白藜芦醇减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤并抑制TLR4/NF-κB活化

目的:探究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜细胞(hPDLCs)损伤的保护作用.方法:体外培养并鉴定hPDLCs,将培养的hPDLCs随机分为5组:对照组、LPS(10 μg/ml)+RES(0、30、60、90tμmol/L)组,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测各组细胞分泌TNF-α/IL-6水平,PCR和Western blot检测各组细胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达.结果:分离培养的hPDLCs抗波丝蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性.与对照组比,LPS处理后细胞增殖能力明显降低,细胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达明显增加;30～90 μmol/L白藜芦醇预处理后,细胞增殖能力增加(P＜0.05),细胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表达则下调(P＜0.05),均呈现一定的浓度依赖性.结论:白藜芦醇可抑制TLR4/NF-κB活化并减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤.     

人牙周韧带细胞膜片的体外实验研究

目的 观察体外培养人牙周韧带细胞(hPDLCs)的成骨、成脂能力;构建hPDLCs膜片并鉴定膜片细胞外基质的主要结构蛋白.方法 通过酶联组织块法分离并纯化培养hPDLCs;免疫细胞化学法鉴定hPDLCs来源及干细胞标志物STRO-1表达情况;取第2～4代细胞分别用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养,茜素红及油红O染色检测hPDLCs的成骨、成脂能力;制备成熟的hPDLCs膜片,苏木素-伊红(HE)及免疫组织化学染色法鉴定膜片细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白的表达情况.结果 经原代培养的hPDLCs抗波形蛋白染色阳性,干细胞标志物STRO-1染色阳性,证实hPDLCs来源于间充质并具有干细胞潜在分化能力;hPDLCs在诱导成骨、成脂分化培养14～16 d后,茜素红及油红O染色结果阳性提示hPDLCs具有良好的成骨及成脂分化能力;HE染色及免疫化学染色发现hPDLCs膜片高表达细胞外基质主要结构蛋白Ⅰ型胶原、层黏蛋白及纤连蛋白.结论 本研究从细胞分离培养,来源鉴定、多向分化潜能诱导及细胞膜片技术等方面证实PDLCs中存在成体干细胞,提示hPDLCs膜片能为牙周组织再生种子细胞提供新来源,可进一步深入研究.     

FHL2蛋白在人牙周膜细胞体外矿化过程中的表达

目的 探讨胞内信号转导分子FHL2蛋白在人牙周膜细胞(hPDLCs)体外矿化过程中的表达.方法 体外培养hPDLCs,实验组用矿化诱导液培养,对照组不加诱导液.培养0、14、28 d后,茜素红染色检测矿化结节的形成;免疫细胞化学法检测hPDLcs矿化诱导0、14d时FHL2蛋白的表达;同时采用半定量RT-PCR方法检测...     

MiR-34a在牙周膜细胞成骨向分化中的作用

目的:探讨微小RNA-34a在牙周膜细胞成骨向分化中的作用。方法:体外分离培养人牙周膜细胞(hPDLCs),取第3~6代用于实验。首先,对hPDLCs进行成骨诱导液处理,在3、7、14 d后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-34a基因的表达变化。然后,构建慢病毒载体pCDH-pre-miR-34a和pCDH,将慢病毒载体感染hPDLCs,构建pre-miR-34a过表达细胞模型(hPDLCs/34a)和空载体对照细胞模型(hPDLCs/pCDH),并诱导hPDLCs成骨分化3、7、14和21 d。分析成骨标志基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)及骨涎蛋白(BSP)表达变化,ALP活性及钙化结节形成的茜素红染色情况。结果:hPDLCs经成骨分化诱导后, miR-34a基因表达在第3天开始明显升高,并呈逐渐增高趋势,差异均有统计学意义(P<0.001)。与hPDLCs/pCDH组相比,hPDLCs/34a组的ALP活性和茜素红染色均有明显减弱。qRT-PCR结果显示:hPDLCs/34a组的ALP表达量在成骨诱导7 d时较hPDLCs/pCDH组降低(P<0.05);Runx2、OCN及BSP表达量的差异在各时间点基本无统计学意义。结论:在体外条件下,miR-34a抑制人牙周膜细胞成骨向分化。     

