骺板软骨细胞复合生物凝胶体外培养生成软骨组织的实验研究

目的 观察将骺板软骨细胞接种于自制的生物凝胶经体外培养生成软骨组织的生物学特点，初步评价这一凝胶基质作为软骨组织构建材料的生物学性能。方法 将第一代骺板软骨细胞接种于生物凝胶进行体外培养，行大体，倒置显微镜以及组织学，Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察。结果 骺板软骨细胞－生物凝胶复合的，在体外培养过程中不能春初始外形，培养1周直径可收缩为初始的45％，但能保持种子细胞的稳定均发布。经体外培养2周后由外周向中心逐渐形成软骨组织，表面为由1－3层梭形细胞组成的膜样结构，内部细胞主要为圆形细胞，有细胞外基质相隔，形成软骨细胞陷窝。基质中富含软骨特异性基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，而Ⅰ型胶原免疫组化逐渐转为弱阳性，位于表面膜结构。结论 这一生物凝胶具有良好的细胞相容性，适合软骨细胞在其中生成成熟的工程化软骨，但难以维持其初始外形。     

高数量骺板软骨细胞聚集培养生成软骨组织的观察

目的　观察高数量骺板软骨细胞的离心管内长期聚集培养生成软骨组织的大小和生物学特点 ,并对这一培养技术进行初步评价。方法　酶消化法分离幼兔骺板软骨细胞 ,以 90× 10 4 原代细胞经离心沉降于 15ml塑料离心管底聚集培养 ,行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察。结果　培养生成的软骨 ,随培养时间的延长体积逐渐增大 ,4周时直径最大为 4 5mm ;外周组织结构类似于骺软骨的生发层或软骨膜 ,由多层细胞构成 ,随时间的延长而减少 ;中心部位为肥大的软骨细胞 ,随培养时间的延长而增多。 2周后 ,甲苯胺蓝染色呈强的异染反应 ,Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性 ;Ⅰ型胶原的免疫组化着色明显减弱 ,主要位于外周。结论　离心管内工程化软骨构建技术所需操作简便、设备简单 ,生成的工程化骺板软骨具有良好的软骨结构和富含软骨特异性基质成分 ,增加细胞数量可使形成的软骨体积有所增大 ,但其大小和形状仍很有限。     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨

目的探讨复合应用胶原凝胶和骨胶原基质（BCM）支架作为软骨细胞载体体外构建组织工程软骨的有效性和可行性.方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）染色观察软骨组织形成情况.结果软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论胶原凝胶复合BCM支架可作为软骨细胞的载体体外构建组织工程软骨.     

微球化骺板细胞构建兔异位骺软骨实验

目的探讨海藻酸钙-多聚赖氨酸微球复合骺板细胞,在兔体内异位构建组织工程化骺软骨的可行性。方法将兔异体骺板软骨细胞接种于海藻酸钙-赖氨酸凝胶微球中,体外培养后植入兔背部皮下,分别于2、4、8周取材进行大体及组织学观察。结果体外培养时微球中骺板细胞生长、增殖情况良好;移植皮下后第4周取材可见外形呈类骺软骨样组织块,行HE、甲苯胺蓝、番红“O”及Ⅱ型胶原等染色,镜下观察可见大量软骨细胞及类软骨陷窝样结构,植入的海藻酸钙微球周围组织无明显炎症反应。结论海藻酸钙-赖氨酸具有良好的组织相容性,复合异体骺板细胞形成微球,植入同种异体动物体内可以构建类骺软骨样组织。     

体外家兔骺板软骨细胞和复合支架材料构建人工骺板软骨

目的：探讨采用复合支架材料构建人工骺板软骨的可行性。方法:分离获得骺板软骨细胞,加入0.3% Ⅰ型胶原酸性溶液、1 000 U·mL^-1凝血酶溶液及20 g·L^-1人血冻干纤维蛋白原混匀,成为胶冻样软骨组织培养物。定期取培养块固定,常规石蜡切片,行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组化检查。结果：新制成的以胶原-纤维蛋白混合凝胶为支架材料的软骨细胞培养物呈浅粉红色胶冻样 ,细胞均匀分布于其中。培养3 d后悬浮物呈乳白色,透光度降低。逐渐缩小至直径约7 mm大小,硬度逐渐增加。HE染色见软骨细胞位于软骨陷窝内,软骨细胞培养物有一定层次感,但没有象骺板样排列成柱状。甲苯胺蓝染色显示胞体周围有丰富的软骨基质。免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原阳性细胞。结论：利用混合支架构建的人工骺板软骨在大小及可塑性等方面结果较满意。     

