miR-217靶向调控胰岛素分泌细胞诱导分化NeuroD1基因表达

目的：实现骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向胰岛素分泌细胞（insulin-producing cells,IPCs）的诱导分化并验证分化过程中miR-217靶向调控NeuroD1基因表达。方法分离培养BMSCs,应用大鼠胰腺损伤提取物（rat pancreatic extraction,RPE）将其诱导分化为IPCs。采用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-217和NeuroD1基因的靶向匹配关系进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定。qRT-PCR检测诱导分化过程中miR-217和NeuroD1的表达。结果诱导分化后的细胞双硫腙染色呈猩红色,免疫荧光化学显示有胰岛素表达。生物信息学方法预测发现miR-217和NeuroD1基因二者匹配良好,通过双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-217能结合到NeuroD1 mRNA的3＇UTR并有效抑制其表达。qRT-PCR检测结果表明,miR-217的表达水平与NeuroD1表达呈负相关。结论 miR-217能调控IPCs诱导分化过程中NeuroD1的表达。     

miR-186靶向调控骨桥蛋白基因表达对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨miR-186对骨髓间充质干细胞(bMSCs)成骨向诱导分化过程中骨桥蛋白(OPN)基因的靶向作用及其对bMSCs成骨分化的影响.方法:分离培养bMSCs,应用骨形成蛋白2成骨向诱导分化并采用碱性磷酸酶染色和Von-kossa染色鉴定;运用生物信息学方法对miR-186和OPN基因的靶向配对关系进行预测,采用荧光素酶报告系统鉴定;脂质体2000转染miR-186模拟物以及干扰OPN基因的siRNA后,Real-time PCR检测miR-186和OPN mRNA的表达,Western blot检测OPN蛋白的表达.结果:光镜下可见bMSCs均匀分布,诱导分化后的细胞碱性磷酸酶染色呈蓝色.生物信息学软件TargetScan和miRanda显示miR-186和OPN基因二者靶向配对良好,荧光素酶报告系统进一步验证发现,miR-186能够抑制OPN mRNA表达.Real-time PCR和Western blot检测结果表明过表达miR-186能够降低OPN mRNA和蛋白的表达.结论:miR-186通过下调bMSCs成骨向诱导分化过程中OPN基因表达进而抑制bMSCs的成骨分化.     

miR-20a-5p调控成骨细胞分化相关靶基因的筛选及靶向关系验证

目的:筛选miR-20a-5p调控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p调控成骨分化的分子机制。方法:通过靶基因预测软件预测miR-20a-5p的靶基因,将靶基因的3′UTR及点突变序列插入荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）报告载体中,并与miR-20a-5p的模拟物或阴性对照共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶实验和GFP抑制实验检测荧光素酶活性及GFP阳性细胞比例,确定miR-20a-5p与靶基因的靶向关系。结果:通过生物信息学预测到Smad7是miR-20a-5p的靶基因,miR-20a-5p在不同物种的Smad7基因3′UTR区都有保守的结合种子序列;荧光素酶、GFP报告基因及点突变载体经PCR及测序鉴定均正确;双荧光素酶活性检测结果显示:miR-20a-5p显著降低Smad7 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性;GFP抑制实验及流式细胞仪检测结果显示:miR-20a-5p可以显著降低GFP阳性细胞的比例。结论:miR-20a-5p可以直接靶作用于Smad7 3′UTR的种子序列,提示其可能通过直接靶向Smad7基因来发挥促进成骨分化的调控作用。     

