SCL基因在白血病患者骨髓基质细胞中的表达

为了解白血病干细胞 (stemcellleukemia ,SCL)基因在白血病骨髓基质细胞 (BMSC)及骨髓细胞中的表达情况 ,收集 18例急性髓系白血病 (AML)、17例慢性粒细胞白血病 (CML)、7例急性淋巴细胞白血病 (ALL)和 33例正常骨髓标本的单个核细胞 (MNC)进行体外长期培养 ,分别收集悬浮细胞 (造血细胞 )和扩增后的贴壁细胞 (BMSC)。运用RT PCR ELISA检测SCL基因的表达 ,分析表达率 ,并以管家基因 β2 微球蛋白 (β2 M)为内参照进行半定量分析。结果发现 ,SCL基因在AML(2 7.8% )和CML(11.8% )的BMSC中的表达率均低于正常对照组 (6 9 7% ,P <0 .0 5 )。SCL基因在CML骨髓造血细胞中的表达率 (6 4 .3% )高于其对应的BMSC(P <0 .0 5 )。半定量分析SCL基因在AML骨髓造血细胞中的表达水平显著高于其对应的BMSC(P <0 .0 5 )。结论 :SCL基因在AML和CML的BMSC中的相对低表达状态可能与血液病造血调控的异常有关。     

白血病骨髓基质细胞中GATA-1和GATA-2基因的表达特点

为了解转录因子GATA-1和GATA-2基因在白血病和正常骨髓基质细胞(BMSC)中表达的情况,采集了42例白血病患者的骨髓标本及34例正常骨髓标本并分离骨髓单个核细胞,在体外扩增培养后收集悬浮细胞(骨髓细胞)和扩增后的贴壁细胞(BMSC),应用RT-PCR-ELISA方法分别检测GATA-1和GATA-2基因的表达情况,并对其相对表达水平进行半定量分析.结果发现,GATA-1和GATA-2基因在正常和白血病的BMSC和骨髓细胞中均有一定的表达.在BMSC中急性淋巴细胞白血病(ALL)组的GATA-1基因表达率(857%)与正常组(882%)相近,而急性髓性白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)组的GATA-1表达率(55.6%和41.2%)均比正常组低(P=0.008,0.000),且ALL的BMSC中GATA-1基因表达水平＞AML＞正常＞CML(P均＜0.05);而各白血病组BMSC中GATA-2的表达率和表达水平与正常组相比均无显著性差异(P均＞0.05).骨髓细胞中AML组的GATA-1基因表达水平＞正常＞ALL＞CML,AML组的GATA-2基因表达水平＞CML＞ALL＞正常(P均＜0.05).AML、CML和正常组的BMSC和骨髓细胞中均以GATA-2的表达占优势.可以推论,转录因子GATA-1和GATA-2基因在正常和白血病BMSC的表达可能影响骨髓微环境的造血调控作用.是否对白血病的发生发展有一定的影响也值得进一步探索.     

骨髓长期培养及其在自体骨髓移植中的应用

由于目前还不清楚白血病细胞通常不能存活的原因,因此骨髓长期培养(LTBMC)能否作为白血病患者自体骨髓移植前骨髓净化的一种手段,是本文探讨的目的。一、白血病细胞在LTBMC中的生长特点 1985年Coulombel等首次报导AML患者骨髓细胞经LTBMC后,白血病细胞明显减少,而使正常造血细胞占优势;另外,Ph′阳性的CML细胞经3～4周的LTBMC后可产生明显数量的ph′阴性细胞。本文作者的实验结果也证实了这一发现,他们培养AML患者骨髓细胞,其中50％的病例的白血病细胞     

