糖原合成酶激酶-3β在神经保护中的研究进展

背景 糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一种多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在中枢神经系统中表达丰富.近期研究表明GSK-3β活性异常参与多种疾病的病理生理机制.目的 分析总结GSK-3β活性调节在神经保护中作用及机制的文献资料.内容 描述GSK-3β的基本结构、组成;调节方式;GSK-3β抑制剂在脑缺血/再灌注损伤中的保护作用及相关机制. 趋向 GSK-3β抑制剂对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用,其特异亚型抑制剂及基因沉默的研发在脑缺血/再灌注损伤治疗方面具有良好的应用前景.     

大鼠胸腺素β4基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠胸腺素β4 (Tβ4)基因的重组慢病毒载体,转染293T细胞并观察Tβ4的表达.方法 从Genbank获取大鼠Tβ4基因序列,化学合成后连接入线性化慢病毒载体pGC-FU,得到重组慢病毒载体pGC-FU-Tβ4,将其转化细菌感受态细胞后行菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定,对PCR鉴定阳性的克隆进行测序鉴定. pGC-FU- Tβ4、pHeIper 1.0、pHelper 2.0共转293T细胞,收集上清液浓缩后使用实时定量PCR(Real-time PCR)进行滴度检测.用所得病毒感染293T细胞后,Western blot检测Tβ4表达.结果 目的基因质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱示酶切片段大小为143 bp;菌落PCR结果示阴性转化子得到198 bp片段,阳性转化子得到333 bp片段;测序结果与预期相符合;Real-time PCR示所得病毒滴度约为2×109TU:Western blot示Tβ4转染组在33 KD处有特征条带.结论 成功构建大鼠Tβ4基因慢病毒载体pGC-FU- Tβ4,并建立慢病毒过表达系统.     

表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体.方法 根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为pGC-FU-Cdh1.对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定.将293T细胞按完全随机法分为实验组(每组3只)及对照组(每组3只),分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞,倒置荧光显微镜观察后,Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况,慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定. 结果 重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中;转染293T细胞后,Western blot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1 -GFP的表达(每组3只),对照组无Cdh1-GFP的表达(n=0)(P=0.014);慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,Reahime PCR法测定滴度为2E+8 TU/ml. 结论 成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1,并包装为慢病毒,为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础.     

靶向糖原合成酶激酶-3β抗骨肉瘤的实验研究

 目的 研究糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在骨肉瘤细胞增殖中的作用及相关分子机制,探讨其在骨肉瘤靶向治疗中的价值。方法 Western blot检测人成骨细胞及骨肉瘤细胞p-GSK-3β(Ser9)表达水平,观察GSK-3β抑制剂及siRNA干扰对细胞增殖、凋亡的影响,利用凋亡蛋白芯片筛查并验证GSK-3β调控骨肉瘤细胞的分子机制,通过裸鼠体内实验评估靶向GSK-3β对于骨肉瘤的治疗价值。结果 在骨肉瘤细胞中p-GSK-3β(Ser9)表达水平明显低于成骨细胞。GSK-3β特异性抑制剂及siRNA干扰均可明显抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡蛋白cleave-caspase 3表达量明显上调。通过蛋白芯片筛查显示一组NF-κB调控的靶基因蛋白survivin、cIAP-1、XIAP及Bcl-2明显下调。Western blot验证了上述芯片结果,并发现氯化锂处理后p-IκBα水平下降,核内NF-κB p65表达量下降。NF-κB双荧光素酶报告系统检测稳定过表达持续活化GSK-3β细胞中NF-κB转录活性与空载体组细胞相比明显升高,而稳定干扰GSK-3β的细胞中NF-κB转录活性与空载体组细胞相比明显下降。裸鼠体内动物实验发现稳定干扰GSK-3β和采用氯化锂均可明显抑制骨肉瘤皮下移植瘤的生长。结论 GSK-3β在骨肉瘤中处于相对活化状态,可通过上调NF-κB转录活性调控骨肉瘤细胞增殖;靶向GSK-3β是骨肉瘤潜在的治疗新策略。     

糖原合成酶激酶3与前列腺癌研究进展

糖原合成酶激酶3(GSK-3α和GSK-3β)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它能作用于多种底物,参与细胞增殖与存活、糖原代谢和自噬等调控。免疫组化研究发现GSK-3的两个亚型中,GSK-3α主要在雄激素依赖性前列腺癌表达增强,而GSK-3β则在雄激素非依赖前列腺癌中表达升高,且GSK-3β参与雄激素受体的转录活性调控和体内前列腺癌的生长。动物实验研究证实氯化锂等GSK-3特异性抑制剂对前列腺癌异植瘤生长具有显著抑制作用。GSK-3抑制剂有可能作为晚期前列腺癌的辅助治疗药物。     

NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建NEP1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达。方法从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段。将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况。结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确;荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒;Western blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达。结论成功构建NEP140基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础。     

Lv-shRNA-Hsa-microRNA-691慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建Lv-shRNA-hsa-microRNA-691慢病毒表达载体。方法 PCR扩增pri-miR-691-2前体序列,克隆至plenti-GFP慢病毒表达载体;双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测。构建成功后感染人胰腺癌细胞Panc-1,48h后Real-time Q-PCR检测miR-691的表达。结果酶切、测序鉴定证明插入序列正确,测定病毒滴度为1×109TU/m L,病毒感染48h后的Panc-1胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光,Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-691表达量较未感染细胞显著增高。结论建立了高效稳定表达Lv-shRNA-hsa-miR-691的慢病毒转染系统。     

糖原合成酶激酶-3β在危重疾病中抗炎作用的研究进展

糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是细胞中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与糖原的代谢,细胞内信号的转导,基因的转录和翻译;调节多种细胞激活、分化和生存.近年来发现,GSK-3β抑制剂在肺损伤、缺血/再灌注损伤、胰腺炎、脑损伤等危重病巾发挥抗炎作用,因此,抑制GSK-3β可能为治疗这些危重病提供一条新的途径.     