miR-98-5p靶向调控AKT2基因对人胃癌MGC803细胞增殖的影响

目的 探讨人胃癌MGC803细胞中miR-98-5p和AKT2基因的表达,阐明miR-98-5p对AKT2基因的靶向调控作用以及对MGC803细胞增殖的影响。 方法 培养MGC803细胞并应用免疫组织化学技术检测AKT2基因的表达;采用生物信息学方法对miR-98-5p和AKT2基因的匹配关系进行预测并用双荧光素酶报告基因系统鉴定;转染miR-98-5p模拟物后,行real-time PCR检测miR-98-5p和AKT2基因的表达,Western blotting检测AKT2蛋白的表达,MTT法和平板克隆形成实验检测癌细胞的增殖情况。 结果 倒置相差显微镜下可见人胃癌MGC803细胞呈梭形或多角形,少数呈类圆形;免疫组织化学染色显示胞质内有AKT2蛋白的表达,呈棕褐色。靶基因预测软件miRanda和TargetScan显示miR-98-5p和AKT2基因匹配良好,双荧光素酶报告基因系统鉴定发现miR-98-5p能够结合AKT2 mRNA 3'UTR并有效抑制其表达。Real-time PCR和Western blotting检测结果均表明miR-98-5p的过表达能够下调AKT2基因表达。MTT法和平板克隆形成实验表明,miR-98-5p的过表达能够抑制MGC803细胞增殖。 结论 miR-98-5p通过靶向作用于AKT2 mRNA 3’UTR负性调控人胃癌MGC803细胞中AKT2的表达,并抑制癌细胞的增殖。     

miR-125b靶向调控HK2表达增强乳腺癌MCF-7细胞放射敏感性的研究

目的探讨miR-125b靶向调控HK2对乳腺癌MCF-7细胞放射敏感性的影响。方法将miR-125b模拟物及其阴性对照转染至乳腺癌MCF-7细胞,分别记为miR-125b组和miR-NC组,采用RT-PCR检测MCF-7细胞中miR-125b和HK2 mRNA的表达,Western blotting检测HK2蛋白的表达;双荧光素酶报告基因实验检测miR-125b和HK2的靶向关系。另外将miR-125b模拟物和pcDNA3.1-HK2质粒共转染至MCF-7细胞中,记为miR-125b+HK2组,通过克隆形成实验和流式细胞仪检测miR-NC组、miR-125b组和miR-125b+HK2组细胞的存活分数和凋亡率。结果与miR-NC组相比,转染miR-125b模拟物后MCF-7细胞中miR-125b表达升高（P < 0.01）,而HK2 mRNA和蛋白的表达降低（P < 0.01）。双荧光素酶报告基因实验证实HK2是miR-125b的潜在靶基因。与miR-NC组相比,miR-125b组细胞的存活分数降低、凋亡率升高（P < 0.01）;与miR-125b组相比,miR-125b+HK2组存活分数降低明显升高而凋亡率降低（P < 0.01）。结论miR-125b可通过靶向调控HK2表达增强乳腺癌MCF-7细胞的放射敏感性。     

miR-106a对胶质瘤增殖和凋亡的影响及机制研究

目的 探讨微小RNA（miR）-106a对人胶质瘤细胞中腺瘤样息肉（APC）基因的靶向调控作用以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法 收集2020年1月至2021年12月浙江省立同德医院减压切除的10例胶质瘤组织和10例对照组织。采用实时荧光定量PCR法检测miR-106a在胶质瘤组织和对照脑组织中、在胶质瘤LN229、U251和U87等细胞系中的表达水平并作比较。使用miR-106a抑制物转染LN229和U251细胞,采用克隆形成实验检测细胞增殖能力,通过流式细胞术检测细胞凋亡水平。通过TOP/FOP荧光素酶实验检测荧光素酶活性,采用Western blot法检测Wnt通路相关蛋白和核内β-连环蛋白（β-catenin）的表达。采用qRT-PCR和Western blot法检测APC的mRNA和蛋白表达水平。利用双荧光素酶报告基因实验确认miR-106a和APC的靶向关系。通过表型拯救实验检测miR-106a靶向APC对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果 miR-106a在胶质瘤组织和细胞系中高表达。抑制miR-106a表达降低胶质瘤细胞的增殖水平,提高胶质瘤细胞的凋亡水平,并抑制了Wnt/...     