骨髓增生异常综合征患者骨髓基质细胞IL-32mRNA表达及其与细胞凋亡的相关研究

目的:探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓基质细胞IL-32 mRNA的表达及其与骨髓单个核细胞凋亡的相关性。方法:收集山东大学附属济南市中心医院26例MDS患者和10例缺铁性贫血(IDA,对照组)患者骨髓液,分离骨髓单个核细胞,分离培养骨髓基质细胞,采用RT-PCR检测骨髓基质细胞中IL-32 mRNA表达,采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测骨髓单个核细胞凋亡情况,采用直接免疫荧光标记全血溶血法,流式细胞术检测患者骨髓淋巴细胞及NK细胞计数情况。结果:MDS患者骨髓基质细胞IL-32 mRNA表达显著性高于对照组,RA、RAS及RCMD患者骨髓基质细胞IL-32 mRNA表达显著高于RAEB(P0.05),而RAEB与对照组之间无显著差异。MDS组骨髓单个核细胞凋亡率显著高于对照组(P0.05),RA、RAS及RCMD患者骨髓单个核细胞凋亡率均显著高于RAEB(P0.05),RAEB与对照组之间无显著差异。MDS患者细胞凋亡与骨髓基质细胞IL-32 mRNA表达显著相关(r=0.870)。M DS患者骨髓中NK细胞数量与对照组无显著差异。结论:骨髓基质细胞IL-32 mRNA的表达与M DS细胞凋亡显著相关,骨髓基质细胞分泌IL-32可能是M DS骨髓细胞凋亡的原因之一,推测MDS骨髓微环境异常参与了骨髓细胞的凋亡。     

急性白血病患者骨髓基质造血微环境的某些异常

为了探索人白血病骨髓造血微环境的异常所在,本实验采用胶体金标记及银增染的免疫电镜方法,检测了急性白血病患者及正常人骨髓长期培养的基质细胞某些生长因子、粘附分子及细胞外基质的表迭情况。结果表明,急性白血病患者长期培养的基质细胞表迭的GM-CSF(粒-巨噬系集落刺激因子)较对照组高,淋巴细胞扫巢相关粘附分子(HCAM),血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)较对照组低,纤连蛋白(Fn)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)与对照组无差别。结论 提示急性白血病患者骨髓长期培养的基质细胞某些生长因子和粘附分子表达异常。     

Chfr基因在急性白血病骨髓细胞中表达的研究

为了探讨急性白血病（AL）患者骨髓细胞中有丝分裂早期检查点Chfr基因的表达及其意义，对46例初诊未治疗的AL患者骨髓单个核细胞，用RT—PCR和免疫组织化学的方法检测Chfr基因mRNA及蛋白的表达，并与正常人骨髓单个核细胞进行对照。结果表明：免疫组织化学和RT—PCR分析显示。28例急性髓细胞白血病（AML）中的15例，18例急性淋巴细胞白血病（ALL）中的13例骨髓单个核细胞Chfr基因mRNA和蛋白的表达与正常对照相比显著下降，同时Chfr基因表达异常病例染色体检查存在核型异常。结论：急性白血病骨髓细胞有丝分裂检查点Chfr基因表达受损，可能在白血病发病中具有重要作用。     

实时定量PCR检测人白血病细胞hTERT mRNA的临床意义

目的利用实时荧光定量RT-PCR方法,检测白血病细胞人类端粒酶反转录酶(hTERT)的表达水平并探讨其临床意义。方法采用基于TaqMan荧光技术的实时定量RT-PCR方法检测白血病患者骨髓单个核细胞及10种白血病细胞系hTERT mRNA拷贝数,来自同种基因移植供者的正常人骨髓细胞作为对照。结果与28例正常人组相比,33例AML1/ETO融合基因阳性的急性髓性白血病(AML)患者骨髓细胞hTERT mRNA水平较高,中位数分别为8.96%(0.23%～76.73%)和4.20%(0.21%～19.90%)(P<0.01)。47例B-ALL患者骨髓细胞hTERT mRNA水平中位数为20.80%(0.25%～1566.34%),高于正常人组(P<0.001)及156例AML组(中位数为2.06%,范围为0～2133.41%)。70例慢性髓性白血病(CML)、36例M3型白血病患者hTERT mRNA水平中位数分别为0.57%(0～14.77%)、0.53%(0～11.10%),均低于正常人组(P均<0.001)。15例治疗后达到完全缓解的急性白血病患者与初治时相比,hTERT mRNA水平明显下降,中位数分别为46.53%(8.96%～218.10%)和2.25%(0.18%～45.85%)(P<0.001)。10种白血病细胞系的hTERT mRNA水平差异甚大。结论 hTERT mRNA在人白血病细胞中的表达水平存在异质性。高表达hTERT mRNA可能是B-ALL及AML1/ETO阳性的AML发病机制中的因素之一。     

