聚乙烯亚胺对A549细胞基因转导和毒性作用研究

目的探讨其聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)在转导浓度下对肿瘤细胞的毒性作用。方法以PEI为载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)报告基因转入A549肺癌细胞,应用台盼蓝染色法和四甲基偶氨唑盐(MTT)法研究不同浓度PEI下A549肺癌细胞的存活率。结果粒径86.9 nm PEI 4μg介导2μg的DNA对肺癌A549细胞的转染率最高(29%),与其余转染梯度相比有统计学差异(P<0.05);台盼蓝染色法检测和MTT法检测不同浓度PEI纳米凝胶下肺癌A549细胞的存活率与对照组间的差异无统计学意义,不同浓度间亦无差异。结论PEI是有效安全的基因转导载体。     

聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因修复老年大鼠的股骨骨折

目的：为避免病毒载体带来的安全隐患，利用新型的非病毒载体聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因，观察其对老年大鼠骨折愈合过程的影响，以寻找能够有效促进老年骨折愈合的基因治疗方法。 方法：实验于2006—04／2007—04在解放军第二军医大学细胞生物学实验室和实验动物中心完成。①实验分组：取雄性SD大鼠24只，其中20月龄18只随机分为基因治疗组、生理盐水组和空白对照1组3组，4月龄6只为空白对照2组。②实验方法：所有大鼠建立股骨骨折模型，1周后基因治疗组骨折断端经皮注射聚乙烯亚胺和骨形态发生蛋白7基因转染试剂250μL，生理盐水组断端经皮注射相同体积生理盐水，其他2组不加处理。③观察指标：骨折第8周摄X射线片，然后取标本行组织病理切片、I型胶原免疫组化染色，观察各组骨折愈合情况。 结果：24只大鼠均进入结果分析。骨折第8周4月龄大鼠骨折基本愈合，3组老年大鼠骨折均未完全愈合，但X射线片、苏木精-伊红染色和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色结果显示，与生理盐水组和空白对照1组相比，基因治疗组骨痂明显增多、骨痂骨化过程提前，Ⅰ型胶原染色深、面积较大，说明愈合速度加快、愈合能力改善。 结论：20月龄老年大鼠骨折愈合过程明显延缓，聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白7基因体内转染的方法可以增强老年大鼠骨折修复能力、促进老年大鼠骨折愈合。     

超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强小鼠肌肉基因转染的实验研究

目的 探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)对小鼠肌肉基因转染的增强效果.方法 30只Balb/c小鼠随机分为6组,每组5只.绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA (20μg)按下列分组与SonoVue微泡和(或)PEI混合,注入小鼠后肢胫前肌内,然后予以治疗性超声辐照(声强2 W/cm2,占空比50％,超声辐照声强与占空比在实验前予以优化).A组:PBS组(空白对照组);B组:质粒+ US;C组:质粒+MB+ US;D组:质粒+PEI组;E组:质粒+PEI+ US组;F组:质粒+PEI+ MB+US组.10d后处死小鼠,立即取小鼠双后肢胫前肌冰冻切片,荧光显微镜计数GFP阳性肌纤维数.组织同时送检石腊切片,HE染色光镜观察有无炎性损伤及坏死.结果 A组肌肉组织内未见明显绿色荧光;B组可见绿色荧光表达肌纤维,计数为(14±3)个;C组GFP阳性纤维个数(58±6)个,D组(96±7)个,E组(119±11)个,F组(158±18)个.F组的GFP阳性纤维数最多,与其他各组比较差异均有统计学意义 (P＜0.05).各组石腊切片未显示明显的炎症反应和坏死.结论 UTMD联合PEI可显著提高小鼠肌肉组织的基因转染效率.     

生物载体硫交联聚乙烯亚胺的合成及递送小干扰RNA的实验研究

目的合成可生物降解的基因载体,并分析其生物毒性及转染率。方法低分子量聚乙烯亚胺(PEI)通过双硫键交联合成可降解的高分子量PEI衍生物(SS-PEI),通过红外光谱和核磁波谱分析技术分析其化学结构,采用细胞活力实验和检测大鼠肝肾功能指标分析其细胞和体内毒性,并转染羟基荧光素修饰的siRNA(FAM-siRNA)分析细胞转染率。结果红外波谱和核磁波谱分析可见酰胺键的特征波谱,噻唑蓝法和肝肾功能指标显示SS-PEI不同剂量组与对照组的差异均无统计学意义(P>0.05),SS-PEI/FAM-siRNA转染率为(76.0±2.8)%。结论 SS-PEI的合成可明显提高装载siRNA的效率,具有安全、高效等特点。     

叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺纳米载体转染螺旋神经节细胞

背景：新型阳离子纳米材料叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺易于合成和改性,稳定性好,结构及性能容易调控,已被作为基因治疗转染载体应用于多种疾病的研究。 目的：观察叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺转染体外培养小鼠内耳螺旋神经节细胞的可行性及特点。 方法：分别以叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺（实验组）、阳离子脂质体Lipofectamine^TM 2000（对照组）作为载体,制备携带增强型绿色荧光蛋白的转染载体系统。将昆明小鼠螺旋神经节细胞分别培养于含实验组和对照组转染载体系统的DMEM/F-12培养基中,培养24 h后,MTT法观察载体系统的细胞毒性,倒置荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达强度,流式细胞仪检测细胞转染率。 结果与结论：两种载体分别转染后,螺旋神经节细胞形态均未发生明显改变,但两组载体对螺旋神经节细胞均有一定的毒性,实验组载体毒性较小且转染效率较高（P〈0.05）。结果说明叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺基因转染体外螺旋神经节细胞的转染效率及细胞毒性均优于传统的阳离子脂质体。     

PEI与脂质体介导基因转染的比较研究

目的：比较新型转染试剂阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）与脂质体2000介导的血管内皮细胞生长因子 VEGF165基因转染人胚肾细胞293T 的转染效率,为基因转染提供新的方法。方法分别采用脂质体和不同 N／P 比值的 PEI 将合成的含有绿色荧光蛋白（GFP）和 VEGF165的质粒转入293T 细胞。转染24 h 后,采用 CCK-8试剂盒检测细胞活性;转染48 h 后在荧光显微镜下观察比较两种转染方法的转染效率,并通过 ELISA 方法检测细胞上清液中 VEGF165浓度,比较两种方法的转染效果。结果当 N／P＝9时,PEI 转染的细胞活性与脂质体转染相近,对细胞的毒性较小;此时,PEI 转染效率与脂质体也相似,均可达到约70％;同样,转染后细胞上清中 VEGF165浓度较未转染组提高（P ＜0．05）,但两种方法转染组间比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论PEI 作为一种新型的转染试剂,与脂质体相比,在一定比例范围内,具有转染效率高,对细胞毒性小且价格低廉的优势,有望成为基因转染的有效载体。     

超声联合聚乙烯亚胺增强MCF-7癌细胞基因表达的转染参数优化

目的 探讨超声辐照并超声造影剂联合聚乙烯亚胺(PEI)增强MCF-7乳腺癌细胞质粒DNA转染的最优条件及协同作用.方法 制备PEI/荧光素酶质粒(pCMV-luciferase-GL3)复合物,用于MCF-7癌细胞基因转染,超声辐照前添加超声造影剂SonoVue.通过荧光素酶活性和细胞存活率的测定,对超声辐照参数进行优化,对质粒浓度、孵育时间、血清、溶媒类型、培养基体积等因素进行分析.结果 细胞活力和荧光素酶活性均受超声强度、辐照时间和占空比的影响,适当条件的超声辐照可促进PEI/DNA复合物渗透入胞内,从而提高质粒DNA的转染率.最优超声辐照条件为1 w/cm2,10%占空比,辐照3 min.超声辐照并超声造影剂联合PEI的转染效率显著高于单纯超声辐照和PEI转染(P<0.01).在超声辐照前将细胞与PEI/DNA复合物共孵育2h时,荧光素酶活性显著增强(P<0.01).此外,血清、培养基体积和溶媒类型也对转染效率有影响.结论 优化的超声和转染参数能显著提高MCF-7癌细胞的基因表达效率.超声辐照并超声造影剂联合PEI对DNA转染效率有协同作用,是一种增强质粒DNA基因表达简单而有应用前景的方法.     

聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因修复老年大鼠的股骨骨折

目的:为避免病毒载体带来的安全隐患,利用新型的非病毒载体聚乙烯亚胺体内转染骨形态发生蛋白7基因,观察其对老年大鼠骨折愈合过程的影响,以寻找能够有效促进老年骨折愈合的基因治疗方法.方法:实验于2006-04/2007-04在解放军第二军医大学细胞生物学实验室和实验动物中心完成.①实验分组:取雄性SD大鼠24只,其中20月龄18只随机分为基因治疗组、生理盐水组和空白对照1组3组,4月龄6只为空白对照2组.②实验方法:所有大鼠建立股骨骨折模型,1周后基因治疗组骨折断端经皮注射聚乙烯亚胺和骨形态发生蛋白7基因转染试剂 250 μL,生理盐水组断端经皮注射相同体积生理盐水,其他2组不加处理.③观察指标:骨折第8周摄X射线片,然后取标本行组织病理切片、Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察各组骨折愈合情况.结果:24只大鼠均进入结果分析.骨折第8周4月龄大鼠骨折基本愈合,3组老年大鼠骨折均未完全愈合,但X射线片、苏木精-伊红染色和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色结果显示,与生理盐水组和空白对照1组相比,基因治疗组骨痂明显增多、骨痂骨化过程提前,Ⅰ型胶原染色深、面积较大,说明愈合速度加快、愈合能力改善.结论:20月龄老年大鼠骨折愈合过程明显延缓,聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白7基因体内转染的方法可以增强老年大鼠骨折修复能力、促进老年大鼠骨折愈合.     

蜂毒疏水性短肽增强聚乙烯亚胺的基因转染效率

本研究探讨使用蜂毒短肽疏水性尾部增加支链聚乙烯亚胺（BPEI）在HeLa细胞中的转染效率的可能性。合成蜂毒多肽melittin的疏水性尾部，使用红细胞溶血实验检测其穿透细胞膜的能力。将该片段与阳离子聚合物BPEI按一定比例混合，以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，检测其在HeLa细胞的转染效率；以M1Tr法检测基因转染后的细胞毒性。结果表明：在中性和酸性条件下，melittin的疏水性尾部均可穿透细胞膜导致红细胞溶血并显著增加BPEI在HeLa细胞系的基因转染效率，使用本方法转染后细胞毒性较单独使用PEI时为低。结论：melittin疏水性尾部是一种良好的增强剂，有可能在难以转染的细胞系的基因转染实验中起重要作用。     

超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强裸鼠移植瘤基因输送的初步研究

目的 探讨超声靶向微泡破坏(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强裸鼠Hela细胞(人宫颈癌)移植瘤基因输送的可行性和应用价值.方法 分别将2种质粒DNA[红色荧光蛋白质粒(RFP)和荧光素酶质粒(pCMV-LUC)]与PEI以不同氮/磷酸盐比(N/P比)混合,利用凝胶阻滞实验对PEI/DNA复合物进行分析.经荷瘤裸鼠尾静脉分别注入PBS、质粒、质粒+Sono Vue微泡、PEI/DNA复合物+Sono Vue微泡,仅对一侧肿瘤行超声辐照(3 MHz、2 W/cm2、2 min、20%占空比),另一侧肿瘤作为对照,并对该转染方法 的靶向性进行分析.超声辐照3 d后处死动物,行RFP表达观察、荧光素酶活性检测和组织学检查.结果 琼脂糖凝胶电泳显示PEI可有效地缩合质粒DNA.与裸质粒组比较,UTMD(超声辐照+Sono Vue微泡)能明显提高RFP转染率.与非辐照对照侧比较,UTMD的运用使RFP表达明显增强,荧光素酶活性增加了14倍(P＜0.01).UTMD联合PEI可显著增强基因转染,受辐照移植瘤的荧光素酶活性增加了10倍(P＜0.01);与非联合PEI时比较,荧光素酶表达增加了111倍(P＜0.01).无论有否超声照射,裸鼠其他器官组织中均无明显的基因表达(P＞0.05),且未观察到明显的组织损伤.结论 UTMD联合PEI可显著增强报告基因在肿瘤组织的靶向传输和转染,是一种很有前景、新型而安全的体内基因输送方法.     

Sonoporation induces apoptosis and cell cycle arrest in human promyelocytic leukemia cells