miR-483-5p靶向Timp2调控破骨细胞的生成

目的：miR-483-5p可促进破骨细胞分化和骨破坏，本研究探讨miR-483-5p是否通过靶向作用于Timp2调控破骨细胞的生成。方法：采用miRNAs靶基因预测软件Target Scan8.0对miR-483-5p的靶基因进行预测，并构建野生型和突变型3’UTR质粒，通过双荧光素酶报告基因验证靶基因是否与miR-483-5p存在靶向调控关系。用免疫印迹方法检测miR-483-5p的mimics或inhibitor转染细胞后靶蛋白表达水平的相应变化。用靶基因si RNA或靶蛋白慢病毒转染或感染细胞，RANKL诱导后分别进行TRAP染色和q-PCR检测。结果：运用生物信息学软件预测miR-483-5p的靶基因，发现具有调控破骨细胞作用的Timp2基因，且双荧光素酶报告基因检测系统发现miR-483-5p可以与预测的靶基因Timp2基因的3′-UTR位点互补，两者之间存在靶向调控关系。在RAW264.7细胞中上调miR-483-5p水平可减少Timp2的表达；敲低细胞中的Timp2，诱导后较正常组破骨细胞数量显著增多，且破骨细胞特异性基因表达升高。将靶基因和miR-483-5p共转染入细...     

miR-181b通过靶向调控N-myc下游调节基因2影响骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

目的探讨miR-181b对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响。方法培养骨肉瘤细胞,实时荧光定量PCR检测miR-181b在骨肉 瘤细胞中的表达。抑制miR-181b的表达,Transwell检测对骨肉瘤迁移和侵袭的影响;生物信息学分析miR-181b靶基因并采用 荧光素酶报告基因分析miR-181b和靶基因在骨肉瘤中是否直接作用,同时采用Western Blotting检测靶基因在骨肉瘤细胞中的 表达以及Transwell检测靶基因对骨肉瘤迁移和侵袭的影响。结果实时荧光定量PCR结果表明miR-181b在骨肉瘤细胞中高 表达。抑制miR-181b 的表达能够抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;生物信息学分析表明N-myc 下游调节基因2（NDRG2）是 miR-181b直接作用的靶基因,荧光素酶报告基因分析验证了该结果;Western blotting检测表明NDRG2在骨肉瘤中低表达,而 抑制miR-181b 能够显著提高NDRG2 的表达。抑制miR-181b 的表达的同时抑制靶基因NDRG2 的表达,能够逆转抑制 miR-181b的表达对骨肉瘤细胞的迁移和侵袭的影响,从而显著提高骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。结论miR-181b在骨肉瘤中过 表达,NDRG2为miR-181b直接调控靶基因,抑制miR-181b能够提高NDRG2的表达从而抑制骨肉瘤细胞的迁移侵袭。     

MicroRNA-181b对2型糖尿病胰岛素分泌调节的作用及其机制研究

目的 探讨microRNA-181b(miR-181b)能否通过靶向调控NDRG2参与2型糖尿病胰岛素分泌的调节。方法 选用小鼠胰岛β细胞进行体外传代培养,构建NDRG2野生型（NDRG2WT-1uc）与突变型（NDRG2MUT-1uc）荧光素酶报告基因质粒并进行转染,转染结束后进行双荧光素酶报告分析。构建NDRG2过表达和敲低质粒并转染小鼠胰岛β细胞,检测NDRG2 mRNA和蛋白表达、胰岛素分泌量。未转染的小鼠胰岛β细胞培养48 h后采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-181b和NDRG2 mRNA的表达。采用葡萄糖刺激的胰岛素释放试验检测5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖条件下的小鼠胰岛β细胞分泌的胰岛素。结果 (1)荧光素酶报告基因实验检测发现,各组相对荧光强度比较,差异有统计学意义（P <0.05）。miR-181b模拟物可以明显抑制NDRG2WT-luc的3’端非翻译区的表达,但对NDRG2-MUT组和Control组无明显影响;miR-181b inhibitor可以加强NDRG2WT-luc的3’-端非翻译区的表达,但对NDRG2-MUT组和Contr...     

