钾离子浓度对离体毛细胞凋亡的影响

目的 探讨钾离子浓度对离体毛细胞凋亡的作用.方法 采用胶原酶制备离体耳蜗毛细胞,模拟病理状态下的钾离子浓度(100mmol/L)环境,用倒置显微镜、荧光显微镜下观察毛细胞凋亡改变.结果 病理状态钾环境下离体耳蜗毛细胞的凋亡改变类似于Hank′s液下毛细胞的凋亡改变,即胞核皱缩;纤毛泡状或倒伏;胞质内可见布朗运动.荧光显微镜下凋亡毛细胞呈红色或红黄色荧光,毛细胞形态完整,无胞膜破裂或胞质溢出.随着时间延长毛细胞凋亡数逐步增多,二者凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在离体环境下,此种病理状态下的钾离子浓度(100mmol/L)对离体毛细胞的凋亡无显著性影响.     

离体耳蜗毛细胞凋亡形态及凋亡率

目的探讨离体时相对耳蜗毛细胞的凋亡改变。方法采用胶原酶制备离体耳蜗毛细胞，0．01％吖啶橙进行荧光染色，在倒置显微镜、荧光显微镜和电镜下观察凋亡改变。结果凋亡毛细胞的主要形态特征包括：胞膜完整，有皱折扭曲，双折光现象明显减弱或消失；胞核位置基本正常，有时胞核皱缩；纤毛泡状或倒伏；胞质内可见布朗运动。荧光显微镜下凋亡毛细胞呈红色或红黄色荧光，毛细胞形态完整，无胞膜破裂或胞质溢出。随着离体时间延长，毛细胞凋亡数逐步增多，凋亡率增高。结论离体环境下凋亡细胞有其独特的形态特征，跟活性毛细胞和坏死毛细胞有明显差别；随着离体时间的延长，毛细胞凋亡率逐渐增高。     

丁胺卡那霉素对豚鼠耳蜗毛细胞凋亡及听力阈值的影响

目的探讨丁胺卡那霉素作用于耳蜗系统时毛细胞凋亡现象及其在听力损伤中的作用。方法15只豚鼠随机分为3组,各组肌内注射丁胺卡那霉素400mg·kg-1·d-1,分别于用药1d,3d,6d后处死。处死前检测其听脑于反应(auditorybrainstemresponses,ABR)的变化,并利用光镜和TUNEL标记技术检测耳蜗毛细胞发生凋亡的情况。结果①豚鼠肌内注射丁胺卡那霉素1d后耳蜗毛细胞即出现凋亡现象,连续用药3～6d,毛细胞凋亡呈强阳性表达;②耳蜗毛细胞凋亡出现的早期豚鼠听力阈值无明显改变,连续用药6d后听力阈值则明显提高。结论①丁胺卡那霉素作用于耳蜗毛细胞可引起毛细胞凋亡,细胞凋亡是豚鼠耳蜗毛细胞损伤的一条途径;②丁胺卡那霉素耳毒性作用机制可能与其引起耳蜗毛细胞凋亡有关。     

豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤与细胞凋亡

为探讨椎基底动脉缺血再灌注耳蜗组织损伤方式及可能的损伤机制,采用组织化学方法观察缺血再灌注不同时间点耳蜗各部位的组织学改变;用原位凋亡法观察耳蜗缺血及不同时间段内再灌注的细胞凋亡情况.结果发现椎基底动脉缺血再灌注的不同时间组,毛细胞变形、缺损,血管纹变薄;正常组及假手术组没有或仅有个别部位出现细胞凋亡;缺血及再灌注各组内外毛细胞及螺旋神经节部位凋亡细胞明显增多.说明缺血再灌注损伤能诱发细胞凋亡.     

爆震后豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞定量观察

目的 :观察爆震后耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的变化。 方法 :复制强脉冲噪声致聋豚鼠模型 ,以脑干听觉诱发电位测试仪测定听神经脑干反应 (ABR)阈值 ,通过耳蜗铺片计算机图像分析行毛细胞计数 ,耳蜗病理切片螺旋神经节细胞计数。结果 :正常对照组和噪声暴露后 2 1d的实验组耳蜗钩回、第 1和第 2回毛细胞总数分别为 3 5 99± 15 9.6个 ,6 0 2 2± 98.4个 ;二下螺旋神经节细胞计数分别为 (5 1± 4.72 )个 ,(2 7± 6 .94)个 ,以上均数各组间相差显著。结论 :爆震后不仅 ABR阈值升高 ,毛细胞数减少 ,而且耳蜗螺旋神经节细胞数也明显减少     