脱细胞骨软骨支架的细胞相容性测定及与软骨细胞体外的复合

目的测定脱细胞和脱钙处理的脱细胞骨软骨支架的细胞相容性及该支架与软骨细胞体外复合培养的生物学特性和黏附关系,以探讨脱细胞骨软骨支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法采用自制脱细胞骨软骨支架与软骨细胞体外复合培养,用细胞增殖度法测定脱细胞骨软骨支架的细胞相容性,并行电镜观察其相互黏附关系。结果脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验中,软骨细胞可贴附于材料上生长增殖,并分泌细胞外基质。结论细胞增殖实验显示脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验显示脱细胞骨软骨支架可与软骨细胞良好复合,适于软骨细胞贴附生长。     

利用PLGA细胞支架再生人关节软骨的实验研究

目的：研究人关节软骨细胞在PLCA三维支架上的贴附和生长情况，利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法：制作PLGA三维细胞支架。分离培养成人关节软骨细胞，体外扩增后种植到PLGA支架中。在体外和裸鼠体内分别培养软骨细胞一支架复合物，分期终止培养，进行组织学染色、扫描电镜、Ⅱ型胶原免疫组织化学及cDNA探针原位杂交检测。结果：体外培养发现，软骨细胞支架材料内贴附生长良好，长期培养仍保持软骨细胞特性，棵鼠体内培养8周后可形成软骨样组织。结论：PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌软骨外基质，可作为软骨组织工程的细胞载体。利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化关节软骨。     

胶原凝胶复合CPPf/PLLA支架与软骨细胞的相容性研究

目的研究软骨细胞与胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架的细胞相容性,为软骨组织工程提供适宜的种子细胞载体。方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞整合入CPPf／PLLA三维支架并进行体外培养,采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上粘附、生长和增殖等情况,从组织学和Ⅱ型胶原免疫组化对复合组织进行评价。结果软骨细胞能良好地在支架上粘附、生长和增殖,新形成的组织为透明软骨样组织、细胞外基质有Ⅱ型胶原分布。结论胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架具有良好的细胞相容性,可作为软骨细胞栽体。     

BMSCs复合几丁质体外联合培养的实验研究

目的:探讨可注射性水凝胶几丁质作为组织工程软骨支架的可能性,为组织工程软骨的体外构建提供实验依据。方法:用密度梯度离心的方法,体外分离培养大鼠BM SC s,并进行鉴定。取第4代的BM SC s,复合可注射性水凝胶几丁质,加入成软骨诱导培养体系。分别于联合培养后的7、14、21d,取材,利用光镜、组织学,以及免疫组化和电镜的方法进行观察。结果:可注射性水凝胶几丁质为骨髓基质干细胞提供三维生长环境,并使之保持正常形态,经过成软骨诱导后形成正常透明软骨结构。实验组在培养7、14、21d BM SC s诱导分化的软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,实验组Ⅱ型胶原含量明显优于对照组。结论:可注射性水凝胶几丁质可作为软骨组织工程的良好的载体材料。     

脱钙骨基质的制备及与软骨细胞体外复合的实验研究

目的：探寻良好的软骨组织工程支架材料。方法：制备兔脱钙骨基质（decalcified bone matrix,DBM）,采用液体置换法检测经脱钙2、3、4 d支架材料的孔隙率。扫描电镜观察DBM的超微结构,以及软骨细胞与DBM体外复合培养3 d的黏附情况。结果：脱钙3 d的DBM多孔结构及空隙适合软骨细胞的黏附和增殖。软骨细胞和DBM体外培养3 d黏附良好。结论：DBM是良好的软骨组织工程支架材料。     