miR-34b促进关节软骨细胞基质退变的分子机制研究

目的探讨微小RNA-34b（miR-34b）促进关节软骨细胞基质退变的分子机制。方法提取10例骨关节炎（OA）患者和7例创伤性截肢者的膝关节软骨组织,实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测组织标本中miR-34b表达水平。利用Targetscan基因信息软件预测得到miR-34b靶基因为Smad3,构建Smad3野生型及突变型3′非编码区（3′-UTR）-荧光素酶报告载体,利用荧光素酶报告基因实验检测miR-34b对Smad3基因野生型及突变型3′-UTR荧光素酶活性的影响。体外培养SW1353细胞,分为A、B、C和D组,分别加入等量脂质体、无义序列、miR-34b模拟物（miR-34bmimic）和miR-34b抑制物（miR-34binhibitor）。RT-qPCR法检测miR-34b、Smad3、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达水平。结果OA软骨组织中miR-34b表达水平较正常膝关节软骨组织明显上调（P＜0.05）。SW1353细胞转染后,与A组比较,C组miR-34b表达水平明显升高（P＜0.05）,D组明显降低（P＜0.05）;A组与B组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。TargetsCan软件预测miR-34b的潜在靶基因为Smad3,荧光素酶报告基因实验证实miR-34b直接靶向抑制靶基因Smad3;转染miR-34bmimic和miR-34inhibitor后,与A组比较,C组Smad3mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,D组明显升高（P＜0.05）;A组与B组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后,与A组比较,C组Ⅱ型胶原mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,D组明显升高（P＜0.05）;C组MMP-13mRNA明显升高（P＜0.05）,D组明显降低（P＜0.05）。结论miR-34b可能通过抑制其靶基因Smad3的表达进而诱导人关节软骨细胞基质退变,从而促进OA的发生、发展。     

pcDNA-DEST47-miR-29b重组质粒的构建及其对VEGF表达的靶向调控作用

目的构建has-miR-29b重组表达载体,并探讨其对VEGF表达的靶向调控作用。方法利用生物信息学方法预测has-miR-29b与VEGF-3＇UTR的结合位点;将PCR扩增的miR-29b前体序列和pcDNA-DEST47载体经酶切后连接,构建pcDNA-DEST47-miR-29b表达载体;采用荧光素酶检测法和Western blot法证实miR-29b对VEGF蛋白表达的抑制作用。结果 psiCHECK2-VEGF荧光素酶报告质粒和pcDNA-DEST47-miR-29b两种质粒共转染组的荧光素酶活性明显低于单独转染的空载体组和Lu-VEGF组（P〈0.01）,同时发现其他种类miRNA（Let-7g）不能抑制VEGF荧光素酶活性,而miR-29b明显抑制VEGF荧光素酶活性;转染pcDNADEST47-miR-29b质粒后在Jurkat细胞中VEGF蛋白的表达明显受抑制。结论本研究成功构建pcDNADEST47-miR-29b重组质粒;miR-29b与VEGF具有靶向关系,且miR-29b参与其调控作用。     

miR-125b通过靶向抑制Smad4调控骨髓间充质干细胞成骨分化

目的: 研究miR-125b是否通过调控其预测的靶基因Smad4表达而调节骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化。方法: 构建Smad4 3'-UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告检测观察miR-125b对Smad4 3'-UTR-荧光素酶活性的影响;分离培养人骨髓MSCs,在MSCs中转染miR-125b mimics并进行成骨诱导,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹检测Smad4表达水平;Smad4 siRNA转染MSCs并进行成骨诱导,通过检测碱性磷酸酶(AKP)活性及RUNX2 mRNA表达水平变化考察Smad4下调对MSCs成骨分化的影响。结果: 双荧光素报告检测显示miR-125b能特异性地与Smad4 mRNA的3'-UTR结合,抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。过表达miR-125b能抑制MSCs成骨分化过程中Smad4表达水平。干扰Smad4表达能抑制AKP活性及RUNX2 mRNA表达水平,它能部分模拟miR-125b调控MSCs成骨分化的功能。结论: miR-125b通过抑制靶基因Smad4的表达调控MSCs成骨分化。     

COPD中MicRNA-320c-5p调节SERPINA1基因表达的研究

目的 通过双荧光素酶报告系统验证miR-320c-5p对SERPINA1基因的靶向调控关系。方法 从人正常肺上皮细胞基因组库中获取SERPINA1基因的3′UTR序列,并通过序列匹配拟定候选miRNA。利用3%香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)诱导人支气管上皮细胞(BEAS-2b细胞)建立慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)细胞模型作为实验组,正常培养的BEAS-2b细胞作为对照组,使用实时荧光定量聚合酶链反应(real time flurocent qualitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测两组SERPINA1和候选miRNA的表达水平。构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体,分别将双荧光素酶报告质粒(psiCHECK-2-SERPINA1-3′UTR和psiCHECK-2-SERPINA1-3′UTR mut)和miRNA质粒(miR-320-5p mimic)共转染到293T细胞,进行荧光活性测定。结果 通过序列...     