孕酮对人牙周膜细胞增殖及成骨分化的调控作用

目的：通过细胞免疫组织化学方法检测人牙周膜细胞（hPDLCs）中孕激素受体（PR）的表达,研究孕酮在hPDLCs增殖及成骨分化过程中的作用。方法：原代培养hPDLCs,取第4～6代细胞用于实验。分为空白对照组,孕酮组,抑制剂组。用含有不同浓度（1,10,100 nM）孕酮的培养液培养hPDLCs 1,2,3,4,5,6,7 d,采用MTT法检测在孕酮作用下hPDLCs生长曲线的变化情况。检测普通培养液和成骨诱导培养液中的各组细胞在孕酮作用后茜素红染色钙化结节面积的变化。结果：PR在hPDLCs的胞质和胞核中均有表达,且在胞核的表达明显高于胞质。孕酮干预hPDLCs后,细胞的增殖高于对照组,孕激素受体抑制剂能明显抑制hPDLCs的生长。孕酮能够促进茜素红染色钙化结节的形成。在成骨诱导液中,孕酮同样有促进成骨的作用。与普通培养组相比较,孕酮对成骨诱导组的成骨促进作用更为明显。结论：人牙周膜细胞中有PR的表达,孕酮能够促进人牙周膜细胞的增殖和成骨分化。     

富血小板纤维蛋白提取液对经TNF-α刺激下人牙周膜细胞的影响

目的:检测富血小板纤维蛋白提取液(PRFe)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激下的人牙周膜细胞(hPDLCs)成骨分化能力的影响.方法:组织块法分离培养hPDLCs,免疫组化鉴定其来源;Choukroun法制取PRFe;实验分为空白对照组、TNF-α(10 ng/ml)组、PRFe组和PRFe+ TNF-α(10 ng/ml)组.碱性磷酸酶试剂盒检测ALP活性;茜素红染色观察细胞矿化功能;Western blotting检测Runx2、Osterix蛋白含量.结果:ALP活性检测、茜素红染色和Western blotting结果显示TNF-α组各项指标均低于空白对照组(P＜0.05),PRFe组各项指标均高于空白对照组(P＜0.05),PRFe+ TNF-α组各项指标均高于TNF-α组(P＜0.05),PRFe组各项指标均高于PRFe+ TNF-α组(P＜0.05).结论:PRFe可促进经TNF-α刺激的hPDLCs成骨分化.     

褪黑素对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的探讨褪黑素对人牙周膜细胞(hPDLCs)成骨分化能力的影响。方法原代培养法成功提取hPDLCs后,加入不同浓度的褪黑素作为实验组,空白对照组不加褪黑素。MTT法检测不同浓度褪黑素对细胞增殖的影响,相关试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)的活性和表达后,采用茜素红S染色、Real-time PCR和Western Blot分别研究褪黑素对hPDLCs的矿化结节、成骨相关mRNA以及蛋白表达的影响。结果与对照组相比,褪黑素组hPDLCs的增殖活力略有抑制,其中50μmol/L和100μmol/L褪黑素组抑制最为显著(P<0.01);褪黑素组均表现为ALP活性和表达上升,矿化结节形成增多且呈浓度依赖性(P<0.01);Real-time PCR和Western Blot结果显示褪黑素组成骨相关mRNA和蛋白表达均有上升(P<0.01)。结论褪黑素可促进hPDLCs的成骨分化,具有作为牙周再生治疗药物的潜能。     