水杨酸钠急慢性注射致豚鼠耳蜗形态学的改变

目的 :研究水杨酸钠对豚鼠耳蜗形态学改变的急慢性作用。方法 :采用单次和长期注射水杨酸钠建模分别在光镜、电镜 (扫描、透射 )下观察 1次及多次注射水杨酸钠组和生理盐水对照组豚鼠耳蜗基底膜Corti器 ,特别是外毛细胞形态的改变。结果 :以相应的生理盐水组为对照 ,急性水杨酸钠注射 2h主要引起透射电镜下豚鼠外毛细胞侧壁表面下池发生扩张性空泡形成 ;慢性水杨酸钠注射 2周主要引起豚鼠外毛细胞在透射电镜下出现表面下池肿胀、扩张、空泡形成 ,以及透射和扫描电镜下均出现静纤毛柔软、弯曲。结论 :急慢性水杨酸钠注射引起豚鼠耳蜗形态学改变可能为耳蜗功能改变的原因 ,为临床阿斯匹林诱导耳鸣及导致耳聋提供了形态学改变的实验依据     

补肾剂对耳聋豚鼠耳蜗细胞凋亡的影响

[目的]观察金匮肾气丸对庆大霉素(GM)造成药物性耳聋豚鼠耳蜗细胞凋亡干预效果并探讨其作用机理。[方法]将30只豚鼠随机分为三组,正常组、模型组、治疗组,每组动物各10只。治疗组、模型组豚鼠按100mg/(kg·d)每天注射庆大霉素,治疗组在每天注射庆大霉素后灌服金匮肾气丸药剂,两组连续10d;正常组,注射生理盐水10d。10d后三组豚鼠断头处死,取耳蜗标本。观察指标:TUNEL染色的阳性率和电镜组织学观察。[结果]治疗组与模型组比较,治疗组耳蜗神经节、Corti器、侧壁等部位凋亡细胞明显减少(P<0.05和P<0.001)。[结论]金匮肾气丸对庆大霉素所致豚鼠听力损失有一定治疗作用,但未能使豚鼠听力恢复正常。     

链霉素,庆大霉素和卡那霉素对豚鼠单个离体毛细胞活性影响？…

为比较氨基甙类抗生素对豚鼠单个离体外毛细胞和前庭毛细胞的影响，用酶解加机械分离方法获得单个离体的外毛细胞和前庭毛细胞，置于分别含有１ｍｍｏｌ／Ｌ的链霉素和卡那霉素的培养淮中短期培养，并以ＦＤＡ－ＰＩ双染色法鉴定细胞活性。结果发现在公含上述药物的培养液中，细胞活性无明显改变，而在无钙、镁培养液中３种响较强。临床上链霉素可首选用于经外淋巴灌流治疗梅尼埃病。     

链霉素、庆大霉素和卡那霉素对豚鼠单个离体毛细胞活性影响的比较

为比较氨基甙类抗生素对豚鼠单个离体外毛细胞和前庭毛细胞的影响, 用酶解加机械分离方法获得单个离体的外毛细胞和前庭毛细胞,置于分别含有１ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ的链霉素、庆大霉素和卡那霉素的培养液中短期培养,并以ＦＤＡ－ＰＩ双染色法鉴定细胞活性。结果发现在仅含上述药物的培养液中, 细胞活性无明显改变, 而在无钙、镁培养液中３ 种药物均可引起细胞形态和活性的改变,其中链霉素和庆大霉素对前庭毛细胞活性影响较大,卡那霉素对外毛细胞活性影响较强。临床上链霉素可首选用于经外淋巴灌流治疗梅尼埃病     

顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞的损伤及凋亡作用

目的建立新生昆明小鼠离体顺铂耳毒性模型,研究顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞的损伤及凋亡作用。方法分离生后3d的昆明小鼠耳蜗基底膜,在含有1%牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基中进行培养。采用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色方法观察不同浓度顺铂对小鼠耳蜗毛细胞的损伤,同时应用Hoechst 33258染色技术检测耳蜗毛细胞的凋亡。结果不同浓度顺铂均可使小鼠耳蜗毛细胞发生凋亡的形态学变化。顺铂浓度为4mg·L-1时,耳蜗毛细胞缺失率和凋亡率明显增大,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。随着顺铂浓度的增高(8～64mg·L-1),耳蜗毛细胞缺失率和凋亡率亦显著增大,呈现明显的量效关系(P<0.01)。结论应用新生昆明小鼠能建立可靠的离体顺铂耳毒性模型;顺铂可导致耳蜗毛细胞凋亡,提示凋亡可能是顺铂耳毒性机制之一。     