人工骺板软骨对家兔骺板损伤的修复作用

目的：探讨人工骺板软骨移植修复骺板损伤。 方法：切除家兔左侧胫骨上端骺板软骨约1/3～1/2,制备人工骺板软骨构件移植入该骺板损伤处;右侧胫骨近端骺板损伤后不进行移植作为对照。连续观察家兔双下肢外观及运动状态,摄双侧下肢X线片,测量胫骨角进行比较。行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组化进行组织形态学观察。结果：移植8周时双下肢胫骨角,对照组为(38.80±13.50)°,人工骺板软骨移植组为(9.01±4.2)°;移植24周时对照组为(54.25±18.33)°,人工骺板软骨移植组为 (11.27±5.1)°,对照组与人工骺板软骨移植组相比差异均有显著性（P<0.01）。术后2周,对照组胫骨近端骺板内侧缺损处有骨桥形成,无软骨修复组织;而实验组移植后2周时,骺板缺损区已由软骨修复充填,移植的骺板软骨细胞排列未见层次及柱状排列状态,与正常骺板软骨相邻处分界明显;移植4周以后的骺板软骨细胞开始出现柱状排列状态,层次较明显。移植的骺板软骨Ⅱ型胶原染色阳性。结论：人工骺板软骨应能够修复骺板软骨损伤,效果满意。     

温固化水凝胶的制备和应用

目的 制备出适合于组织工程用的温固化型水凝胶,并将其应用于可注射软骨的建造,观察实验结果,方法 制备不同浓度的水凝胶,并添加不同的物质,测量其凝胶化温度,并把水凝胶用于裸鼠组织工程软骨的建造,注射后4,8和12wk取材,通过大体标本和组织学观察研究软骨的形成情况。结果 250g.L^-1的水凝胶具有恰当的凝胶化温度和能满足要求的力学性能,含钙磷的添加物因溶解度不高,对凝胶的性能未能产生显著影响,此水凝胶用于软骨组织工程,注射后4wk在皮下形成稍硬的结节,8wk后形成的结节质地坚韧,切面色泽亮白,组织学观察4wk即有软骨形成,但不成熟,8wk标本有成熟软骨形成,12wk标本成熟软骨的量进一步增加。结论 温固化型水凝胶凝胶化温度受浓度影响。250g.L^-1水凝胶凝胶化温度为5度,可用于组织工程软骨的建造,并能顺利长出软骨。     

软骨细胞与复合水凝胶的生物相容性研究

目的构建光固化壳聚糖与自固化海藻酸钠复合水凝胶体系,研究其与软骨细胞的体外生物相容性,探索其作为软骨组织工程支架的可行性。方法以三维多孔光固化壳聚糖水凝胶作为细胞的空间载体,利用自固化海藻酸钠水凝胶将软骨细胞胶封入光固化壳聚糖水凝胶支架,构成复合水凝胶-细胞复合体。采用扫描电子显微镜观察光固化壳聚糖的结构形貌以及细胞在支架内部的分布与形态;CCK8法绘制细胞增殖曲线;DAPI细胞核染色荧光显微镜观察细胞核形态变化,判断细胞活性。结果纯光固化壳聚糖水凝胶材料呈孔隙较为均匀一致的多孔结构,平均孔径为300μm左右。复合水凝胶能够模拟天然软骨细胞外基质环境,使细胞保持圆形生长状态;促进成软骨细胞的增殖,具有良好的生物相容性。结论复合水凝胶能够为软骨细胞提供一个类似天然的生活环境,并能够促进其增殖、生长,有望作为软骨组织工程支架应用于软骨缺损修复的实验研究。     

缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架的制备

目的：探讨一种可注射且能缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架的制备方法。方法：使用去污剂-酶化学消化法和层层自组装技术制备缓释TGF-β3 的去细胞软骨微丝,混入温敏型水凝胶后制成缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架,用ELISA试剂盒检测TGF-β3缓释情况;然后再将骨髓间充质干细胞（BMSCs）与复合支架共培养,显微镜下观察细胞生长情况,Western blot法检测Collagen II（Col II）、Aggrecan（AGG）和SOX9表达水平。结果：复合支架在低温状态下为溶胶状态,当温度升高至37 ℃时变为凝胶状态;复合支架中的TGF-β3 可有效缓释25 d左右;BMSCs在复合支架上生长情况良好,细胞呈现类似软骨细胞的形态,Col II、AGG和SOX9 的表达较对照组显著增加（P ＜0.05）。结论：成功制备了一种可注射且能缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架,该支架能较好地诱导BMSCs成软骨分化。     

