SARS冠状病毒N蛋白6个不同原核表达区段的抗原特性分析

目的确定原核表达的SARS—COYN蛋白不同片段抗原特性及在血清学诊断中的应用。方法在前期N蛋白抗原性初步分析的基础上,从39个原核表达不同区段的N蛋白中选取6个纯化的N蛋白即PN360（1—360aa）,PN301（1—301aa）,PN199（30—228aa）,PN185（30—214aa）,PN155b（60—214aa）,PN125（90—214aa）,采用Western—Boh和ELISA方法,检测SARS—COV阴性正常人血清与SARS—COV患者恢复后血清中抗SARS—COVN蛋白抗体。结果Western—Bolt结果表明6个片段皆能与SARS—COV阳性血清反应,但PN360和PN301与SARS—COV阴性血清存在明显交叉反应;使用PN199,PN185,PN155b,PN125作为包被抗原进行ELISA检测,分析表明PN185,PN155b区段的敏感性较好。结论原核表达的SARS—COVN蛋白PN185与PN155b区段是SARS—COV病毒感染的特异性抗体检测的较佳抗原。     

SARS冠状病毒N蛋白的克隆与表达

目的　克隆和表达SARS冠状病毒N蛋白 ,并分析其免疫学活性。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因 ;经克隆和测序分析后 ,亚克隆至表达载体pGEX 4T 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定 ;阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ;大量诱导表达N蛋白 ,亲和层析予以纯化 ;免疫印迹分析纯化蛋白对SARS的诊断效果 ;用纯化的融合蛋白免疫小鼠观察其诱导的抗体应答。结果　RT PCR扩增出N蛋白基因的特异片段 ,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中登录的SARS冠状病毒的N蛋白基因序列同源性为 99.8% ;N蛋白基因被亚克隆到表达载体pGEX 4T 2 ,在JM10 9中表达了N蛋白 ,表达的蛋白经亲和层析获得纯化 ;纯化蛋白能被SARS病人血清识别 ;免疫小鼠诱导产生了高滴度的抗体。结论　成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒 ,在大肠杆菌中表达的N蛋白融合蛋白具有良好的免疫学活性。     

一株变异SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的 :克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS CoV)N蛋白的DNA ,构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并诱导表达。方法 :采用RT PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段 ,并克隆入T EASY载体中。经PCR、双酶切鉴定后 ,测序。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX 2T中 ,表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS CoV抗体阳性血清做Westernblot。结果 :N蛋白DNA测序的结果与GenBank比对缺失 2 0个bp。GST N融合蛋白以可溶形式表达。Westernblot检测表明 ,其与抗SARS CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论 :成功地构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并表达GST N融合蛋白 ,为下一步的研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白基因的表达及其在SARS诊断中的应用

目的 获得重组SARS冠状病毒（SARS-CoV）N蛋白抗原，建立特异性诊断SAILS病毒感染的免疫学方法。方法 大肠埃希菌中表达SARS病毒N蛋白基因，用金属螯合层析纯化N蛋白，建立检测SARS抗体的EUSA方法。结果 大肠埃希菌中表达了SARS病毒全长N蛋白抗原，经包涵体洗涤和金属螯和纯化后得到纯度较高的重组蛋白。用重组抗原EUSA检测30名SARS患者抗体全部为阳性，30名正常人血清为阴性，30名发热非SARS患者血清为阴性。结论 SARS表达核蛋白可以在大肠埃希菌中得到高效表达，纯化的重组N蛋白具有良好抗原性，可用于检测SARS抗体。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白特异性单克隆抗体(McAb)，为SARS的快速诊断及致病机制的研究提供实验材料。方法 用纯化的重组SARS-CoVN蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合和亚克隆后获得分泌针对N蛋白的杂交瘤细胞株，用Western blot和间接免疫荧光法检测这些细胞株分泌的单克隆抗体特异性，并将N蛋白分3段表达初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。结果 通过细胞融合和3轮克隆化，筛选出分泌抗N蛋白的6个杂交瘤细胞株。Western blot及免疫荧光显示，获得的McAb可与SARS-CoVN蛋白及SARS-CoV发生特异性反应，有4个细胞株分泌的抗体的识别位点位于N蛋白N端，2个位于C端。结论 获得了SARS-CoV特异性单克隆抗体并进行了初步定位，可用于SARS的早期诊断及致病机制研究。     

抗SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的:研制抗SARSCoVN蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的GSTN免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗SARSCoVN蛋白mAb;用免疫双扩散鉴定Ig亚类;Westernblot和免疫组化鉴定mAb的特异性;间接ELISA检测mAb的腹水效价、相对亲和常数。结果:获得1株可分泌特异性mAb的抗SARSCoVN蛋白的杂交瘤细胞系3E10H,Ig亚类为IgG2b;其腹水效价为8×10-5;其相对亲和力1.725×10-10mol/L,Westernblot和免疫组化阳性。结论:获得特异性抗SARSCoVN蛋白的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