模拟载人飞船内微重力和噪声环境下大鼠耳蜗毛细胞的形态学变化

目的：观察模拟载人飞船中微重力和噪声环境下大鼠耳蜗毛细胞的形态学特点,探讨耳蜗三回（底回、中回和顶回）毛细胞的不同变化。方法： 选取32只雄性健康SD大鼠,随机分为空白组、失重组、噪声组和失重+噪声组4组,每组8只。失重组以持续尾吊法模拟微重力,噪声组以持续2周的（72±2） dB SPL的稳态噪声及之后的3次高达160 dB SPL的脉冲噪声模拟飞船内复合噪声环境,失重+噪声组同时给予模拟微重力和噪声环境,空白组不做任何处理,常规饲养2周。暴露后检测听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）阈值,处死大鼠即刻取耳蜗基底膜行免疫荧光及扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）观察。 结果： 给予模拟环境暴露后,各组大鼠ABR阈值升高,各实验组大鼠暴露前后ABR阈值差异均有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光结果显示：失重组底回以内毛细胞缺失为主,中回可见毛细胞肿胀,顶回毛细胞杂乱不清。噪声组底回以外毛细胞缺失为主,多见于最外层毛细胞,中回毛细胞肿胀,顶回杂乱并有毛细胞的缺失。失重+噪声组底回核缺失较明显,主要存在最外层毛细胞,内毛细胞也存在较多缺失。中回和顶回缺失发生在最内层外毛细胞。电子显微镜观察发现失重组底回纤毛大片倒伏,偶有缺失,顶回和中回毛细胞纤毛无明显异常。噪声组底回纤毛大片倒伏伴缺失,顶回和中回均有缺失,其中顶回最为严重。失重+噪声组底回纤毛大片融合伴缺失,中回纤毛融合、倒伏并缺失,顶回内外毛细胞纤毛大量缺失。4组的损伤程度：失重+噪声组>噪声组>失重组>空白组;三回毛细胞损伤程度：底回>中回>顶回。 结论： 模拟载人飞船内微重力和噪声环境中暴露2周可致大鼠耳蜗形态学结构发生显著变化,尤以失重+噪声组变化最明显,三回毛细胞中以底回最重,顶回最轻。     

生精细胞的体外培养

目的：在体外培养中,观察精原细胞的增殖、分化和形态变化规律。方法：用胶原酶、透明质酸酶和胰蛋白酶分次消化法制取睾丸组织的细胞悬液．密度梯度离心法富集生精细胞,贴壁培养后观察生精细胞的存活、分裂和形态变化,并行Annexin V—FITC／PI染色,采用激光共聚焦扫描显微镜检测细胞的凋亡情况。结果：睾丸组织细胞悬液中的体细胞在培养中较早贴壁,胞质形成多个突起;精原细胞贴壁较迟．贴壁后呈规则的圆形或卵圆形,以链状或团块状位于体细胞层之上,细胞分裂不完全,相互间以细胞间桥相连。Annexin V—FITC／PI染色显示,培养第2天时精原细胞已出现凋亡,但数量极少,后逐渐增多。结论：在本实验所提供的体外培养条件下,精原细胞能够存活并发生贴壁、分裂、分化等行为,但同时也有细胞凋亡。     

万古霉素对体外培养小鼠耳蜗毛细胞影响的实验研究

目的:通过内耳器官离体培养技术来观察万古霉素对体外培养耳蜗毛细胞的影响,探讨万古霉素耳毒性.方法:选用生后2～4 d的昆明小鼠做为实验对象,应用鼠尾胶包埋法离体培养耳蜗基底膜,通过若单明-鬼笔环太染色技术定量观察不同浓度的万古霉素对耳蜗毛细胞的影响.结果:给予万古霉素后的离体耳蜗内、外毛细胞未发生坏死和缺失,毛细胞密度与正常对照组无差别.结论:万古霉素对体外培养的小鼠耳蜗毛细胞无损伤作用.     

