缺氧条件下全反式维甲酸对U87胶质瘤细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的研究模拟缺氧条件下全反式维甲酸(ATRA)对U87胶质瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及其可能的机制。方法 U87胶质瘤细胞分为空白对照组、缺氧对照组、低浓度干预组、高浓度干预组。CoCl2模拟缺氧,U87胶质瘤细胞经不同浓度ATRA(5、10μmol/L)干预后,实时定量PCR法及Western blot法分别检测细胞中VEGF mRNA、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA及VEGF蛋白的表达。结果与缺氧对照组相比,低、高浓度干预组VEGF mRNA表达分别为缺氧对照组的(2.08±0.23)倍及(3.13±0.14)倍,两组与缺氧对照组的差异均具有统计学意义(均P<0.01);低、高浓度干预组HIF-1αmRNA表达分别为缺氧对照组的(1.62±0.07)倍及(1.83±0.09)倍,两组与缺氧对照组的差异均具有统计学意义(均P<0.01)。而VEGF蛋白相对表达量在缺氧对照组为(2.15±0.12),低浓度干预组为(2.32±0.20),高浓度干预组为(3.09±0.08),各组间差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论在模拟缺氧条件下,ATRA可在转录及翻译水平增加U87细胞中VEGF的表达,而这种表达上调可能部分通过上调HIF-1α表达实现。     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 体外探讨全反式维甲酸（ATRA）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法 从大鼠股髓分离出MSCs，采用贴壁法体外扩增、传代，取5代后细胞采用EGF共培养，二巯基乙醇（2-ME）预诱导，再以ATRA为诱导剂诱导，然后免疫细胞化学检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。结果 MSCs诱导后具有神经元样细胞的形态，免疫细胞化学显示nestin、NSE、AchE有阳性表达，而GFAP、TH表达为阴性。结论 ATRA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，且可表达AchE。     

VEGF、bFGF、PTEN表达与胶质瘤恶性程度及预后因素的研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、抑癌基因(PTEN)在胶质瘤的表达,并结合多种临床因素探讨其与肿瘤恶性程度及预后的关系。方法采用SABC免疫组化技术,检测50例胶质瘤VEGF、bFGF、PTEN的表达,并对可能影响预后的因素进行统计学分析。结果胶质瘤VEGF、bFGF、PTEN的表达在低级别组与高级别组之间存在显著差异(P<0.05);Logistic逻辑回归单因素分析显示,患者年龄、肿瘤切除范围、恶性程度、KPS、术后化疗、术后放疗、肿瘤bFGF和PTEN表达对3年存活率有意义;多因素分析表明,肿瘤的恶性程度、术前患者KPS及PTEN基因的突变或缺失情况是影响胶质瘤患者预后的主要因素。结论VEGF、bFGF、PTEN在胶质瘤中的表达与其恶性程度相关,肿瘤的恶性程度、术前患者KPS及PTEN基因的突变或缺失情况可作为考察胶质瘤患者预后的独立指标。     

全反式维甲酸对脑肿瘤干细胞增殖和分化的影响

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对脑肿瘤干细胞(BTSCs)增殖和分化的影响.方法 采用有限稀释法从人脑胶质母细胞瘤新鲜标本中分离、克隆筛选BTSCs;在无血清条件下培养BTSCs.根据培养基中的成分不同分为对照组、ATRA组、ATRA/生长因子组、生长因子组,用MTT法检测BTSCs的增殖效应;在含血清条件下诱导分化BTSCs.根据血清培养基中的成分不同分为ATRA组、对照组.于诱导分化第10天用免疫荧光技术检测BTSCs子代分化细胞CD133和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达率;将BTSCs子代分化细胞更换培养条件,观察其在无血清培养基中增殖逆转再次形成脑肿瘤干细胞球(BTS)的比例和形成时间.结果 在无血清条件下,ATRA组BTSCs的增殖速度较对照组明显加快,但低于生长因子组和ATRA/生长因子组,形成的BTS亦小于后两者:在含血清条件下,ATRA组BTSCs子代分化细胞CD133、GFAP的表达率分别为2.29%±0.27%和75.60%±4.03%,对照组为7.05%±0.49%和12.51%±0.77%,前者的分化程度明显高于后者,差异有统计学意义(P<0.05),但前者仍然存在CD133的表达;BTSCs子代分化细胞在回复无血清条件下能够再次增殖形成BTS,ATRA组再形成BTS的比例为4.84%±0.32%,形成时间为(10.07+1.03)d.对照组分别为17.71%±0.78%和(4.08±0.35)d,前者再形成BTS的比例较后者更低、时间更长,差异有统计学意义(P<0.05).结论 ATRA能促进BTSCs增殖并诱导BTSCs子代细胞走向分化,但分化不彻底,细胞不能达到终末分化,可再次形成BTS.     

