绿色荧光蛋白与脑胶质瘤

绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)是最近发现的一种小分子蛋白质 ,其化学性能稳定 ,在 4 88nm波长光线激发下发出强度较高的绿色荧光。GFP作为最新的标记基因与目的基因相连 ,不影响目的基因表达且能较好地标识出目的基因位置 ,结合荧光强度分析 ,还可对蛋白的表达初步定量。目前GFP在应用基因治疗肿瘤、探讨肿瘤生物学特征、研究肿瘤血管构建等方面已被广泛应用。     

人脑转移癌组织裸小鼠脑内移植模型的建立

目的 建立人肺腺癌脑转移瘤的裸小鼠原位移植模型,并分析移植瘤的生物学特征.方法 取人肺腺癌脑转移瘤组织块,接种于裸小鼠右尾状核.致瘤后即用裸小鼠的瘤组织进行其原位传代接种,观察致瘤率及荷瘤鼠生存期;MRI观察移植瘤在鼠脑内的大体形态;HE染色分析各代移植瘤的组织学形态;免疫组化染色观察移植瘤中CEA的表达;Alcian blue/PAS特殊染色检测移植瘤中粘液的性质.结果 移植瘤组织在裸小鼠右尾状核已连续传至6代,共65只鼠.荷瘤鼠生存期原代为(47.6±1.8)d,2～3代有所缩短,4～6代稳定在(38.0±0.9)d;移植瘤MRI类圆形,瘤周无水肿.移植瘤病理为低分化腺癌,不向周围正常鼠脑组织浸润;移植瘤中CEA表达阳性,有酸性粘液存在.结论 人肺腺癌脑转移瘤组织块接种于鼠脑内建立的原位移植模型能更好地模拟临床原发肿瘤的病理学特征,本方法为研究人肺腺癌脑转移瘤的生物学特性及实验治疗提供了一个可靠的动物模型.     

荧光裸小鼠源的人脑胶质母细胞瘤原位移植模型的建立

目的在表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)裸小鼠脑内建立人脑多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)原位移植模型。方法将表达GFP的C57/B6鼠与Balb/c nu/nu系裸小鼠杂交筛选出表达GFP的裸小鼠。把人脑GBM组织原位移植于GFP裸小鼠脑内,荧光显微镜下观察移植瘤的生长特性、血管生成及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达。结果成功培育出表达GFP的荧光裸小鼠;移植瘤中EGFR阳性表达率(78.6±5.2)%,肿瘤侵袭性生长并血管丰富。结论人脑GBM荧光裸小鼠原位移植模型能模拟人脑原发恶性胶质瘤高侵袭及EGFR高表达的生物学特性。     

局部微波加温程度对裸小鼠脑胶质瘤生长影响的探讨

本文采用44℃、不同的加温时间(10、20、30和40分钟),对移植于裸小鼠的人脑恶性胶质瘤作局部微波加温治疗。通过光镜、甲基-3H 胸腺嘧啶核苷掺入法和观察加温后移植瘤生长曲线变化等方法发现:以44℃、加温20分钟已能达到满意的加温效果,再延长加温时间,并不能明显提高治疗效果。     

胃肠道间质瘤细胞组织在不同周龄裸小鼠不同部位的成瘤情况

背景：建立合适的人胃肠道间质瘤裸鼠动物模型,可为以后在活体状态下研究胃肠道间质瘤细胞提供一个必不可少的工具。 目的：观察胃肠道间质瘤细胞组织块接种于不同周龄裸小鼠腋下和臀部的成瘤情况。 方法：将胃肠道间质瘤细胞组织块分别接种于4,8周龄BALB/c(nu/nu)裸鼠的腋下和臀部,观察在一定时间内,不同周龄裸鼠不同部位的瘤体成瘤率,生长速度,破溃率和转移率。 结果与结论：4周龄裸鼠的成瘤率及生长速度明显高于8周龄裸鼠(P < 0.05),且接种于腋下的成瘤率较臀部高;4周龄与8周龄裸鼠的肿瘤破溃率差异无显著性意义(P > 0.05),但接种于臀部的肿瘤破溃率大于腋下(P < 0.05);在肿瘤软化消失率方面,8周龄裸鼠明显高于4周龄裸鼠(P < 0.05),同龄裸鼠中,臀部高于腋下。说明不论接种部位如何,周龄越小的裸鼠,移植瘤成瘤率越高、生长速度越快;但对于相同周龄的裸鼠,不论接种部位如何,肿瘤生长速度无明显差异。     