胰岛素样生长因子Ⅰ型受体在恶性血液病骨髓有核细胞的表达及其抗凋亡作用

为探索胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-IR)在骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓细胞白血病(AML)骨髓有核细胞表面的表达及其与细胞凋亡的关系,收集MDS和AML患者各16例骨髓有核细胞,经离心涂片机制片,用免疫酶标记方法(APAAP)及TdT凋亡检测(TUNEL)法先后在同一标本上检测IGF-IR表达和凋亡信号,并以16名正常人骨髓有核细胞作对照.结果显示①MDS组骨髓细胞IGF-IR表达[(56.8±14.3)%]高于正常对照[(40.4±9.6)%](P＜0.01),AML组骨髓细胞IGF-IR表达[(86.8±13.8)%]高于正常对照(P＜0.01),AML骨髓细胞IGF-IR表达高于MDS骨髓细胞(P＜0.01);②MDS组骨髓细胞凋亡率为[(5.4±3.0)%]高于正常对照[(1.2±0.9)%](P＜0.01),AML组骨髓细胞凋亡率为[(0.3±0.4)%]低于正常对照(P＜0.01),MDS组细胞凋亡率明显高于AML组(P＜0.01);③细胞凋亡主要发生在IGF-IR阴性细胞[(9.0±4.8)%],IGF-IR阳性细胞中凋亡细胞仅占[(1.4±2.4)%](P＜0.01),IGF-IR表达与细胞凋亡呈负相关(r=-0.852;P＜0.01);④MDS骨髓细胞IGF-IR表达阳性率RAEB/RAEB-t/CMML组高于RA/RAS组,分别为(64.1±3.2)%和(53.5±16.2)%,但差异无显著性,细胞凋亡率RAEB/RAEB-t/CMML组低于RA/RAS组,分别为(3.1±2.1)%和(6.4±2.8)%,(P＜0.05);⑤MDS和AML中IGF-IR阳性率与原始细胞百分比存在明显的正相关(r=0.677;P＜0.01).结论MDS和AML造血细胞过度表达IGF-IR.IGF-IR表达增高可能预示造血细胞的恶性增殖倾向并通过某种途径抑制细胞凋亡.如果能证实此点,则抗IGF-IR治疗有希望成为治疗MDS和AML的新方法.     

白血病中FHIT基因的异常表达和缺失

FHIT基因位于染色体 3p14 .2 ,实验室的研究证实FHIT基因具有抑癌基因活性。FHIT基因异常表达或表达缺失出现在多种实体肿瘤和造血系统恶性疾病。为了探讨白血病细胞中FHIT基因的异常表达及意义 ,采用巢式RT PCR法对急性髓性白血病 (AML)、急性淋巴细胞白血病 (ALL)、慢性粒细胞白血病 (CML)以及骨髓增生异常综合症 (MDS)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、骨髓瘤 (MM )等不同类型白血病患者FHIT基因转录本进行检测 ,并对FHIT基因转录本进行序列测定。 98份血液系统恶性疾病患者的骨髓或外周血标本中AML 38例 ,ALL16例 ,CML 34例 ,其它恶性血液病 10例。全部患者经骨髓细胞形态检查 ,诊断符合FAB诊断标准。肝素抗凝骨髓或外周血 2 - 3ml,分离单个核细胞 ,取 5× 10 7个细胞 ,用RTIZOL 试剂一步法提取细胞总RNA ,行PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。回收目的片段 ,克隆到PGEM T载体 ,进行序列测定。结果表明 :在 5 5 / 98(5 6 % )的被检测病例有FHIT基因的异常表达 ,在AML、ALL和CML异常表达的发生率分别为 2 2 / 38(5 8% ) ,9/ 16(5 6 % )和 19/ 34(5 6 % )。正常骨髓或外周血标本未见有FHIT基因的异常表达。 4 3/ 98(44 % )的患者表达正常转录本 (Ⅰ型 ) ,4 0 / 98(41% )的患者同时表达正常转录本和异常     

