表没食子儿茶素没食子酸酯对肝癌细胞端粒酶逆转录酶和c-myc基因表达的调控作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)作用肝癌细胞时端粒酶活性的变化、端粒酶逆转录酶(TERT)及cmyc基因表达的改变,以探讨EGCG对肝癌细胞端粒酶活性的调控机制。方法用聚合酶链反应免疫酶联吸附试验(PCR-ELISA)测定肝癌细胞端粒酶活性,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测肝癌细胞中人端粒酶逆转录酶(hTERT)和c-mycmRNA表达。结果在一定时间、一定剂量范围内,EGCG能抑制肝癌细胞端粒酶活性,随着浓度的增加和时间的延长,端粒酶活性逐渐下调;尤其当EGCG浓度超过50mg/L或作用时间超过36h时,端粒酶活性下调更明显,与对照组比较差异用统计学意义(P<0.01);EGCG能抑制肝癌细胞hTRETmRNA的表达,其下降趋势与端粒酶活性下降趋势基本一致,且下调幅度较端粒酶活性下降更明显,两者呈正相关(r=0.931,P<0.01);而EGCG对肝癌细胞cmycmRNA表达的抑制率比hTRETmRNA表达的抑制率更高,并且c-mycmRNA表达先受到抑制,与hTRETmRNA表达的抑制相关明显(r=0.907,P<0.01)。结论EGCG对c-myc的抑制作用可能导致hTERTmRNA的抑制并进一步下调端粒酶活性。     

反义人端粒酶逆转录酶基因转染对人胃癌细胞系的影响

目的探讨反义人端粒酶(hTERT)基因治疗的可行性。方法构建hTERT基因的反义表达载体,经脂质体介导转染人未分化胃癌细胞系HGC-27,通过Southernblot检测外源反义基因的整合;RT-PCR及DNA测序法检测反义基因的转录;RT-PCR半定量方法检测被封闭目的基因mRNA的转录水平;TRAP及PCRELISA方法检测细胞的端粒酶活性;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果外源反义hTERT基因已整合入细胞并获稳定转录,且能显著封闭目的基因转录的mRNA,并显著抑制HGC-27细胞的端粒酶活性,抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡。结论端粒酶反义hTERT基因可有效地应用于胃癌的基因治疗。     

靶向hTERT 人工miRNA 表达框架的构建及其对HepG2 细胞端粒酶活性的抑制作用

目的：构建针对hTERT基因的人工miRNA表达框架,并验证其对HepG2细胞端粒酶活性的抑制作用。 方法：应用融合PCR技术针对不同位点设计并构建3个靶向hTERT的人工miRNA表达框架,对各表达框架鉴定后,将其单独或两种共转染HepG2细胞,采用TRAP-银染法和TRAP-二聚体蝎形探针荧光定量PCR法检测细胞端粒酶活性。 结果：3个针对hTERT基因的人工miRNA表达框架均成功构建,单独或共转染HepG2细胞后,HepG2细胞的端粒酶活性均被不同程度的抑制,且两种表达框架共转染的抑制作用明显大于单独转染,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 结论：靶向hTERT基因的人工miRNA表达框架能有效而特异抑制HepG2细胞端粒酶活性,多位点联合抑制是一种有效的实验方案。     

体外构建的小片段发夹RNA对肿瘤细胞端粒酶基因表达的干扰

目的:探讨针对端粒酶hTERT基因的小片段发夹RNA对人肿瘤细胞（HeLa）端粒酶基因的干扰及对肿瘤端粒酶的抑制作用。方法:体外合成制备shRNA，并用磷酸钙转染法转染HeLa细胞，分别用TRAP－银染法和PCR－EIA法检测端粒酶活性。结果:将制备的46个碱基的小片段发夹RNA转染HeLa细胞后端粒酶活性明显下降。结论:shRNA对肿瘤端粒酶hTERT基因表达有明显的干扰作用, 可望为临床开展对其他肿瘤端粒酶基因干扰抑制的实验研究奠定基础。     