全反式维甲酸抑制MDM2基因在胶质瘤细胞SHG-44中的表达

目的 探讨全反式维甲酸对胶质瘤细胞SHG-44中MDM2基因表达的影响,为进一步研究脑胶质瘤的进展机制及基因治疗提供依据.方法 分别利用cDNA微阵列与Western blot技术分析在10μmol/L全反式维甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)处理前后的胶质瘤SHG-44细胞MDM2基因和蛋白的差异表达应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(Streptavidin-Peroxidase,SP)法检测Ⅱ级与Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的表达.随机选择数个差异基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列的结果.结果 应用cDNA微阵列检测发现,MDM2基因在ATRA处理与未处理的SHG-44细胞之间表达量的比值为0.37,提示ATRA可抑制MDM2基因在SHG-44中的表达.该结果进一步得Northern杂交实验结果的支持.Western blot分析结果显示10μmol/L ATRA处理前后胶质瘤SHG-44细胞之间MDM2蛋白的相对表达量分别为21.40±0.58和14.02±0.35(t=24.728,P=0.000),提示MDM2蛋白在SHG-44中的表达受到ATRA抑制.Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤标本MDM2蛋白的阳性表达率分别为24.00%(6/25)和56.52%(13/23)(X2=5.298,P=0.021),MDM2蛋白的表达随胶质瘤恶性程度的增高而增加.结论 ATRA可抑制SHG-44胶质瘤细胞中MDM2基因的表达,MDM2基因的表达水平与胶质瘤的演进有关.     

bFGF、VEGF在大鼠创伤海马脑组织中的表达

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)在大鼠创伤海马组织中不同时间的表达及其它们之间的关系，从分子水平探讨颅脑损伤后的病理机制，为临床治疗脑损伤的新途径提供实验基础。方法 改进Marmarou大鼠加速弥漫性脑损伤模型，取海马区创伤脑组织免疫组化染色观察bFGF、VEGF基因表达情况。结果 海马CAl区伤后6h，bFGF基因表达增加，12h达高峰；VEGF基因表达伤后24h达高峰，72h回复到对照水平。结论 bFGF、VEGF基因表达与脑损伤密切相关，作为生长因子，bFGF、VEGF可能参与颅脑损伤后神经元保护及损伤后修复过程。     

全反式维甲酸诱导神经干细胞分化实验研究

目的探索全反式维甲酸在诱导人胚胎神经干细胞(NSC)分化为神经元过程中的作用.方法用不同浓度(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)的全反式维甲酸(ATRA)在体外诱导人胚胎神经干细胞.诱导7 d后,做神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光染色,计数分化为神经元的比例.结果与对照组相比,全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例(P<0.01).其中1 μmol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例最高,为(29.20±1.09)%.结论全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,其具体机制尚待进一步研究.     

脑梗死后VEGF及bFGF对神经干细胞增殖分化的机制研究进展

缺血性卒中因其发病机制复杂,迄今为止,仍未发现确切有效治疗方法。随着研究深入, 神经干细胞（neural stem cells,NSCs）作为新的研究靶点,为卒中的治疗提供了新的前景。目前脑梗 死后促进内源神经干细胞增殖分化的影响因素众多,但有研究表明碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）对NSCs 的增殖及分化起到了不容忽视的作用。通过研究VEGF和bFGF在脑缺血后NSCs增殖分化中的作用机 制,为临床脑缺血的靶向治疗提供理论基础。     

全反式维甲酸抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的探讨全反式维甲酸对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其机制。方法建立大鼠C6脑胶质瘤模型，腹腔注射全反式维甲酸后．MRI检测胶质瘤的体积变化、流式细胞仪检测细胞增殖时相变化及免疫组化检测p27Kip1蛋白的变化。结果治疗组较对照组肿瘤体积明显减小（P〈0．05）；G1期细胞比例明显增加（P〈0．05），S期细胞比例明显减少（P〈0．05）；p27Kip1蛋白的表达明显增加（P〈0．05）。结论全反式维甲酸通过上调p27Kip1蛋白的表达而抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖。     