Despite being a transient biophysical phenomenon, sonoporation is known to disturb the homeostasis of living cells. This work presents new evidence on how sonoporation may lead to antiproliferation effects including cell-cycle arrest and apoptosis through disrupting various cell signaling pathways. Our findings were obtained from sonoporation experiments conducted on HL-60 human promyelocytic leukemia cells (with 1% v/v microbubbles; 1 MHz ultrasound; 0.3 or 0.5MPa peak negative pressure; 10% duty cycle; 1 kHz pulse repetition frequency; 1 min exposure period). Membrane resealing in these sonoporated cells was first verified using scanning electron microscopy. Time-lapse flow cytometry analysis of cellular deoxyribonucleic acid (DNA) contents was then performed at four post-sonoporation time points (4 h, 8 h, 12 h and 24 h). Results indicate that an increasing trend in the apoptotic cell population can be observed for at least 12 h after sonoporation, whilst viable sonoporated cells are found to temporarily accumulate in the G₂/M (gap-2/mitosis) phase of the cell cycle. Further analysis using western blotting reveals that sonoporation-induced apoptosis involves cleavage of poly adenosine diphosphate ribose polymerase (PARP) proteins: a pro-apoptotic hallmark related to loss of DNA repair functionality. Also, mitochondrial signaling seems to have taken part in triggering this cellular event as the expression of two complementary regulators for mitochondrial release of pro-apoptotic molecules, Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) and Bax (Bcl-2-associated X), are seen to be imbalanced in sonoporated cells. Furthermore, sonoporation is found to induce cell-cycle arrest through perturbing the expression of various cyclin and Cdk (cyclin-dependent kinase) checkpoint proteins that play an enabling role in cell-cycle progression. These bioeffects should be taken into account when using sonoporation for therapeutic purposes.     

卡莫司汀对人脑肿瘤干细胞增殖及细胞周期的影响

目的:探讨卡莫司汀(BCNU)对人脑肿瘤干细胞在细胞增殖及细胞周期方面的影响。方法:取初发的室管膜瘤手术切除标本1例,取材后制备为单细胞,分别接种于无血清培养基获得肿瘤干细胞,接种于含血清培养基获得肿瘤细胞。不同浓度的BCNU作用于细胞72h后,MTT法检测细胞在体外对BCNU的敏感性,并用终浓度为0.01μg/mL的BCNU作用细胞不同的时间段,通过流式细胞仪检测BCNU对细胞周期的影响。结果:(1)MTT显示,BCNU能抑制肿瘤干细胞及肿瘤细胞的生长,其对肿瘤干细胞(IC50=0.157μg/mL)的抑制略低于对肿瘤细胞(IC50=0.072μg/mL)(P<0.05)。(2)细胞周期方面,与阴性对照比较,两类细胞均表现为随药物作用时间的延长,S期细胞比例增高,并伴有凋亡细胞的增多,但肿瘤干细胞的改变(24h)出现晚于肿瘤细胞(6h)。结论:BCNU对体外培养的脑肿瘤干细胞生长有明显的抑制作用,作用机制可能为通过干扰S期DNA的合成起作用;与脑肿瘤细胞相比,脑肿瘤干细胞在MTT及细胞周期的检测中,均表现出对BCNU有一定的耐药性。     

MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡，增殖及细胞周期的影响

目的探讨沉默MYCT-1基因对GES-1细胞凋亡、细胞周期及细胞增殖的影响。方法采用siRNA转染GES-1细胞后分别应用AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测siRNA对细胞增殖的作用。结果siRNA转染GES-1细胞后,与对照细胞相比,细胞凋亡率明显增高（P〈0．05）;细胞增殖率降低（P〈0．05）,细胞周期检测表明细胞停滞于S期（P〈0．05）。结论MYCT-1基因维持一定的表达水平对于正常细胞生长调控是必需的,MYCT-1基因对细胞周期的调控主要体现在S期向G1期的转变过程。     

小鼠Nestin启动子的克隆及其表达载体的构建

目的:克隆Nestin基因启动子序列,并研究其调控能力。方法:用高保真酶PCR扩增出小鼠Nestin启动子全序列、核心序列,pcDNA3.1质粒双酶切切掉CMV启动子序列,将Nestin基因启动子序列插入到原CMV启动子位置,pEGFP-N1质粒双酶切下EGFP序列,克隆入pcDNA3.1多克隆位点中,重组构建质粒,分别用Nestin启动子全序列和核心序列调控EGFP基因的表达。重组质粒分别转染Nestin+细胞和Nestin-细胞,观察EGFP基因在细胞内的表达情况。结果:成功克隆出Nestin基因启动子全序列和核心序列,经酶切鉴定及测序证实正确。二序列皆能调控EGFP在各种细胞内的表达。结论:Nestin基因启动子全序列和核心序列具有非特异性调控能力。     