柚皮苷对人牙周膜细胞功能调节的作用

目的:通过研究中药有效成分柚皮苷对人牙周膜细胞(hPDLCs)增殖、矿化成骨及骨保护素(OPG)表达的影响,探讨柚皮苷对人牙周膜细胞增殖及成骨功能的调节作用。方法:采用酶消化结合组织块法,体外原代培养hPDLCs,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、酶联免疫吸附法和半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,测定不同质量浓度(100、10、1.0、0.1、0.01mg/L)柚皮苷作用后,hPDLCs增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型胶原蛋白、OPG表达的变化,采用SPSS16.0统计包对数据进行统计学处理。结果:原代培养的hPDLCs形态良好,1.0mg/L浓度组的柚皮苷对hPDLCs增殖、ALP活性和Ⅰ型胶原蛋白表达的促进作用最强,此浓度柚皮苷对细胞OPG mRNA的调节作用在测定时段内呈时间依赖性。结论:柚皮苷有促进hPDLCs增殖及向成骨方向转化的作用。     

孕酮上调人牙周膜成纤维细胞中ALP的表达

目的:用碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性分析的方法,研究孕酮对人牙周膜成纤维细胞(hPDLCs)中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)表达的影响。方法:原代培养hPDLCs,取第4～6代细胞用于实验。分为空白对照组,孕酮组,抑制剂组。检测普通培养液和成骨诱导培养液中各组细胞在孕酮作用后ALP染色的变化。用碱性磷酸酶活性分析法检测不同浓度的孕酮对hPDLCs中ALP表达的影响。结果:孕酮能够促进hPDLCs中ALP染色阳性面积的表达,且能够提高hPDLCs中ALP的活性,具有时间及剂量依赖性,抑制剂组各指标减小。结论:孕酮能够上调hPDLCs中碱性磷酸酶的表达。     

黄芩苷对人牙周膜细胞功能活性调节的实验研究

目的：通过观察中药黄芩的有效成份黄芩苷对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）增殖、矿化成骨等功能活性的影响,研究黄芩对人牙周膜细胞的调节作用。方法：采用组织贴块联合胶原酶消化的方法,体外分离、培养、纯化和鉴定hPDLCs后,通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、酶联免疫吸附、半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等方法,检测不同浓度的黄芩苷（10、1.0、0.1、0.01mg/L）对hPDLCs增殖、矿化成骨、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、细胞核因子-κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）mRNA表达等方面的影响。结果：0.1mg/L的黄芩苷对于增加人牙周膜细胞的增殖活性、碱性磷酸酶活性和Ⅰ型胶原蛋白的表达作用最强;适宜浓度的黄芩苷可以降低RANKL/OPGmRNA比值。结论：黄芩苷能促进hPDLCs的增殖和成骨作用,该作用可能与RANKL/OPG信号通路相关。     

富血小板血浆对人牙周膜细胞增殖及分化的影响

目的:探索不同浓度富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对人牙周膜细胞体外增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响.方法:两步离心法制备PRP,用酶联免疫吸附法检测血浆、PRP、激活后PRP上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factors-β1,TGF-β1)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factorAB,PDGF-AB)的水平.分别用2%、5%、105、20%激活后的PRP作用于人牙周膜细胞,以DMEM培养液为阴性对照.在作用24h和72h后,用细胞计数试剂盒检测细胞增殖状况,以对硝基磷酸二钠为底物,检测细胞ALP的活性.用SPSS10.0软件包中的方差分析和配对t检验进行统计学分析.结果:激活后的PRP上清中,TGF-β1和PDGF-AB的水平均高于未经激活的PRP和血浆.各浓度PRP促细胞增殖和ALP活性的作用均显著强于阴性对照组(P＜0.001);各浓度PRP 72h时促细胞增殖和ALP活性的作用均高于24h时(P＜0.01);不同浓度PRP组问存在显著差异(P＜0.001),PRP浓度从2%渐增至10%时,细胞增殖和ALP活性随之增加;当PRP浓度达到20%时,促细胞增殖作用开始下降,而促ALP活性作用继续增强.结论:在1～3d内,PRP对人牙周膜细胞的体外增殖和ALP活性均有促进作用,并在一定范围内呈剂量依赖关系.     