冷冻联合全反式维甲酸抑制大鼠C6脑胶质瘤增殖的实验研究

目的探讨冷冻联合全反式维甲酸（ATRA）抑制大鼠c6脑胶质瘤细胞的增殖及其机制。方法在120只Wistar大鼠建立c6脑胶质瘤模型,并随机将其平均分为冷冻治疗、ATRA治疗、冷冻联合ATRA治疗及对照组。接种c6细胞第22天MRI检测10只动物的胶质瘤体积的变化,每组并处死10只动物取肿瘤组织,采用免疫组化法检测p27kipl蛋白的表达;观察余下10只荷瘤鼠的生存期。结果各治疗组较对照组肿瘤体积明显缩小（P〈O．05）,大鼠生存期明显延长,p27kipl蛋白的表达水平明显增多,以联合治疗组最为显著（P〈0．05）;p27kipl蛋白的表达与肿瘤体积呈明显负相关（P〈0．05）,与大鼠生存期呈明显正相关（P〈O．05）。结论与单一治疗相比,冷冻联合ATRA治疗能显著抑制大鼠c6胶质瘤细胞增殖,其机制可能与其表达p27kipl蛋白的上调有关。     

生骨注射液对骨折愈合过程中碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子表达的影响

背景：在促进骨折修复研究中,应用外源性生长因子极不稳定,且造价高不适宜广泛推广,如何有效地促进内源性生长因子的表达将是值得深入研究的课题。 目的：观察生骨注射液对骨折愈合过程中内源性碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子表达的影响。 设计、时间及地点：完全随机分组设计,对照实验,于2007-07/2008-08在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。 材料：清洁级3月龄雄性SD大鼠60只。生骨注射液由当归、土鳖虫、淫羊藿等药物组成,由湖北省中医院提供,质量浓度为1 g/L。 方法：建立SD大鼠胫骨干骨折愈合模型,分成实验组和对照组各30只,分别在骨折断端等量注射生骨注射液和生理盐水,每两日1次,0.2 mL/次。两组分别于术后第1,2,3,4,5,6周时各处死5只大鼠,取材。 主要观察指标：采用免疫组织化学方法,检测两组大鼠骨折愈合过程中不同阶段骨痂组织中碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子蛋白的表达及差异情况。 结果：免疫组织化学染色显示,各时间点实验组骨痂组织中碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子表达量及阳性定位均明显强于对照组。 结论：生骨注射液能够增加骨折愈合过程中碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子在骨痂组织中的表达,这可能是生骨注射液促进骨折愈合的机制之一。     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球促进神经干细胞生长的体外实验研究

目的 制备一种能够负载足量碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)并且能够以理想的速度缓慢释放的载体. 方法 构建负载bFGF的缓释微球,并检测其体外释放过程.将bFGF缓释微球与神经干细胞共培养,以常规多次添加bFGF的神经干细胞培养组作为对照,用AlamarBlue法检测培养细胞的存活情况,ELISA法检测培养上清bFGF含量,定期观察细胞形态学变化,并进行巢蛋白荧光免疫细胞化学染色,检测神经干细胞标记物. 结果 AlamarBlue法检测结果显示,培养3d、5d时bFGF缓释微球组和常规培养组之间细胞增殖率差异有统计学意义(P＜0.05).ELISA法检测结果显示,仅负载bFGF缓释微球组能测量到培养上清中bFGF含量,大致维持在200 pg/mL水平.细胞形态学观察发现bFGF缓释微球组能够在培养第3天即形成神经干细胞球,并且在培养第7天仍保持较好透光度,保持较好的细胞活性.荧光免疫细胞化学染色发现bFGF缓释微球组培养的神经干细胞球巢蛋白染色阳性. 结论 本课题组制作的bFGF缓释微球材料具有较好的生物相容性.缓慢释放的bFGF能够满足神经干细胞生长需要,并且保持神经干细胞自身的细胞特性.该bFGF缓释微球安全有效,可应用于中枢神经系统损伤的在体实验研究.     

VEGF及PCNA表达与脑胶质瘤分级的相关性研究

目的　研究血管内皮细胞生长因子 (VEGF)与增殖性细胞核抗原 (PCNA)蛋白在各级脑胶质瘤中的表达率及与胶质瘤病理分级的关系。方法　利用免疫组化方法检测 4 5例胶质瘤手术标本中VEGF与PCNA蛋白的表达水平 ,并比较二者的相关性。结果　随着胶质瘤病理级别的升高 ,VEGF及PCNA的表达率渐之升高 ,Ⅰ Ⅳ级病理分组中 ,VEGF阳性率分别为 2 2 .2 9± 7.6 4 ,5 3.75± 10 .74 ,70 .2 7± 14 .2 7,PCNA阳性率分别为 15 .86± 4 .5 5 ,32 .4 1± 7.4 4 ,4 7.92± 10 .31,且并各级之间有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论　VEGF与PCNA蛋白的表达对判断胶质瘤病理分级及生物学行为有一定意义。     