As2O3影响慢性粒细胞白血病细胞VEGF,MMP-2 mRNA表达的实验研究

目的研究As2O3对慢性粒细胞白血病（CML）骨髓单个核细胞，血管内皮生长因子（VEGF），基质金属蛋白酶2（MMP-2）mRNA及培养上清VEGF蛋白表达的影响作用，从而对白血病的发病机制及As2O3的作用机制进行探讨。方法用RT—PCR技术检测20例CML患者与5例正常人骨髓细胞MMP-2，VEGFmRNA的表达。用ELISA方法检测20例CML患者骨髓单个核细胞经As2O3作用前、后培养上清液VEGF水平的变化，用RT—PCR法检测VEGF，MMP-2mRNA表达阳性患者骨髓单个核细胞mRNA含量的变化。结果CML患者VEGF，MMP-2mRNA水平明显高于正常对照者，5&#215;10^-6mol／L As2O3可明显下调CML患者骨髓单个核细胞培养上清VEGF蛋白的表达（P〈0．05）；As2O3对骨髓单个核细胞VEGF，MMP-2mRNA的表达有下调作用，并为剂量依赖性。结论CML中VEGF与MMP-2mRNA表达异常增高。As2O3下调白血病细胞VEGF，MMP-2的表达可能是其抗白血病作用的机制之一。     

川芎嗪改善免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓微环境作用的研究

目的：探讨川芎嗪对再生障碍性贫血（再障）骨髓微环境的作用及其机制。方法：建立免疫介导的再障小鼠模型，胃饲川芎嗪注射液每次４ｍｇ，１天２次，第１０天用氧分压传感针测定活体尺骨中段骨髓氧分压（ＰｂＯ２），再观察其骨髓切片组织学，体外成纤维细胞集落形成单位（ＣＦＵ－Ｆ），培养基质细胞层的粘附能力。结果：川芎嗪组ＰｂＯ２为１０．３２±１．２７ｋＰａ，显著高于再障组（４．３２±２．８６ｋＰａ），Ｐ＜０．００１。再障组骨髓微血管扩张、断裂、瘀血，造血组织容量百分率为２４．９％±９．６％，ＣＦＵ－Ｆ为１２．５±７．３／２×１０６骨髓有核细胞（ＢＭＮＣ）。川芎嗪组骨髓微血管较清楚、完整，无断裂及瘀血，造血组织容量百分率为５２．８％±１５．６％，ＣＦＵ－Ｆ为３１．５±１０．６／２×１０６ＢＭＮＣ。川芎嗪组体外培养基质细胞粘附正常小鼠骨髓有核细胞的能力为７２．７％±７．８％，与正常组（７３．４％±３．４％）无差异，明显高于再障组（５６．２％±９．８％），Ｐ＜０．０１。结论：川芎嗪能促进再障小鼠骨髓微血管的修复，增加对骨髓的供氧，促进骨髓基质细胞生长及其粘附功能。川芎嗪通过改善骨髓微环境而使骨髓造血细胞增生。     

