聚合酶链反应检测脑脊液结核杆菌微量DNA的研究

聚合酶链反应检测脑脊液结核杆菌微量ＤＮＡ的研究文芳，王镇涛，万均成，林琼，宋业胜我们应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在结核性脑膜炎（结脑）患者脑脊液（ＣＳＦ）中成功地扩增出标准人型结核杆菌所特有的１５８ｂｐ基因片段，现将实验结果报告如下：对象和方法：采...     

巢式聚合酶链反应检测脑脊液中单纯疱疹病毒DNA

应用巢式聚合酶链反应(PCR)检测患者脑脊液(CSF)中单纯疱疹病毒1型(HSV-1)DNA。23例经鞘内HSV-1特异性IgG抗体检测阳性的“HSV-1型性脑炎(HSE)”中19例PCR阳性,4例阴性患者病程均超过1个月。22例IgG阴性的“散发性脑炎”中7例PCR阳性,此7例皆于发病1周内检查CSF,其中2例取材于发病当日。1周后复查7例患者,CSF PCR仍为阳性,IgG皆阴性,提示PCR适用于HSE的早期诊断。     

聚合酶链反应分子灯塔法检测脑脊液结核分枝杆菌

目的 建立定量检测脑脊液（CSF)结核分枝杆菌聚合酶链反应(PCR)分子灯塔法并评估其临床应用价值。方法 应用PCR分子灯塔定量技术检测83例CSF结核分枝杆菌并与抗酸杆菌染色、结核抗体酶联免疫吸附试验(结核抗体ELISA，简称酶联OT)进行比较。结果 PCR分子灯塔法能准确、定量地检测脑脊液结核分枝杆菌，其阳性检出率(88．3％)分别高于酶联OT（23．2％)、抗酸杆菌染色(0％)的检出率。结论 PCR分子灯塔法用于定量检测CSF结核分枝杆菌具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点。在监测患者病情、预后、指导用药方面有着广泛的应用前景，值得在临床上推广应用。     

脑脊液中结核杆菌DNA和特异性抗体检测对结核性脑膜炎的诊断价值

脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ和特异性抗体检测对结核性脑膜炎的诊断价值南京医学院一附院神经科（２１００２９）王宁山，侯熙德传染科范晓峰结核性脑膜炎（结脑）的早期诊断和鉴别诊断长期缺乏一种简便快速，敏感特异的理想方法。近二年来，随着聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的...     

聚合酶链反应在结核性脑膜炎病原菌检测中应用的研究

应用聚合酶链反应技术检测脑脊液中结核分支杆菌，简化了操作过程，用直接水煮裂解法代替ＤＮＡ提取法，反应体积缩小到２５μ１，灵敏度达１０ＣＦＵ以下结核杆菌。５６例结核性脑膜炎和４４例非ＴＢＭ脑脊液检测结果表明：ＰＣＲ敏感性９１％－９５％，特异性１００％，准确性９５％－９３．４％．仅６小时就可诊断，是目前ＴＢＭ早期快速确诊的最佳方法。     

新生儿轮状病毒无症状感染的聚合酶链反应研究

选用与 A 组人类轮状病毒(Human Romvirus,HRV)编码 VP7蛋白的第9基因(或8)两个保守序列互补的引物,建立检测 A 组 HRV dsRNA 的聚合酶链反应技术,扩增产物片段约342bp。经逆转录—聚合酶链反应(RT—PCT)检测18例无腹泻症状新生儿89份粪便标本,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法进行比较,结果前者检出 HRV 核酸54份(60.7%),而后者则检出35份(39.3%),PCR 结果可能比较接近新生儿排泌轮状病毒的实际情况。     

用聚合酶链反应技术检测人载脂蛋白B基因多态性

血清中低密度脂蛋白胆固醇及其主要的载脂蛋白——载脂蛋白Ｂ（ａｐｏＢ）的升高可能是动脉硬化性脑梗塞（ＡＣＩ）发生的危险因素之一。为了验证ａｐｏＢ基因突变与ＡＣＩ发生、发展的关系。用聚合酶链（ＰＣＲ）技术检测４０例ＡＣＩ患者和４２例正常汉族人群ａｐｏＢ基因ＸｂａＩ和信号肽插入／缺失（Ｉｎｓ／Ｄｅｌ）多态性。结果表明，正常对照组中ａｐｏＢ基因ＸｂａＩ和Ｉｎｓ／Ｄｅｌ多态性之间存在显著的连锁失衡现象。ＡＣＩ组中ＸｂａＩ和Ｉｎｓ／Ｄｅｌ多态性所组成的单倍型ＩＸ－／ＩＸ－占患者总数的６０％，明显高于正常对照组的３６％（Ｐ＜０．０５）。正常对照组中血清ａｐｏＢ、ＡＣＩ组中血清总胆固醇的水平在ＩＸ－／ＩＸ－单倍型个体均明显低于其他单倍型个体（Ｐ均＜０．０５）。本研究结果提示，ａｐｏＢ基因ＸｂａＩ和Ｉｎｓ／Ｄｅｌ多态性所组成的单倍型可能与ＡＣＩ发病有一定关系。     