高温对HepA瘤株细胞周期的影响

目的 探讨高温对肿瘤细胞周期的影响。方法 将肝癌腹水型瘤株HepA细胞分为37℃，40℃，42℃和44℃四个温度组，每一组分别在1h,2h,4h和8h四个时间点取材，经PI染色在流式细胞仪上检测四种温度条件下，四个时间段时HepA细胞在各细胞周期中的细胞数。结果 37℃时，细胞处于活跃的增殖状态，绝大部分细胞处于S及G2/M期，40℃时，细胞增殖更趋活跃，G1期细胞减少，42℃时，细胞增殖受到明显抑制，G1期细胞增加，G2/M期细胞减少，44℃时，1-2h，细胞增殖受到进一步的抑制，G1期细胞明显增加，G2/M期细胞进一步减少；4-8h，高温对细胞增殖的影响反而减弱，与1-2h时相比，G1期细胞明显减少。G2/M期的细胞有了明显的增加，甚至多于42℃时，结论 温和性高温（42-44℃）对HepA细胞的增殖活动有明显的抑制作用。使He-pA细胞主要滞留于G1期。     

芦荟粗多糖对体外培养人表皮细胞增殖活性及细胞周期的影响

目的研究芦荟粗多糖对体外培养人表皮细胞增殖活性及细胞周期的影响。方法在芦荟粗多糖(75、150、300、600、1200 μg／ml)的作用下,光镜观察表皮细胞形态及细胞融合时间,电镜观察细胞超微结构,MTT法以及[3H]-TdR渗入量观察细胞增殖状况,流式细胞仪检测细胞周期。结果与对照组比较,芦荟粗多糖作用后表皮细胞形态学变化不明显,但芦荟粗多糖组细胞融合时间明显缩短(P< 0．05);细胞超微结构观察发现,300、1200 μg/ml芦荟粗多糖组的细胞核内以常染色质为主,而对照组与 75μg／ml芦荟粗多糖组则以异染色质为主;从生长曲线上看,芦荟粗多糖作用2 d后细胞增殖明显增快; [3H]-TdR渗入量与对照组比较呈显著性上升(P<0．05);流式细胞分析显示,G0／G1期细胞所占百分率显著性减少,G2／M期和S期细胞所占百分率显著性增加(P<0．01)。结论芦荟粗多糖可通过影响表皮细胞的DNA合成及细胞周期来促进细胞增殖。     

siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞周期的影响

目的研究小干扰RNA(siRNA)沉默A375黑素瘤细胞肾上腺髓质素(ADM)基因对其细胞周期的影响。方法利用人工合成的ADM靶向小分子干扰RNA转染A375细胞,采用实时荧光定量-PCR(qRT-PCR)筛选出有效的siRNA,用选出的干扰效果最好的siRNA转染的A375细胞为实验组;转染非特异序列的细胞为阴性对照组;未转染的细胞为空白对照组。流式细胞仪(FCM)检测干扰ADM基因48 h后A375细胞周期的情况。结果 FCM结果显示,siRNA干扰组G2/M期细胞比率为(11.360±1.224)%,明显高于未转染组的(1.020±0.990)%和非特异序列转染组的(4.150±1.032)%,差异有统计学意义(P0.05);未转染组与非特异序列转染组差异无统计学意义(P0.05)。而siRNA干扰组G1/G0、S期细胞比率分别为(69.443±2.023)%、(19.197±0.890)%,与未转染组(68.567±3.653)%、(30.417±4.582)%和非特异序列转染组(70.530±3.008)%、(23.313±4.645)%比较,差异均无显著性(P0.05)。结论 ADM能够将黑素瘤细胞阻滞在G2/M期,抑制细胞增殖。     

沉默RAGE对人卵巢癌细胞株增殖、凋亡能力及周期分布的影响

目的 研究沉默晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycosylation end products,RAGE)对人卵巢癌细胞株增殖、凋亡能力及周期分布的影响.方法 人上皮性卵巢癌SKOV-3细胞经过慢病毒载体构建,分为空白组、过表达组和沉默组.进行细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期实验,We...     

MiR-195对人脑胶质瘤细胞 U251和 SHG-44增殖的抑制作用

目的探讨 miR-195过表达对体外培养的人脑胶质瘤细胞U251和 SHG-44增殖的影响。方法通过脂质体将miR-195 mimics转染至U251和SHG-44细胞,同时设立空白对照组和阴性对照组,实时荧光定量PCR检测转染前后miR-195的表达水平;用CCK-8法评价细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果胶质瘤细胞转染miR-195 mimics后,发现U251细胞和SHG-44细胞中miR-195的表达分别为5.93＆#177;0.43和6.43＆#177;0.48,较空白对照组和阴性对照组均增高约6倍左右。与空白对照组和阴性对照组相比,转染miR-195 mimics后的胶质瘤细胞的增殖能力明显受到抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞减少。结论过表达miR-195可以阻滞胶质瘤细胞周期进展,从而抑制其增殖,为胶质瘤的基因治疗提供新的策略。