磷酸化糖原合成酶激酶-3β在大鼠移植肾早期病理改变中的作用

目的 探讨糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在大鼠移植肾早期病理改变中的作用.方法 以F344大鼠为供者,Lewis大鼠为受者,依照标准的慢性移植肾肾病(CAN)模型要求行左肾原位移植,制作CAN模型(移植组).术后7d切除受者的右肾.以切除一侧肾脏的雄性F344大鼠和Lewis 大鼠为对照(F344对照组和LEW对照组).分别于术后4、8、12、16及24周时收集24 h尿液,采集血液,测定24 h尿蛋白和血肌酐,取移植肾组织,观察组织学改变,并用免疫组化法检测肾组织中磷酸化GSK-3β表达.结果 移植组术后早期(4、8和12周)移植肾病理改变主要表现为单个核细胞浸润、血管平滑肌细胞(SMC)的移行增殖,在后期(16和24周)尿蛋白排泄率显著增高,移植肾病理改变表现为肾间质单个核细胞浸润明显增加及严重的肾间质纤维化、肾小管萎缩.移植组术后各时间点移植肾组织中磷酸化GSK-3β及其mRNA表达水平均显著低于LEW对照组和F344对照组相同时点的表达水平(P＜0.05),并随着移植时间的延长进一步降低.磷酸化GSK-3β表达水平与早期肾间质单个核细胞浸润程度、SMC移行增殖及后期肾间质纤维化、肾小管萎缩、血管硬化程度呈显著负相关.结论 磷酸化GSK-3β表达下调在大鼠移植肾早期的肾间质单个核细胞浸润、SMC移行增殖及后期的肾间质纤维化、肾小管萎缩、肾血管硬化病变的发生中均起重要作用.     

大鼠Smad6慢病毒干扰载体的构建与鉴定

目的 构建大鼠Smad6基因的慢病毒干扰载体,并在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)中验证其基因沉默效率.方法 针对大鼠Smad6基因设计、合成两对Smad6-shRNA干扰序列,并将其重组到pLKO.1质粒载体中.测序验证后在HEK293T细胞内组装慢病毒.最后体外分离培养大鼠BMSC,通过慢病毒感染将Smad6干扰序...     

产甲酸草酸杆菌FRC基因慢病毒表达载体构建及鉴定

产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,Ox.F)是一种寄居于脊椎动物胃肠道、依赖分解肠道草酸生存的革兰阴性菌[12].我们采用基因克隆重组技术从前期分离培养的中国人肠道Ox.F[3]中克隆了草酸分解关键酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因FRC,并成功构建重组慢病毒表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP,为高草酸尿症基因治疗提供基础.     

双靶向调控CDX2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建5个拷贝的HRE和hTERTp双靶向调控表达CDX2基因的慢病毒表达载体,并在结肠癌LoVo细胞中检测其启动活性。方法 设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆获得hTERT启动子,用双酶切和PCR法切除笔者所在课题组已构建的载体pLEGFP-5HRE-CEAp中的CEA启动子后,将hTERT启动子与该载体重组,构建出pLEGFP-5HRE-hTERTp;提取5HRE-hTERTp基因序列,同时双酶切切除pLVX-EGFP-3FLAG载体中的CMV启动子,同源重组构建获得pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体。设计引物应用PCR法从笔者所在课题组已构建的GV230-CDX2-EGFP载体中克隆获得CDX2基因序列,用双酶切和PCR法切除载体pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG中的EGFP后,将CDX2基因序列与该载体重组,构建出pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG。应用pLVX-5HRE-hTERTp- EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,通过观察绿色荧光蛋白EGFP的表达,鉴定hTERTp的启动活性。结果 经PCR和测序分析,pLEGFP-5HRE-hTERTp、pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG 3组质粒与设计一致,测序正确。将pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG载体瞬时转染体外培养的人结肠癌LoVo细胞,有绿色荧光表达,提示hTERT启动子能够有效启动下游基因的表达。结论 成功构建了pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG载体,为后续的体外和体内研究打下了基础。     

小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础.方法：以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定.结果：Ppif的短发夹RNA（shR-NA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致.结论：构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础.     

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

CXCL13基因重组慢病毒载体的构建及表达

种子细胞捕获体系的核心环节为种子细胞归巢,趋化因子及其受体是调节种子细胞归巢的关键因子[1].骨组织表达的趋化因子CXCL13能与骨髓间充质干细胞(BMSCs)强表达的受体CXCR5特异性结合从而引起BMSCs的定向迁移[2].本研究旨在构建CXCL13基因重组慢病毒载体.     

CXCL13基因重组慢病毒载体的构建及表达

种子细胞捕获体系的核心环节为种子细胞归巢,趋化因子及其受体是调节种子细胞归巢的关键因子[1].骨组织表达的趋化因子CXCL13能与骨髓间充质干细胞(BMSCs)强表达的受体CXCR5特异性结合从而引起BMSCs的定向迁移[2].本研究旨在构建CXCL13基因重组慢病毒载体.     

CXCL13基因重组慢病毒载体的构建及表达

种子细胞捕获体系的核心环节为种子细胞归巢,趋化因子及其受体是调节种子细胞归巢的关键因子[1].骨组织表达的趋化因子CXCL13能与骨髓间充质干细胞(BMSCs)强表达的受体CXCR5特异性结合从而引起BMSCs的定向迁移[2].本研究旨在构建CXCL13基因重组慢病毒载体.     

人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

【摘要】 目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法〓设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平。结果〓重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论〓成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础。