血管内皮细胞生长因子对胶质瘤病理形态影响的实验研究

目的了解血管内皮细胞生长因子(VEGF)对胶质瘤病理形态的影响。方法利用光镜和电镜观察转染有反义VEGF cDNA片段的C_6胶质瘤细胞的裸鼠移植瘤的病理特征,ELISA法检测肿瘤组织中VEGF的含量。结果转染有反义VEGF cDNA片段的C_6胶质瘤组织中VEGF含量明显低于仅转染有空载体的C_6胶质瘤组织(P＜0．05)。前者瘤组织表面存在类包膜,瘤周血管反应轻。无明显瘤周水肿,瘤周侵袭少见,凋亡瘤细胞明显增多；血管内皮细胞胞浆内VVO样结构少见,基板不连续、单层,外周见胶原纤维；但个别肿瘤大者瘤组织中VEGF含量也高,且内皮细胞VVO样结构也随之增多。而后者瘤周血管反应明显,瘤体和瘤周水肿严重,瘤细胞可侵袭瘤周组织,瘤内组织明显出血坏死,且可见瘤细胞形成类微血管样结构,血管内皮细胞胞浆内VVO样结构较多,水肿越明显VVO样结构越多见,并与组织中VEGF含量相一致；基板较完整连续,多数基质疏松,呈多层排列,外层见少量胶原纤维。所观察的几种肿瘤中的微血管内皮细胞孔窗及内皮细胞裂隙与转染的目的基因无明显的关系,且内皮细胞的凋亡均不明显。结论胶质瘤细胞上VEGF表达的下调可促进胶质瘤细胞凋亡；VEGF通过内皮细胞内的VVO样结构增多引起血管渗透性增加致瘤体和瘤周水肿,而与内皮细胞上孔窗无明显的关系：胶质瘤组织中的血管基板完整连续与否与VEGF有关。     

FGF和EGF对神经干细胞增殖及分化的影响

胚胎和成年哺乳动物脑内均存在的神经干细胞,成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对神经干细胞的增殖及分化有一定的影响,ＦＧＦ和ＥＧＦ及其受体在胚胎期和成年期表达各异。ＦＧＦ和ＥＧＦ能促进神经干细胞增殖,在不同的条件下对分化和作用不同。     

胶质瘤干细胞来源的外泌体对血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的探讨胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)来源的外泌体对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的增殖和迁移的影响。方法培养和分离人胶质瘤U87细胞系来源的胶质瘤干细胞(GSCs),对培养的肿瘤球细胞及其诱导分化的细胞采用免疫组织化学染色的方法鉴定。然后提取胶质瘤干细胞分泌的外泌体(GSCs-exo),分别添加不同浓度的GSCsexo (20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)处理人脑微血管内皮细胞(HBMECs)。在处理结束后,采用CCK-8法检测GSCs-exo对血管内皮细胞增殖的影响、Transwell小室检测GSCs-exo对细胞迁移能力的影响。结果肿瘤球细胞培养状态下呈悬浮生长,免疫组织化学荧光染色法证明培养的肿瘤球细胞中特异性表达CD133和Nestin,其诱导分化的细胞染色可见GFAP和Neun表达阳性。随着GSCs-exo浓度的升高,促血管内皮细胞的增殖能力逐渐增强,迁移能力也大大提高(P 0. 05)。结论在胶质瘤微环境中,胶质瘤干细胞来源的外泌体可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移,GSCs-exo可能是胶质瘤血管形成的关键因素。     

OPN和VEGF在脑胶质瘤中的表达及其与预后的关系

目的探讨骨桥蛋白(OPN)和血管内皮生长因子(VEGF)在脑胶质瘤中的表达及其与各临床病理特征的关系,评价OPN和VEGF对判断患者预后的价值。方法免疫组化检测60例脑胶质瘤和15例正常脑组织中OPN和VEGF的表达,并对OPN和VEGF的表达与脑胶质瘤临床病理特征及患者生存时间进行统计学分析。结果OPN、VEGF在脑胶质瘤中表达阳性率分别为70.0%、75.0%,在正常脑组织中表达阳性率分别为20.0%、26.7%,肿瘤中OPN和VEGF表达显著高于正常组织。OPN表达在不同肿瘤直径、瘤周脑水肿(PTBE)和病理分级中的差异有统计学意义。VEGF表达在不同PTBE和病理分级中的差异有统计学意义。对OPN和VEGF表达阳性和阴性患者生存率分析的差异也有统计学意义,并提示OPN和VEGF为负性预后因子。OPN与VEGF之间关系呈正相关。结论OPN和VEGF在脑胶质瘤中高表达,两者均反映了脑胶质瘤的生物学特性,并与患者预后有关,OPN和VEGF阳性表达提示预后不良。