miR-431-3p对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其靶向调控CTDP1基因表达机制

目的：探讨miR-431-3p对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,阐明其可能的分子机制。方法：取经病理诊断确诊为胃癌的68例患者的胃癌组织及其癌旁组织。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测胃癌组织、癌旁组织和人正常胃黏膜上皮GES-1细胞、人胃癌细胞（MKN-28、MGC-803、 MKN-45、 SGC-7901和HGC-27）中miR-431-3p及羧基末端结构域磷酸酶1 (CTDP1)mRNA表达水平,Western blotting法检测上述细胞中CTDP1蛋白和各组SGC-7901细胞中细胞色素C(Cyt C)、B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平。采用Pearson相关分析法分析miR-431-3p与CTDP1 mRNA表达水平的相关性,双荧光素酶报告基因实验检测miR-431-3p和CTDP1的靶向关系。将miR-431-3p mimic和CTDP1过表达慢病毒分别或同时转染至SGC-7901细胞中,将细胞分为空白组、空载过表达（mimic NC）组、miR-431-3p过表达（miR-431-3p mimic）组、空载慢病毒（Ve...     

组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7促进Ngn1基因的表达

目的 构建小鼠组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7真核表达载体并初步探讨其对神经细胞分化的影响.方法 采用基因工程技术,克隆小鼠Setd7基因并将其插入真核表达载体pCMV-3tag-6中,之后转染HEK 293T细胞,Western blot验证其表达;利用实时荧光定量PCR技术检测在神经分化模型(全反式维甲酸诱导P19神经分化)中,Setd7对神经分化关键基因Ngn1的调控;利用双荧光素酶报告系统检测Setd7对Ngn1启动子活性的影响;构建小鼠Setd7 siRNA干扰质粒,利用实时荧光定量PCR技术检测其抑制效果以及对 Ngn1 mRNA表达的影响.结果 成功构建了小鼠Setd7基因的真核表达载体,可在HEK 293T细胞中有效表达;Setd7可促进Ngn1 mRNA表达;Setd7能够促进Ngn1启动子活性; 降低Setd7抑制Ngn1 mRNA 表达.结论 组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7能够促进神经分化关键基因Ngn1的转录.     

miR-125b调节C3H10T1/2间充质干细胞中Cbfβ的表达

目的研究miR-125b对鼠间充质干细胞株C3H10T1/2中核心结合因子-β(core-binding factor beta,Cbfβ)表达的调节作用。方法将microRNA阴性对照、miR-125b mimic和anti-miR-125b用脂质体转染小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2,Western blot及RT-PCR测定细胞中Cbfβ蛋白及mRNA表达;以PicTar数据库预测的Cbfβ3’-非翻译区上miR-125b靶位点附近约30个碱基为基础合成3组插入序列(阳性对照、野生型序列、突变序列),连接到经HindⅢ、SpeⅠ双酶切后的PmiR-report载体质粒上,然后与miRNA阴性对照和miR-125b mimic共同转染293T细胞,双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性。结果过表达miR-125b抑制Cbfβ蛋白及mRNA表达(P<0.05),转染anti-miR-125b可促进Cbfβ蛋白及mRNA表达(P<0.05);miR-125b抑制Cbfβ3’-非翻译区荧光素活性。结论外源性miR-125b可作用于Cbfβ3’非翻译区从而负性调节C3H10T1/2细胞中Cbfβ的表达。     

miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的作用研究

目的研究miR-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其作用机制,方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)+PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)⁺PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)+PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6),TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信号转导通路的转录因子,过表达miR-125a降低了TRAF6的蛋白表达水平,而TRAF6的mRNA水平无明显改变。结论 miR-125a通过作用于新的FRAF6/NFATC1/miR-125a负反馈调控环路在破骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用,调控miR-125a的表达可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。