渗透泵强化对流释放给药治疗恶性脑胶质瘤的裸小鼠模型

目的 探寻渗透泵强化对流释放给药治疗脑肿瘤的裸小鼠模型,为新药的临床前期应用提供良好的实验动物模型.方法 14只裸小鼠基底节区种植4×105个人胶质瘤U87细胞,并安置渗透泵强化对流释放给药系统.裸小鼠按体重和活体荧光信号强度分为二组:治疗组(n=7)的泵内注入1 00μl(1μg)的DTATEGF,对照组(n=7)泵内注入100μl(1 μg)的无关毒素DT.观察动物的生长特征,Kaplan- Meier生存曲线分析和脑内肿瘤的病理学特征.结果 实验动物没有与渗透泵及外科手术相关的病残和病死发生.动物对渗透泵给药系统耐受好,无抓搔及渗透泵脱位,伤口无感染及裂开等情况.Kaplan - Meier生存曲线显示治疗组动物的中位生存期较对照组明显延长,差异有显著性.(治疗组126天vs.对照组68天,P =0.0002).治疗组中有两只小鼠生存期超过180天.病理学检测裸小鼠脑内种植生长的肿瘤与人类胶质母细胞瘤的病理特征极为相似.结论 该裸小鼠实验动物模型简便、实用、可靠,适用于新的药物包括单克隆抗体、靶向小分子、肿瘤疫苗等通过强化对流投递治疗脑内恶性肿瘤的临床前期应用.     

荧光引导下脑胶质瘤边界的组织病理学研究

目的 5-氨基乙酰丙酸(ALA)引导的荧光手术已应用于临床恶性脑胶质瘤的治疗,本实验的目的是探讨ALA荧光引导切除脑胶质瘤的荧光边界与侵袭性的关系.方法 对11例胶质母细胞瘤患者麻醉诱导前3h给予口服ALA,术中使用荧光显微镜检测肿瘤荧光,根据有无荧光留取组织标本.利用免疫组化方法检测荧光组与非荧光组组织中侵袭性指标细胞粘附分子CD44(CD44-HCM)、基质蛋白酶-9(MMP-9)和肌腱蛋白(TN)的表达.结果 CD44-HCM、MMP-9和TN在荧光组织与无荧光组织中的阳性表达率有显著差异(P＜0.01),与无荧光的组织相比,荧光组中CD44-HCM、MMP-9和TN表达的阳性率明显增加.结论 ALA诱导的肿瘤荧光边界与脑胶质瘤组织病理学边界相符,进一步表明,荧光引导手术能够有效的切除脑胶质瘤,并且为手术提供客观边界.     