MEPE基因沉默对人牙髓细胞增殖与成牙本质分化的作用研究

目的：研究细胞外基质磷酸化糖蛋白（Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein,MEPE）基因沉默对人牙髓细胞（Human Dental Pulp Cells,hDPCs）增殖和成牙本质分化能力的影响,探讨其在牙髓损伤修复中的功能.方法：酶消化组织块法分离培养hDPCs,以lipo2000介导siRNA-hMEPE转染hDPCs,以阴性对照组和未转染组设为对照,l、3、5、7d后,CCK-8法检测细胞增殖情况;转染hDPCs后以矿化诱导液培养5、7、10d后,实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）、牙本质涎磷蛋白（Dentin Sialophos-phoprotein,DSPP）、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、Collagen I mRNA表达水平.结果：CCK-8结果显示Si-h-MEPE转染hDPCsld后OD值下降,3d时到达最低值,且均低于未转染组与阴性对照组,3d时差异有统计学差异（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组中,OD值持续升高,7d时到达峰值,与各自组内其他时间点比较有统计学差异（P＜0.05）;ALP活性检测结果显示,Si-h-MEPE转染hDPCs3d细胞OD值最低,且明显低于未转染组与阴性对照组（P＜0.05）,未转染组与阴性对照组hDPCsOD值呈现逐渐升高趋势,在7d时达到最大值（P＜0.05）.Si-h-MEPE转染hDPCs3d时BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA的表达量均较未转染组与阴性对照组下调（P＜0.05）.在未转染组中,BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA水平持续升高,在7d时达最高值,与3d比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：MEPE基因瞬时沉默抑制hDPCs增殖、使BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ基因表达下调,ALP活性降低,与未转染组与阴性对照组比较结果提示MEPE可能通过调控hDPCs的增殖和成牙本质分化能力,在牙髓损伤修复中发挥重要作用.     

LMK-235对牙周膜细胞成骨和成牙本质分化的影响

目的：探讨Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶抑制剂LMK?235对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）早期成骨和成牙本质分化的影响。方法通过酶消化法获得hPDLCs,分别用浓度为0、50、100、250、500 nmol/L的LMK?235处理第三代hPDLCs 3 d。MTT法检测hPDLCs的增殖,同时qRT?PCR检测成骨及成牙本质相关因子Runx2、ALP及DMP?1 mRNA的表达水平。结果 MTT结果显示100 nmol/L的LMK?235对hPDLCs增殖具有促进作用。qRT?PCR结果表明100 nmol/L处理组Runx2 mRNA的表达水平为对照组的1.77倍（P＜0.05）;而ALP mRNA的表达水平在实验组均高于对照组（P＜0.05）,同时100 nmol/L处理组表达量最高;DMP?1 mRNA的表达水平在50 nmol/L及100 nmol/L组较对照组升高（P＜0.05）。结论浓度为100 nmol/L的Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶抑制剂LMK?235促进hPDLCs增殖,并通过上调Runx2、ALP、DMP?1等成骨及成牙本质相关因子mRNA表达来促进hPDLCs早期成骨及成牙本质分化。     

Leptin对人牙周膜细胞骨向分化作用的实验研究

目的探讨瘦素(leptin)对人牙周膜细胞增殖和骨向分化的作用。方法采用酶消化法体外培养人牙周膜细胞,用不同浓度梯度的leptin处理细胞,通过四唑盐(MTT)比色试验和碱性磷酸酶活性测试,检测leptin对细胞体外增殖分化的影响。将人牙周膜细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙材料作为复合体,植入BALBc免疫缺陷裸鼠,12周后采用组织学和免疫组化法检测裸鼠体内生成物。结果体外实验leptin对人牙周膜细胞增殖有明显抑制作用,但leptin能促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶的活性表达。体内试验中leptin可提高牙周膜细胞生成类骨质的能力。结论 leptin抑制牙周膜细胞的增殖活性,但可明显促进牙周膜细胞骨向分化。