重组SARS冠状病毒棘突蛋白S1区基因片段的克隆、表达及免疫原性研究

目的构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)棘突(spike)蛋白(S蛋白)S1区基因(40～2001bp)分段表达载体,并研究其免疫原性。方法利用PCR技术扩增S1区基因,将其定向插入pQE30质粒,在pQE30质粒上将S1切成3段(40～751、746～1344、746～2001bp),均插入pQE30质粒,构建质粒在大肠埃希菌M15中表达,表达产物经亲和层析纯化及WesternBlot和ELISA鉴定。结果构建的3种重组质粒(pQE30/S1a、pQE30/S1b、pQE30/S1c)均高效表达,重组蛋白相对分子质量分别为26700、22500和46000,表达量分别占菌体总蛋白质的35%、35%和30%。3种重组蛋白经Ni亲和层析树脂得到成功纯化。经Western-Blot及ELISA证实,重组蛋白片段S1c(746～2001bp)可以被SARS患者血清所识别。结论成功构建了SARS-CoVS蛋白S1区基因分段表达载体,重组蛋白S1c具有较强的免疫原性,它的获得为下一步疫苗的研制奠定了基础。     

SARS患者组织中冠状病毒S蛋白的表达

目的探讨冠状病毒S蛋白单克隆抗体在5例严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)患者多脏器穿刺和尸检病理组织中的表达以及与SARS病理学特点及病原学的关系。方法应用SARS冠状病毒(SARSCoV)S蛋白单克隆抗体,对病程为1周的早期SARS死亡尸检病例和4例病程为3～5周中晚期SARS死亡病例的多器官组织进行检测和观察。结果肺泡腔内脱落的上皮细胞、单核细胞和多核合体样细胞,以及支气管黏膜上皮细胞与黏膜腺体上皮细胞、多器官内血管内皮细胞和散在浸润的单核巨噬细胞SARSCoVS蛋白均呈阳性表达。2例SARS中晚期病例肝细胞和心肌细胞亦见SARSCoVS蛋白阳性反应。结论SARSCoV单克隆抗体在SARS患者肺、支气管、肝脏和心肌等器官组织均有表达,可作为SARS病原学和病理学的辅助诊断标志,对探讨SARS传播途径及发病机制有重要意义。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的克隆表达及其临床应用研究

目的　克隆、原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)核衣壳 (N)蛋白 ,分析、评价其抗原性和在SARS血清学诊断中的应用价值。方法　采用逆转录巢式聚合酶链反应 (RT-nested PCR)扩增SARS CoV的N蛋白基因 ,克隆入pBAD-Thio TOPO原核表达载体 ,表达、纯化重组融合N蛋白 ,WesternBlot分析其抗原性和特异性 ,建立以重组N蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法 ,并与以全病毒裂解液为抗原的ELISA法进行比较。结果　重组表达载体经诱导产生了高水平的重组融合N蛋白 ,融合蛋白经亲和纯化后 ,具备了较高的纯度和抗原反应性 ,以重组蛋白为抗原的ELISA法在特异性和敏感性方面优于以全病毒裂解液为抗原者。结论　重组SARS-CoV的N蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,可作为新一代SARS-CoV抗体检测试剂盒的备选抗原     

九种冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及纯化

目的 探索SARS冠状病毒（SARS-CoV）、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等5种人类冠状病毒以及牛冠状病毒（BCoV）、鼠肝炎病毒（MHV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）和禽传染性支气管炎病毒（IBV）4种动物冠状病毒核衣壳（N）蛋白在大肠杆菌中克隆表达及纯化条件。方法 利用原核表达载体pET30a（+）经IPTG诱导表达重组蛋白,并采用离子交换及镍离子螯合亲和层析法对重组蛋白进行纯化,用SDS-PAGE及Western blot对重组蛋白进行鉴定。结果 成功表达、纯化出9种冠状病毒N蛋白,纯度达90%以上。结论 在原核系统中表达得到了高纯度的9种冠状病毒N蛋白,为相关功能性研究奠定了基础。     

SARS病毒S1蛋白的克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定

目的：研究SARS病毒感染后机体产生保护性免疫应答的规律和可能机制。方法：通过生物信息学分析，在原核表达系统中表达了SARS病毒S1蛋白。利用SARS流行前正常人血清和6份SARS患者恢复期的血清，对纯化的重组S1蛋白进行血清学分析。结果：研究中克隆表达的重组蛋白序列与公布的SARS病毒S1蛋白的序列相同。6份SARS患者恢复期的血清均能识别重组S1蛋白，而6份SABS流行前的正常人血清则不能与重组蛋白反应。结论：获得的重组S1蛋白具有与天然SARS病毒s1蛋白相同的序列，并具有与之相似的血清学反应性，为研究SARS病毒感染免疫应答的过程及其机制和制备SARS病毒的重组疫苗提供了良好的物质基础。     