面神经损伤大鼠脑内移植绿色荧光蛋白转基因胎鼠神经干细胞的

背景：目前面神经损伤后的修复主要集中在外周神经干,但面神经损伤后会导致部分中枢运动神经元凋亡。现阶段关于干细胞植入面神经损伤大鼠脑后对面神经核团内凋亡神经元的影响相关报道甚少。 目的：观察大鼠面神经损伤后,脑内移植绿色荧光蛋白转基因胎鼠的神经干细胞的成活和迁移情况。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-07/12在昆明医学院神经科学研究所完成。 材料：孕14~16 d的绿色荧光蛋白转基因蛋白小鼠1只,用于制备转基因神经干细胞。清洁级SD雄性大鼠24只,随机分为3组：面神经损伤转基因细胞组12只、面神经损伤细胞培养液组6只、面神经正常转基因细胞组6只。 方法：面神经损伤转基因细胞组、面神经损伤细胞培养液组大鼠建立面神经切断模型。造模后1周,行转基因神经干细胞立体定向移植,注射点为前囟后方11.30 mm、背侧9.00 mm、正中线位置。面神经损伤转基因细胞组、面神经正常转基因细胞组各注入10 μL转基因神经干细胞悬液(含5×106 个细胞),面神经损伤细胞培养液组注入10 μL神经干细胞培养液,4周后制作脑组织冰冻切片。 主要观察指标：荧光显微镜观察移植部位绿色荧光蛋白阳性神经干细胞的存活情况,及其向损伤侧面神经核团周围迁移的情况。 结果：①移植处：面神经损伤转基因细胞组、面神经正常转基因细胞组均可见数量不等的绿色荧光蛋白阳性细胞,其中部分绿色荧光蛋白阳性细胞位于血管内;面神经损伤细胞培养液组未见绿色荧光蛋白阳性细胞。②面神经核团周围：仅面神经损伤转基因细胞组可见数量不等的绿色荧光蛋白阳性细胞迁移于损伤侧面神经核团周围,而健侧面神经核周围未见绿色荧光蛋白阳性细胞;余2组双侧面神经核周围均未见绿色荧光蛋白阳性细胞。③移植处与面神经核团周围之间：未见绿色荧光蛋白阳性细胞相连。 结论：神经干细胞移植入面神经损伤大鼠脑内后,可以向损伤侧面神经核周围迁移。     

蛛网膜下腔出血大鼠脑内蛋白质经淋巴引流的荧光示踪

目的 探讨蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠脑实质内大分子物质经淋巴引流的变化.方法 将健康成年雄性Wistar大鼠分为生理盐水组、伊文思蓝标记白蛋白(EBA)组、SAH+EBA组.采用枕大池两次注入自体动脉血法建立SAH模型,应用改良的脑实质微量注射技术将EBA注入大鼠左侧尾壳核,生理盐水组用生理盐水代替EBA.于注射后0.5、1、2、3、5 d处死动物,观察并比较各组不同时间点EBA在脑内、颈总动脉壁、颈部淋巴结等部位的分布.结果 EBA组于注射后1 d荧光信号首先出现在左侧脑实质、侧脑室及其血管周围,并逐步到达对侧;双侧颈总动脉外膜有密集的荧光信号,颈部淋巴结可见荧光信号.2 d后脑内荧光信号明显减弱,嗅球内荧光信号逐渐增强,腹主动脉旁淋巴结内有点状荧光信号.各淋巴结内荧光均于3 d时最强.SAH后脑内EBA引流至嗅球、颈部淋巴结和腹主动脉旁淋巴结的量减少且速度减慢.于0.5、1、2、3、5 d,EBA组颈深淋巴结EBA荧光密度分别为14.5±3.2、27.5±7.4、60.3±12.3、138.0±12.0和108.1±13.4,SAH+EBA组分别为8.9±2.0、11.9±2.5、17.4±3.7、26.7±4.5和59.0±8.1,后组各时间点密度均低于前组(F=13.17、24.04、66.81、302.77、59.36,P＜0.01);2、3、5 d,EBA组腹主动脉旁淋巴结EBA荧光密度分别为26.3±5.9、47.5±9.6和41.0±9.3,SAH+EBA组分别为11.0±1.5、12.5±2.8、23.6±3.2,后组各时间点均低于前组(F=38.17、72.52、19.01,P＜0.01).结论 SAH可导致脑内大分子物质经淋巴系统引流的功能障碍.     