大肠癌与端粒酶活性相关性的研究

目的　探讨端粒酶活性在大肠癌发生、发展以及浸润转移中的意义。方法　应用端粒重复扩增 (TRAP)及免疫组织化学法对 30例大肠癌、癌旁组织、正常大肠组织及 2 0例大肠腺瘤性息肉组织端粒酶活性、端粒酶催化亚基蛋白 (hTERT)的表达进行检测。结果　端粒酶活性在癌组织中检出率明显高于其他组织 (P <0 .0 5) ;大肠癌组织端粒酶活性与淋巴结是否有转移之间关系密切 ,伴淋巴结转移大肠癌端粒酶阳性表达率明显高于无淋巴结转移者 (P <0 .0 5)。结论　端粒酶活性与大肠癌的发生发展以及浸润转移密切相关 ,检测端粒酶活性对临床预测大肠癌淋巴结转移趋势、评价恶性程度和判断预后均有重要意义     

靶向hTERT、hTR新型RNAi表达框架的构建及应用效果观察

目的:构建靶向hTERT、hTR的新型RNAi表达框架,探讨单独及联合干扰hTERT、hTR基因对肿瘤细胞端粒酶活性、细胞凋亡及周期的影响,以期找到肿瘤基因治疗的新策略。方法:融合PCR构建靶向hTERT、hTR的RNAi表达框架。各表达框架经鉴定后分别或联合转染A549细胞,TRAP-银染法及TRAP-q PCR法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞凋亡及周期。结果:靶向hTERT、hTR的新型RNAi表达框架构建成功。与空白对照组或阴性对照组比较,无论转染靶向hTERT或靶向hTR的RNAi表达框架后,A549细胞的端粒酶活性均明显降低,细胞凋亡率均明显增加,细胞G1阻滞明显增加,而联合转染靶向hTERT与靶向hTR的RNAi表达框架后,A549细胞的上述改变较各自单独转染更为明显(均P0.05)。结论:靶向hTERT、hTR的新型RNAi表达框架能够有效抑制A549细胞的端粒酶活性,诱导细胞凋亡,改变细胞周期。以人工mi RNA表达框架为基础的新型RNAi技术有望成为肿瘤基因治疗的新工具。     

小干扰RNA抑制人端粒酶逆转录酶基因对胃癌细胞增殖的影响

目的 应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,观察其对细胞增殖的影响.方法 hTERT基因的RNA干扰表达重组体用脂质体介导方法转染SGC7901细胞.荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测hTERT基因表达.TRAP-PCR法检测端粒酶活性、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖.结果 SGC7901细胞转染前后hTERT基因的表达强度分别为:转染pU6组平均表达量为6.5×105拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组平均表达量为4.1 × 104拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组平均表达量为5.4×104拷贝/μg RNA.转染pU6组与其余两组P值<0.01;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组和转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组P值>0.05.端粒酶活性下降,细胞生长速度明显减慢.结论 小干扰RNA能有效抑制SGC7901细胞中hTERT基因表达,hTERT基因表达下调影响SGC7901细胞增殖.     

RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的 观察RNA干扰对大肠癌细胞中人端粒酶逆转录酶基因(hTERT gene)的抑制效应.方法 大肠癌细胞株HT-29分为Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组;将靶向于hTERT基因的小干扰RNA,转染大肠癌细胞;分别检测大肠癌细胞转染前后的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,细胞生长增殖和凋亡情况.结果 sihTERT转染大肠癌细胞效率为60%;sihTERT组的端粒酶活性值、hTERT mRNA表达、hTERT蛋白表达、细胞凋亡率分别为0.73±0.14、0.47±0.08、0.37±0.07、49.5%,sihTERT组与其他三组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 靶向于hTERT的siRNA能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡.     