Yeast expression and characterization of SARS-CoV N protein

The severe acute respiratory syndrome human coronavirus (SARS-CoV) nucleocapsid protein (N protein) is its most antigenic structural protein. The N protein gene has been cloned into a yeast expression vector pPIC9, transformed into Pichia pastoris strain GS115 and induced for expression by methanol. SDS-PAGE and Western blot showed that the N protein was expressed at a level of 3 mg/ml of culture medium. Characterization by mass spectrometry, circular dichroism and fluorescence luminescence assays showed that the expressed N protein displayed a β-sheet secondary structure in solution and it is stable in the pH range between 5.0 and 8.0. The P. pastoris-expressed N protein is believed to more closely resemble native SARS N protein than the bacterially expressed N protein.     

Purification and identification of simian parvovirus protein Vp2 expressed in E.coli

Simian parvovirus (SPV) was originally isolatedfrom cynomolgus macaques with severe anemia[1] .The clinical features of the SPVinfectioninthese monkeys show many similarities to those ofthe parvovirus B19 infections in humans [2] .Inaddition,the genomic organization protein codingstrategies of SPVare also very similar to those ofhuman parvovirus B19 .It is well knownthat SPVcontains both positive and negative single-strandedDNA,andthe positive stranded DNAcontainstwolarge openreadingfr…     

Antigenicity of hantavirus nucleocapsid proteins expressed in E. coli.

DNA clones representing the small genomic segment of Nephropathia epidemica virus strain H?lln?s B1 (NEV) and Hantaan virus strain 76-118 (HTV) encoding their nucleocapsid proteins were inserted into the E. coli vector pIN-III-ompA for secretion of proteins into the periplasmic space. The complete HTV and NEV nucleocapsid proteins and two truncated versions of the NEV nucleocapsid proteins were expressed as fusion proteins. Unexpectedly, all products accumulated as insoluble aggregates. Most of the ompA signal peptide remained uncleaved. However, nucleocapsid fusion proteins could be purified from the insoluble fraction by extraction with 8 M urea followed by separation on SDS-PAGE and electroelution. Rabbits were immunized with the eluted proteins and the resulting antibodies reacted specifically with authentic viral nucleocapsid proteins of HTV and NEV. The recombinant nucleocapsid proteins were found to react specifically with various hantavirus-immune sera, but not with human control sera, indicating their suitability as potential diagnostic antigens. This is the first report on the expression of a protein of a NEV serotype strain of hantaviruses by use of recombinant DNA techniques.     

SARS-CoV、229E和OC43的抗原相关性研究

目的：分析SARS冠状病毒（SARS—CoV）和人冠状病毒（229E和OCA3）的抗原相关性。方法：制备三株冠状病毒的免疫兔血清及其重组核衣壳（N）蛋白的免疫小鼠血清，分别采用SARS法、Western blot和免疫荧光法对免疫血清进行检测以分析三株冠状病毒的抗原相关性。结果：Westem blot结果显示重组N蛋白免疫小鼠血清仅与各自的冠状病毒或重组N蛋白有特异性反应，相互间无交叉反应，而SARS结果显示OC43重组N蛋白免疫小鼠血清与SARS—CoV、229E N蛋白出现了构象抗体的交叉反应。同时，免疫荧光结果显示SARS—CoV和OCA3免疫兔血清与229E感染细胞存在较明显的交叉反应，但在SARS、Westem blot结果中全病毒免疫兔血清均仅与各自N蛋白特异性反应，相互间无交叉反应。结论：SARS—CoV、229E和OCA3N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应，而SARS—CoV、OC43全病毒免疫血清均和229E出现明显的交叉反应。另外，基因重组的OCA3 N蛋白与另外二种N蛋白出现重组构形表位的交叉反应，提示以基因重组的蛋白作为诊断试剂，可能会因为蛋白的空间构象发生改变而产生非特异性反应。     

SARS冠状病毒N蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位的预测

目的 预测SARS冠状病毒N蛋白的HLA—A^*0201限制性CTL表位。方法 用人工神经网络和量化矩阵相结合的方法预测出HLA—A^*0201结合肽，再用蛋白酶体矩阵法从中筛选出CTL表位。结果 预测出了6个九肽CTL表位。结论 通过对SARS冠状病毒N蛋白抗原CTL表位进行预测，从而为SARS冠状病毒N蛋白之CTL表位的实验探测和鉴定提供了线索，为认识SARS冠状病毒的免疫保护和免疫病理机制及疫苗的研制提供了基础资料。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的　对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法　应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果　PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论　所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。