白细胞介素-1对新生大鼠内耳毛细胞再生能力的影响

目的通过在新生SD大鼠毛细胞培养液中加入P27抑制剂白细胞介素-1（IL-1）,观察IL-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶/细胞周期蛋白D（CDK4/cyclinD）复合体表达增强对毛细胞再生能力的影响。方法提取16只7 d龄SD大鼠的内耳基底膜上皮细胞层,按数字表法随机分为对照组（8只）和IL-1组（8只）,离体培养。观察培养第7天、第14天细胞生长情况,通过免疫组织化学方法检测毛细胞内CDK4、cyclinD的表达。结果培养第7天,40倍光镜下3个随机视野内IL-1组毛细胞细胞球数量（139.33±13.50）个,与对照组[（69.00±12.49）个]相比明显增多,差异有统计学意义（P〈0.05）;培养第14天,毛细胞细胞球数量仍然有增多趋势,但与对照组相比差异无统计学意义（P〉0.05）。免疫组织化学结果显示,IL-1组毛细胞内CDK4和cyclinD表达增强,与对照组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）;CDK4和cyclinD阳性细胞率[分别为（48.23±8.87）%和（28.43±1.34）%]增高,与对照组[分别为（35.03±1.94）%和（17.43±2.20）%]相比差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 IL-1可能对新生大鼠毛细胞的再生有一定的促进作用。     

天花粉蛋白对A549细胞增殖和细胞凋亡的影响

目的 观察天花粉蛋白对人肺腺癌细胞株A549生长增殖的影响和在体外诱导A549肺腺癌细胞凋亡的效果.方法 应用MTT法检测栝萎中提取的天花粉蛋白对A549细胞生长增殖的影响,DNA Ladder凝胶电泳及流式细胞术检测天花粉蛋白对A549细胞的诱导凋亡作用.结果 经天花粉蛋白处理后A549细胞生长明显受抑,并呈一定的剂量时效依赖性;流式细胞仪直方图出现明显的亚二倍体峰,经TCS(40 μg/ml)处理48 h、72 h后A549细胞的凋亡率分别为(27.00±2.08)%和(39.43±4.92)%,均高于顺铂组(2 μg/ml)(P＜0.01).结论 天花粉蛋白在体外能抑制A549肺腺癌细胞的生长繁殖,并能诱导该细胞发生凋亡.     

骨髓间充质干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞的研究

目的 探索大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化成内耳毛细胞前体细胞的过程,以期为耳蜗MSCs移植提供实验依据.方法 采用贴壁法提取SD大鼠MSCs,体外培养纯化.分别以EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA、EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3作为诱导条件,诱导MSCs分化.观察诱导组及对照组细胞形态的变化,并采用免疫细胞染色法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异性抗原myosinVI、Pax-2、nestin、p27kip1的表达.结果 EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA诱导组细胞呈短梭形样、方形样,未形成突触;myosin VI、Pax-2、nestin、p27kpi1均有不同程度阳性表达.EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3诱导组细胞变圆或变细长,逐渐伸出突触,部分形成网络状、大环状结构;nestin、p27kpi1均呈阳性表达.结论 大鼠MSCs在体外培养诱导分化后,可形成内耳毛细胞前体细胞和神经前体细胞.     

哺乳动物内耳再生毛细胞前体细胞来源研究

目的探讨哺乳动物内耳再生毛细胞前体细胞的可能来源。方法取出生1d大鼠的椭圆囊,嗜热菌蛋白酶处理,消化法原代培养。在倒置显微镜下,对椭圆囊感觉上皮细胞（USEC）的形态、生长特征进行观察;透射电镜及免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18、波形蛋白;免疫细胞化学法及RT—PCR检测支持细胞标记物p27kipl mRNA及毛细胞的特征性标记物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Vlla mRNA的表达,进而鉴定USEC上皮细胞来源。结果原代培养的USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞问连接紧密,形成单层时呈“铺路石样”外观,可见“dome”结构;表达细胞角蛋白,但不表达波形蛋白,细胞微绒毛丰富,细胞问连接紧密。原代培养的USEC表达支持细胞标记物p27kipl mRNA及毛细胞的特征性标志物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Vlla mRNA。结论原代培养的USEC可以产生毛细胞样细胞,而且能表达支持细胞标记物,表明其来源为支持细胞。椭圆囊感觉上皮的支持细胞可能是毛细胞再生的前体细胞之一。     

毛囊外根鞘细胞的分离培养及鉴定

目的建立毛囊隆突处外根鞘细胞的分离和培养方法。方法利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊,采用胰酶消化法进行细胞培养,倒置6显微镜观察细胞形态,绘制细胞生长增殖曲线,免疫荧光检测干细胞相对特异性标识分子角蛋白19(K19)和β1整合素表达情况,分别用分离培养的角质形成细胞(Keratinocytes,KCs)做对照。结果免疫荧光检测显示90%左右的毛囊外根鞘细胞胞浆中均有K19和β1整合素的阳性表达。结论应用中性蛋白酶和胰酶消化法体外培养毛囊隆突处外根鞘细胞简单、可行。