视黄酸诱导小鼠骨髓基质细胞c-fos，c-jun和GM-CSFmRNA表达

为了探讨维生素A(VA)对造血微环境调节的机理,采用体外培养和原位杂交技术动态检测全反式视黄酸(ATRA)诱导小鼠骨髓基质细胞(BMSC)30,60和120分钟后c-fos,c-jun及GM-CSF mRNA的表达。结果表明:①ATRA处理30分钟后c-fos和c-jun的表达即有增强,与对照组相比有显著差异(P<0.01),并持续表达至60分钟和120分钟时降至对照组水平;②GM-CSFmRNA的表达在30分钟和60分钟时与对照组水平相比无显著性差别,直至120分钟才表现出显著性差异(P<0.01)。实验结果提示:VA对造血微环境调节的机理可能是通过诱导BMSC中c-fos和c-jun mRNA的表达进而调控造血生长因子GM-CSF的分泌。     

长期培养的人骨髓基质细胞中有关造血调节的粘附蛋白表达的研究

目的：研究骨髓基质细胞支持造血的分子基础。方法；应用免疫胶体金单标和双标记技术，在长期培养的骨髓基质细胞（HLTBMC）粘附层中，对各种造血调节有关的粘附蛋白进行了免疫电镜定位。结果：长期培养的骨髓基质细胞上均可显示各种粘附蛋白的表达，一些双标记证明各种粘附蛋白与某些细胞的特异性标记（vWF和Fb-sp）是共存的，表明在HLTBMC中的内皮细胞和成纤维细胞可合成和分泌各种粘附蛋白，这些粘附蛋白结合在基质细胞表面膜和细胞外基质上，结论：粘附蛋白与基质细胞分泌的各种生长因子一起，构成了一个支持造血的复杂网络，是基质细胞支持造血的分子基础。     

CRIF1介导白血病骨髓基质细胞诱导Jurkat细胞周期阻滞的探讨

目的研究白血病骨髓基质细胞对白血病细胞周期分布的影响及其可能机制。方法分离培养原代正常和白血病骨髓基质细胞体外模拟骨髓微环境功能,与Jurkat细胞共培养后,检测Jurkat细胞周期分布情况;抑制性消减杂交技术筛选和分析与白血病骨髓基质细胞共培养24 h后Jurkat细胞差异表达基因;RT-PCR技术验证目的基因的表达水平。结果成功分离培养正常和白血病骨髓基质细胞,体外与Jurkat细胞共培养24 h后,Jurkat细胞周期阻滞("G0/G1"期)细胞数明显升高(P<0.05);抑制性消减杂交试验发现,与白血病骨髓基质细胞共培养24 h后Jurkat细胞上调表达30个基因克隆、下调表达22个基因克隆;RT-PCR验证发现,与白血病骨髓基质细胞共培养24 h后,Jurkat细胞高表达CRIF1基因。结论白血病骨髓基质细胞诱导Jurkat细胞周期阻滞("G0/G1"期),可能部分通过高表达CRIF1实现。     

川芎嗪对BMT后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响

本研究探讨川芎嗪对骨髓移植（BMT）后小鼠骨髓基质细胞bFGF表达水平的影响及其促进骨髓造血重建的机制。取健康BALB／c小鼠，随机分为3组：正常组（不做处理），BMT＋生理盐水组（简称生理盐水组）和BMT＋川芎嗪治疗组（简称川芎嗪组）。生理盐水组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水0．2毫升／只和川芎嗪注射液每次2毫克／只，2次／天，直至处死为止。在BMT后第7、14、21、28天处死小鼠，用RT—PCR和Western blot方法检测骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白表达水平。结果表明：BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组骨髓基质细胞bFGF mRNA及其蛋白的表达均明显低于正常组（P〈0．01或P〈0．05），但川芎嗪组明显高于生理盐水组（P〈0．01或P〈0．05），到第28天，川芎嗪组bFGF mRNA及其蛋白的表达已恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异（P〈0．01）。结论：川芎嗪可能通过增加bFGF的表达水平而促进骨髓微环境的修复，加速BMT后骨髓的造血重建。     