小鼠脑微血管内皮细胞在氧糖剥夺条件下的差异蛋白质组学研究

目的对参与血-脑屏障组成的脑微血管内皮细胞在模拟缺血性脑损伤条件下的蛋白质组学变化特征进行研究．为深入理解缺血性脑损伤过程中血-脑屏障应答的分子学机制提供新的数据。方法采用比较蛋白质组学方法．对正常培养条件和氧糖剥夺培养条件下的小鼠脑微血管内皮细胞系（bEnd．3细胞）进行研究．分析二者之间的差异蛋白质表达谱。结果于氧糖剥夺培养条件下，小鼠脑微血管内皮细胞系中共发现52个蛋白质点的表达发生改变，通过串联飞行质谱成功鉴定45个蛋白质点，其中表达水平上调的41个．下调4个。根据基因本体论功能注释结果，这些蛋白质的功能分为糖代谢与能量产生、抗氧化损伤、细胞骨架重排、信号转导、可变剪接、蛋白折叠与降解等。其中约1／4的蛋白质与以往文献报道相似．即与缺血、缺氧损伤密切相关。结论这些差异蛋白质的发现可促进对血-脑屏障病理生理机制的了解．为深入理解缺血性脑损伤的分子学机制提供了新的数据，并将为后续研究提供参考。     

CT引导下脑中线结构病变立体定向活检的并发症

脑组织立体定向活检是一种准确定位脑组织内部病变的有效检查方法,适应于下列情况:1)患者年龄较大/或太虚弱而不能耐受开颅术者,2)病变部位深、广泛,位于优势半球,功能性脑皮质区或混合区,3)病变范围很小,不宜手术治疗者。由于立体定向活检通常使用局部麻醉,只需在颅骨上开一小孔,对神经外科医生,内科医生乃至病人来说容易低估其可能出现的并发症。然而这种操作过程是“看不见”的,并常用于深部脑中线区病变,因此操作者应估计到严重并发症,尤其是与出血有关的并发症的发生。 资料与方法:从1986年4月至1993年6月作者对300例患者实施了脑组织活检术。患者年龄在18—88岁,平均54岁,2例儿童年龄为2岁和6     

转基因小鼠荧光神经元结构与功能之间关联的建立——膜片钳记录结合激光共聚焦三维重建

目的在细胞水平建立神经元结构和功能之间的关联。方法利用D1多巴胺受体表达红色荧光蛋白的细菌人工染色体(bacterial artifical chromosome,BAC)转基因小鼠制备脑片,对D1多巴胺受体荧光阳性纹状体中等多棘神经元(medial spiny neurons,MSNs)进行膜片钳电生理记录和细胞标记,再经激光共聚焦系统对该神经元进行结构的三维重建,观察MSN树突分支密度以及树突棘形态学特点。结果 (1)电生理结果提示所标记的细胞具有偏超级化的静息膜电位(-87mV)、较小的输入电阻(16.4 MΩ)及较长的动作电位潜伏期(172ms)等典型的MSN电生理学特征。(2)三维重建结果可见细胞胞体略成圆锥体,树突呈放射状向四周发散。(3)进行树突棘重塑后发现MSNs平均树突棘长度(2.37±0.14)μm,平均宽度为(1.39±0.14)μm。结论描述神经元功能的膜片钳数据与三维重建的细胞形态学数据相结合的方法可建立神经元结构和功能之间的关联。     