端粒酶活性及其结构基因在人脑胶质瘤中的表达

目的 研究分析端粒酶活性及相关结构基因在不同级别脑胶质瘤中的表达,探讨端粒酶与脑胶质瘤的相关性及其临床意义。方法 采集40例脑胶质瘤手术切除标本、4例正常脑组织,通过半定量端粒重复序列扩增（TRAP）－银染方法检测端粒酶活性水平;通过半定量逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测端粒酶相关结构基因hTR、TP1、hTRT的 mRNA表达水平,结果 在40例胶质瘤标本的33例（82.5%)中检测出端粒酶活性,而在正常脑组织中无端粒酶活性的表达,不同级别脑胶质瘤之间端粒酶活性水平差异有显著性,脑胶质瘤粒酶活性水平与hTRT基因的表达呈显著正相关,而与TP1、hTR 的表达无显著相关。结论 端粒酶活性可以作为脑胶质瘤的恶性标记之一,hTRT基因是一个端粒酶的正调控结构基因,hTRT的表达与细胞永生化和恶性肿瘤形成过程中的端粒酶的激活机制有关,hTR基因是端粒酶活性必须的组分,但不影响端粒酶活性的高低。     

人胰腺癌与端粒酶及其亚单位表达的关系

目的：探讨粒酶活性及其亚单位表达水平与人胰腺癌发生及其临床病理特征的关系。方法：应用聚合酶链反应－银染法（PCR－银染，聚合酶链反应－酶联免疫吸附试验（PCR－ELISA）、逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）及DNA测序等技术，对24例人胰腺癌中端粒酶活性及其亚单位的表达情况进行研究。结果：24例胰腺癌标本中端粒酶活性及hTERTmRNA表达表达阳性率为87．5％、83．3％，而癌旁组织为12．5％，两组差异有显著性（P＜0．05）。hTERTmRNA的表达是人端粒酶活性表达的关键性因素。端粒酶活性的表达水平与肿瘤的分化程度，有无淋巴结的转移及临床分期明显相关。结论：端粒酶参与了胰腺癌的寻生；hTERTmRNA表达水平的上调可在胰腺癌形成过程中起重要作用。端粒酶活性的表达与人胰腺癌的生物学行为及临床病理特征有关，且有助于判断胰腺癌的恶性程度的患者的预后。     

端粒酶hTERT基因反义核酸对前列腺癌细胞PC3端粒酶活性的抑制作用

目的探讨hTERT基因的两端部分硫代修饰反义寡核苷酸（ASPS—ODN）对前列腺癌细胞PC3端粒酶活性的抑制作用。方法采用端粒重复序列扩增法及TRAP-PCR-ELISA法检测前列腺癌细胞的端粒酶活性；采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化。结果hTERT基因的两端部分硫代修饰ASPS—ODN作用于PC3细胞48h，其端粒酶活性下降，作用72h，其端粒酶活性受到抑制。结论通过hTERT基因的两端部分硫代修饰ASPS—ODN特异性抑制hTERT基因mRNA的表达，可降低前列腺癌细胞PC3端粒酶活性。     

膀胱移行细胞癌组织端粒酶活性和增殖细胞核抗原的表达及意义

目的 探讨膀胱移行细胞癌（TCCB）组织中端粒酶活性和增殖细胞抗原（PCNA）的表达关系及临床意义。方法 采用TRAP－ELISA法及免疫组化方法测定58例TCCB组织的端粒酶活性和PCNA表达情况。结果 TCCB的端粒酶阳性率为86．2％（50／58），不同病理分级或临床分期之间差别无显著性意义（P＞0．05）；PCNA表达强度与分级或分期呈正相关（P＜0．05）；不同PC－NA表达强度的TCCB样品之间，端粒酶活性差别有显著性意义（P＜0．05），二者呈正相关。结论 TCCB组织中端粒酶活性与PCNA表达有较好的协同性，二者联合检测对TCCB的诊断治疗和估计预后有重要意义。