自体组织工程化软骨组织在体内最佳形成时间的研究

目的研究探讨自体组织工程化软骨在动物自体内最佳形成时间,为临床应用提供理论研究和参数。方法取猪耳廓软骨细胞,与可注射性生物材料Pluronic F127混合形成浓度为50×106/ml细胞－生物材料复合物,接种于猪自体腹外侧壁真皮下,分别在接种后第1、3、6、9、15周取材,从组织学、生化组成对再生软骨组织进行评价。结果第六周形成的软骨组织完全成熟,与正常软骨组织有相似的组织学特性。而第1、3周大部分为未成熟的软骨细胞。各不同时间再生软骨组织中氨基糖氨多糖(GAG)占组织干重的平均百分含量在7.0～9.0之间。第6周形成软骨组织中Ⅱ型胶原含量比第1、3周形成软骨组织中Ⅱ型胶原含量高,和正常耳软骨含量接近。结论利用组织工程技术可在具有免疫功能自体动物内形成软骨组织,确定软骨组织形成的最佳时间为接种后第6周。     

不同方法诱导的兔骨髓间质干细胞对关节软骨缺损修复效果及退化的影响

目的：以兔骨髓间质干细胞为种子细胞, 探讨不同诱导方法对组织工程移植物修复关节软骨缺损的效果及退化的影响。方法：将兔骨髓间质干细胞分为地塞米松诱导组和TGF-β₁加地塞米松联合诱导组进行体外诱导,采用自体组织工程移植物修复关节软骨缺损;对照组缺损填充无细胞单纯载体。于术后6和12周对修复组织进行组织学观察、评分及TUNEL原 位凋亡检测。结果：联合诱导组,修复组织形成理想的柱状结构,术后12周组织学评分(20.26±1.35)优于对照组(4.12±1.13)及地塞米松组(14.521.46),但修复组织未形成潮线。在骨软骨交界处软骨细胞TUNEL染色阳性,地塞米松组术后6周修复组织TUNEL染色阳性细胞记数为21.4±4.5,术后12周为7.3±2.2;联合诱导组术后6周为19.8±4.7,术后12 周为6.9±2.0,术后12周与术后6周比较差异有显著性(P<0.05)。结论：组织工程移植物的修复效果 以联合诱导组为佳,且退化发生较晚;组织工程移植物的退化与移植前诱导条件、细胞凋亡及软骨下骨板内血管系统有关。     

hBMP-2基因转染的MSC与藻酸钙凝胶的生物相容性研究

目的探讨人类骨形态发生蛋白-2（human bone morphogenetic protein-2，hBMP-2）基因转染的兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells.MSC）与藻酸钙凝胶的生物相容性，为骨组织工程中生物材料的选择提供依据。方法应用脂质体介导的方法将真核表达载体pCDNA3介导的质粒pCDNA3-hBMP-2导入体外培养的兔MSC中，免疫组织化学和RT-PCR检测转染后hBMP-2基因的表达；将G418筛选获得的阳性克隆继续扩增培养，与藻酸钙凝胶复合作为实验组，单纯转染的细胞为对照组，在不同的时间行扫描电镜、四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、碱性磷酸酶（ALP）、台盼蓝染色检查。结果免疫组织化学和RT-PCR均证实基因转染成功，4周时仍有表达；转染的MSC与藻酸钙复合良好，并能在其中保持活性，活力未受影响。结论hBMP-2基因转染的MSC能够获得瞬时及稳定表达，是一种新型的种子细胞；其与藻酸钙凝胶复合用于骨缺损的修复具有较强的可行性。     

Epiphyseal and Physeal Cartilage： Normal Gadolinium-enhanced MR Imaging

Jaramilloet al[1] revealed that abnormal perfu sion of the proximal femoral epiphyseal cartilage isdetectable using Gadolinium ( Gd) enhanced MRimaging. His study also indicated that cartilagi nous ischemia may be reversible if detected andcorrected early. We believe that the study of nor mal growth cartilage with Gd enhanced MR ima ging is necessary to further setting up diagnosticstandards for cartilaginous ischemia. In this study,vascular anatomy was d…