脑小血管病伴皮质下缺血性抑郁患者脑结构和功能变化及其与脑源性神经营养因子基因多态性的相关性研究

目的探讨脑小血管病(CSVD)伴皮质下缺血性抑郁(SID)患者脑灰质体积及分数低频振幅(fALFF)的变化及其与脑源性神经营养因子(BDNF)基因多态性的关系。方法选择2017年7月至2020年11月就诊于安徽医科大学第一附属医院神经内科门诊或住院的CSVD患者87例,分别对其进行认知功能和情绪评估、磁共振扫描及BDNF基因检测;根据老年抑郁量表(GDS)评分将CSVD患者分为CSVD伴SID组(CSVD-SD,GDS评分>10分)和CSVD非抑郁组(CSVD-ND,GDS评分≤10分);利用脑结构和功能磁共振扫描数据进行脑灰质体积及fALFF计算,分析SID脑结构和功能的变化及其与BDNF基因多态性的关联,以及诊断-基因交互作用对脑结构和功能的影响。结果CSVD-SID组患者灰质体积在后默认网络(pDMN)脑区(如后扣带回、楔前叶)及左侧颞中回脑区显著增加。脑灰质体积的遗传主效应及诊断主效应均不显著,但CSVD-SID诊断与BDNF基因型在楔叶(F=25.50,P<0.001)、楔前叶(F=13.61,P<0.001)及小脑(F=17.23,P<0.001)存在交互作用。在脑功能方面,与CSVD-ND组相比,CSVD-SID患者在额上回脑区fALFF值显著增加(0.363±0.648与-0.427±0.514,簇大小=48体素,t=5.63,P<0.001)。fALFF的遗传及诊断主效应均不显著,且CSVD-SID诊断与BDNF基因无明显交互作用。结论CSVD-SID患者存在多个脑区灰质体积及fALFF增加,以pDMN和额叶脑区为著,且仅在脑灰质体积方面,CSVD-SID诊断与BDNF基因型之间存在交互作用。     

早发青少年精神分裂症患者皮质下脑结构协变连接异常的研究北大核心CSCD

目的 探讨早发青少年精神分裂症患者皮质下脑结构体积和协变连接异常变化.方法 对39例首次发病未用药的早发青少年（12～18周岁）精神分裂症患者（患者组）以及31名年龄、性别及受教育程度与之相匹配的健康志愿者（对照组）进行全脑磁共振扫描;采用Freesurfer软件对T1加权脑结构像进行图像分割配准处理,并提取皮质下脑体积进行双样本t检验分析,利用组水平线性相关构建皮质下脑区之间的协变连接,对协变连接r值进行Fisher r-to-z变换后进行组间Z检验比较分析.结果 患者组（n=35）左侧丘脑（7755 mm^3与7955 mm^3,t=-2.16,P〈0.05未校正）、左侧海马（4200 mm^3与4331 mm^3,t=-2.01,P〈0.05未校正）相对于对照组（n=29）体积减少;患者组皮质下脑区协变连接在左侧苍白球与壳核、左侧海马与杏仁核、右侧杏仁核与丘脑、右侧杏仁核与壳核、左侧壳核与右侧丘脑之间显著降低（Z=1.88～2.87,P〈0.05 FDR校正）.结论 早发青少年精神分裂症患者皮质下局部脑体积减少以及协变连接降低,这可能提示患者皮质下边缘系统、基底节脑区的结构协同发育异常.     

常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白报告分子腺病毒真核表达载体的构建

背景: 低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导生理功能完整的新血管生成。 目的：构建能够同时表达突变型低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)报告分子的新型腺病毒真核细胞表达载体。 方法：对目的基因供体质粒pCMV6-XL5- HIF1α携带的人低氧诱导因子1α基因进行测序和对其序列内部限制性内酶识别位点进行分析,利用PCR(poly- merase chain reaction,PCR)技术定点突变低氧诱导因子1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸,酶切、测序检测突变情况,将正确突变后的低氧诱导因子1α基因(突变 mutagenesis,突变后的HIF-1α基因写作HIF-1αmu)定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES- hrGFP-1中。携带HIF-1αmu基因的重组腺病毒穿梭载体经测序鉴定、Pme Ⅰ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,利用细菌内同源重组机制将HIF-1αmu和人源化绿色荧光蛋白基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒,通过Pac Ⅰ酶切及测序鉴定获得重组体。 结果与结论：经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。结果表明,成功构建了新型重组腺病毒突变型真核细胞表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1。