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法*☆

目的：agrin基因对神经肌肉接头的形成、维持起着决定作用，也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用，其表达产物在机体内分布广泛。设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法，并检测其特异性、敏感性和可重复性。 方法：实验于2007-04/11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成。以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物，经检索Blast验证特异性，并以Primer 5设计构建agrin基因标准品引物。选择清洁级Wistar大鼠交配，获取3日龄乳鼠，取脑，获取mRNA、cDNA，常规反转录-聚合酶链反应获取agrin 554个碱基DNA片断。PCR填加T7启动子后，T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品，消化模板。分光光度计测定其浓度，1∶5倍比稀释3次；经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品，测序验证特异性。以ACTB引物反转录cDNA，1∶5倍稀释3次，构建ACTB基因标准品。常规聚合酶链反应确定、优化反应条件。标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性，融解曲线验证检测方法的特异性，作重复性检测。 结果：①agrin基因有意义链引物序列：GAA GGC CAG GTG CGA ATC A，反义链引物序列：CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G，内标：ACTB基因有意义链引物序列：GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA，反义链引物序列：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG，优化反应条件：95 ℃ 变性5 s，60 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸20 s。②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均 > 0.95。③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求。 结论：绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法。     

病原真菌DNA提取方法及简单重复序列聚合酶链反应体系的优化

背景：真菌DNA的提取在真菌基因工程以及分子生物学研究中占有重要地位。DNA的提取效率,尤其是DNA的质量严重影响实验结果。 目的：建立提取病原真菌基因组DNA的方法,探讨简单重复序列-PCR反应体系中各成分的最佳组合。 设计、时间及地点：DNA提取方法对照分析及正交实验,于2004-06/2006-12在吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室真菌学研究室进行。 材料：将接种临床标本的马铃薯葡萄糖液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母蛋白胨液体培养基28 ℃培养3~7 d后,选取可疑菌落进行分离、纯化。 方法：比较玻璃珠-盐析法、CTAB法、Gene TLETM抽提法3种不同DNA提取方法对菌体DNA质量的影响;利用正交设计,选择Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物 4个因素,在3个水平上根据L9(34)正交表进行试验,对真菌简单重复序列-PCR(SSR-PCR)体系进行优化分析;并通过PCR选择适宜的退火温度及循环次数。 主要观察指标：根据扩增获得带型的多态性和特异性,确定最佳反应体系。 结果：Gene TLETM抽提法全部在相应的PCR体系中扩增出目的片段,且带型清楚度、明亮度优于其余两种方法。SSR-PCR反应体系正交试验结果显示,根据R值大小确定因素显著性顺序为模板DNA(2.67)>Taq DNA聚合酶(2.00)>dNTP(0.67)>引物(0.33);根据ki值大小确定各因素优化水平组合为：模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP150 μmol/L,引物0.5 μmol/L。但由于引物作为影响因素的R值小,是非显著因素,因此引物取A水平即0.25 μmol/L。反应条件以53 ℃退火温度、35个循环次数为最佳。 结论：Gene TLETM提取法提取DNA的效率更高、操作步骤快速简单。根据正交试验的优化结果,SSR-PCR最佳反应体系为模板DNA 30 mg/L,Taq DNA聚合酶1 U,dNTP 150 μmol/L,引物0.25 μmol/L。反应条件以53 ℃退火温度、35个循环次数为最佳。     

聚合酶链反应快速诊断结核性脑膜炎

早期临床诊断结核性脑膜炎是一个十分迫切需要解决的课题。我院2年来开展聚合酶链反应(PCR)检测脑脊液中结核杆菌基因     

聚合酶链反应及抗体检测对单纯疱疹病毒性脑…

通过特异性抗体及聚合酶链反应检测，３８例散发性脑炎中１８例诊断为单纯疱疹病毒性脑炎，２０例为非ＨＳＥ的散发性脑炎。并与３０例其它神经系统疾病患者作三组对比性临床及实验室研究，发现ＨＳＥ在临床表现，脑脊液，头颅ＣＴ等方面有其特征性。１８例ＨＳＥ的２４份脑脊液标本中，ＰＣＲ阳性１８份，ＨｇＧ阳性１９份，其中１３份ＰＣＲ和ＩｇＧ皆阳性。其余两组ＰＣＲ和ＩｇＧ均阴性。ＰＣＲ和ＩｇＧ检测有可能成为ＨＳＥ常规     

聚合酶链反应诊断单纯疱疹病毒性脑炎的初步研究

应用聚合酶链反应(PCR)检测已为CSF特异性抗体证实的6例急性期单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)患者10份CSF中病毒DNA,结果PCR全部阳性。其中2份标本第一步PCR为阴性,第二步套式PCR为阳性。10份其它中枢神经感染的CSF的PCR全部阴性。说明PCR方法简单、迅速、敏感性及特异性高,是病原学诊断的一大突破,适于早期和快速诊断HSE。     

