子促进胚胎神经干细胞生长分化的研究

目的:观察表皮生长因子EGF对胚胎神经干细胞生长分化的影响。方法:从孕11d大鼠胚胎神经管分离神经干细胞,分为EGF组和对照组,进行体外培养。观察神经干细胞的生长,显微测量细胞突起长度,在第3、7天用免疫组化方法检测细胞神经元特异烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,并观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果:加入EGF后,细胞生长旺盛,细胞突起长度明显高于对照组;免疫组化染色结果显示,培养3、7d时,NSE、GFAP阳性细胞数均明显多于对照组。结论:EGF既能促进胚胎神经干细胞的生长,也可促其分化为神经元及神经胶质细胞。