多西环素诱导表达下IL-3基因转染小鼠骨髓基质细胞促进造血

本研究探讨用多西环素调控IL-3基因表达的小鼠骨髓基质细胞系对小鼠造血干细胞增殖分化的促进作用。构建含小鼠IL-3基因逆转录病毒载体系统，转染小鼠骨髓基质细胞系，获得QXMSClTet-on-IL-3；体外加入多西环素诱导IL-3基因表达并检测IL-3表达活性；观察细胞培养条件上清液对造血祖细胞集落形成单位的作用及QXMSClTet-on-IL-3与骨髓细胞共培养对造血干细胞增殖分化的影响。结果表明：多西环素提高了QXMSClTet-on-IL-3细胞系IL-3的表达，促进骨髓造血祖细胞克隆形成数；与骨髓细胞共培养可促进造血干细胞的增殖分化。结论：应用多西环素诱导外源基因转染的骨髓基质细胞IL-3的表达，可促进造血。     

SDF-1/CXCR4在骨髓增生异常综合征患者中的生物学作用

本研究主要探讨骨髓增生异常综合征(MDS)及白血病患者中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在细胞凋亡、迁移和黏附中的作用及相关的信号转导。选取37例初发MDS患者〔低危组(IPSS≤1.0)22例,高危组(IPSS≥1.5)15例〕、10例初发白血病患者及14例良性贫血患者(作为对照组),通过流式细胞术检测骨髓CD34+细胞表面CXCR4的表达水平及CD34+细胞的凋亡情况。选取4例低危MDS患者和5例高危MDS患者,通过微孔细胞迁移实验检测SDF-1对细胞的趋化作用。通过CCK-8法检测SDF-1对细胞之间黏附能力的影响。结果表明,低危MDS组骨髓内CD34+细胞的凋亡率明显高于高危MDS组(21.33%vs 7.27%,p<0.001),同样低危MDS组骨髓内CD34+细胞的凋亡率明显高于白血病组(21.33%vs 7.53%,p<0.001),未发现CD34+细胞的凋亡率与患者年龄性别有相关性。SDF-1能够促进高表达CXCR4患者的细胞黏附于基质细胞并能诱导该细胞的迁移,诱导细胞形态发生极化,上述作用可以被G蛋白抑制剂pertussis toxin、PI3K抑制剂wortmannin及CXCR4拮抗剂AMD3100明显抑制;而对低表达CXCR4的患者细胞则无上述抑制作用。结论:SDF-1/CXCR4通过PI3K信号通路提高细胞的迁移及黏附能力,发挥抗凋亡作用,上述作用可以被PI3K途径抑制剂和G蛋白抑制剂所阻断。     

Hematopoietic microenvironment. Origin, lineage, and transplantability of the stromal cells in long-term bone marrow cultures from chimeric mice.

Studies of bone marrow transplant patients have suggested that the stromal cells of the in vitro hematopoietic microenvironment are transplantable into conditioned recipients. Moreover, in patients with myeloproliferative disorders, all of the stromal cells, which include presumptive endothelial cells, appear to be derived from hematopoietic precursors. To confirm these findings, we have constructed two chimeric mouse models: (a) traditional radiation chimeras, and (b) fetal chimeras, produced by placental injection of bone marrow into genetically anemic Wx/Wv fetuses, a technique that essentially precludes engraftment of nonhematopoietic cells. Using two-color indirect immunofluorescence, the stromal cells in long-term bone marrow culture derived from these chimeras were analyzed for donor or host origin by strain-specific H-2 antigens, and for cell lineage by a variety of other specific markers. 75-95% of the stromal cells were shown to be hematopoietic cells of the monocyte-macrophage lineage, based upon donor origin, phagocytosis, and expression of specific hematopoietic surface antigens. The remaining 5-25% of the stromal cells were exclusively host in origin. Apart from occasional fat cells, these cells uniformly expressed collagen type IV, laminin, and a surface antigen associated with endothelial cells. Since these endothelial-like cells are not transplantable into radiation or fetal chimeras, they are not derived from hematopoietic stem cells. The contrast between our findings and human studies suggests either unexpected species differences in the origin of stromal lineages or limitations in the previous methodology used to detect nonhematopoietic stromal cells.