聚合酶链反应诊断单纯疱疹病毒性脑炎

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增患者脑脊液（ＣｈＦ）中病毒特异性ＤＮＡ可早期快速诊断单纯疱疹病毒性脑炎（ＨＳＥ）。１９例临床确诊的病毒性脑炎患者，经ＰＣＲ在ＣＳＦ中检出单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）１３例，全部阳性标本均经分子杂交证实为ＨＳＶ－ＤＮＡ，而１４例其他神经疾病（ＯＮＤ）对照组均为阴性，显示了这一方法的特异性。其中７例病毒性脑炎ＣＳＦ标本分别用ＰＣＲ分子杂交和病毒分离等三种方法检测ＨＳＶ；显示ＰＣＲ最为敏感。表明ＰＣＲ技术的广泛应用将提高ＨＳＥ的早期诊断水平，指导临床正确治疗。     

多发性硬化,逆转录病毒以及聚合酶链反应

多发性硬化(MS)的病因仍未明了。过去40年里人们曾提出了许多假说。近年来,又有人提出逆转录病毒病因学的可能性,并引起强烈反响。Gessain等首先于1985年发表的论文中将Ⅰ型人类T细胞白血病病毒(HTLV—Ⅰ)血清阳性与热带痉挛性轻截瘫(trapical spastic paraparesis,TSP)即日本     

聚合酶链反应及抗体检测对单纯疱疹病毒性脑炎早期诊断的意义

通过特异性抗体（ＥＬＩＳＡ）及聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测，３８例散发性脑炎中１８例诊断为单纯疱疹病毒性脑炎（ＨＳＥ），２０例为非ＨＳＥ的散发性脑炎（ＮＨＳＳＥ）。并与３０例其它神经系统疾病患者作三组对比性临床及实验室研究，发现ＨＳＥ在临床表现、脑脊液、头颅ＣＴ等方面有其特征性。１８例ＨＳＥ的２４份脑脊液（ＣＳＦ）标本中，ＰＣＲ阳性１８份，ＩｇＧ阳性１９份，其中１３份ＰＣＲ和ＩｇＧ皆阳性；其余两组ＰＣＲ和ＩｇＧ均阴性。ＰＣＲ和ＩｇＧ检测有可能成为ＨＳＥ常规诊断方法，ＰＣＲ于发病当天即可获得诊断。     

PCR技术检测CSF中结核杆菌的研究

<正> 对象及方法 1.对象;23例患者均为我院住院病人。经临床检查及CSF实验室检查诊断为结核性脑膜炎。其中男性14例,女性9例。最小年龄10月,最大年龄41岁。另选10例根据临床表现,CSF、EEG临床诊断为病毒性脑炎患者作对照。     

变性温度和时间对实时定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响**☆

背景：在实时荧光定量聚合酶链反应检测过程中，由于设计的热循环参数不同，检测结果常会出现假阳性或假阴性。 目的：变性温度、变性时间以及聚合酶链反应运行的温度特性对实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2007-07-06/08在上海市安图医院PCR实验室完成。 材料：LightCycler 荧光聚合酶链反应检测仪由美国罗氏公司提供，乙型肝炎病毒核酸扩增聚合酶连反应荧光定量检测试剂盒由深圳匹基公司提供。 方法：聚合酶链反应运行程序条件：变性温度分别为88~97 ℃，变性时间分别为5 s和40 s，退火和延伸60 ℃，40 s，循环数40。 主要观察指标：乙肝病毒遗传物质的数量。 结果：聚合酶链反应运行温度上冲和下冲比较严重；变性时间对DNA浓度较低的样本影响很大，DNA很难被检测出；变性温度超过95 ℃，变性时间超过40 s时，检测到的DNA的量明显降低；变性时间小于20 s时，容易出现假阴性。 结论：变性时间太短、变性温度太高且变性时间太长容易造成乙型肝炎病毒检测出假阴性。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测腓骨肌萎缩症1A型基因重复

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease,CMT）,是神经系统常见的遗传性疾病之一,根据电生理和病理学研究将其分成两大组：CMT1（脱髓鞘型）和CMT2（神经元型或称轴索型）.该病是一组遗传异质性疾病,目前已发现30个基因座位与不同类型的CMT相关,其中有11型已明确了致病基因,发病率最高的是常染色体显性遗传的CMT1A.我们已先后建立起短串联重复序列分析（STR）和聚合酶链反应（PCR）酶切法检测特异性融合片段来诊断CMT1A基因重复.STR结合银染的方法因有便宜、省时和所需DNA数量少等优点曾被广泛应用,但主要缺点是受杂合率的限制,如果被检测者为纯合子,则无法得出结论;再者,实验结果不稳定,银染重复性不理想.而PCR酶切法的阳性率则较低.因此,为提高基因重复检测的阳性率,并适于在临床应用,我们应用实时荧光定量PCR技术,以SYBRGreen Ⅰ荧光染料为标记物,采用标准曲线的相对定量方法检测了18例CMT1A患者的基因重复,现报道如下.