胸苷激酶基因治疗人多形性胶质母细胞瘤BT325并诱导BT325和…

了解转单纯疱疹病毒胸苷激基因前后胶质瘤细胞对更昔洛韦的药物敏感性；钙通道阻滞剂尼莫地平是否增强ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因治疗的肿瘤杀伤作用，以及该治疗方法能否诱导胶质瘤细胞凋亡。方法：用带有ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ基因的重组逆转录病毒载体，转染人多形性胶质母细胞瘤株ＢＴ３２５。     

胸苷激酶基因治疗恶性胶质瘤Ⅰ期临床研究

目的用插入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的逆转录病毒包装细胞(pLTKcSN/VPC)和更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)治疗恶性胶质瘤,探讨其毒副作用和疗效。方法14例恶性胶质瘤尽可能切除肿瘤,瘤床多点注射pLTKcSN/VPC,注射点每人平均50点,接种量依据瘤床面积而定,每人注射量8～16ml不等,平均13.92ml/人,于术后7～10d开始,静脉点滴GCV,10mg·kg-1·d-1,分2次,12h1次,持续2周。结果本组毒性比较轻,均能耐受。胶质母细胞瘤组平均存活23.9个月,存活时间超过12个月病人占75%,存活时间超过23个月病人占50%,最长存活时间50个月的病人死于其他疾病。恶性胶质瘤组平均存活29.2个月,存活时间超过24个月病人占67%,存活时间超过36个月病人占33%,最长存活时间54个月,病人至今存活,无肿瘤复发迹象。结论pLTKcSN/VPC和GCV治疗恶性胶质瘤毒副作用低,对部分胶质瘤有比较明确的治疗作用。     

胸苷激酶基因治疗脑胶质瘤25例报告

目的 报告25例脑胶质细胞瘤用含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的逆转录病毒载体生产细胞（pLTKcSN/VPC）注入和羟甲基无环鸟苷（GCV）全身给药治疗脑胶质瘤2～5年随访观察（失访1例）的结果,并拟申请Ⅱ期临床试验。方法 选择大脑半球侧脑室外区确诊为脑胶质瘤的病例,在直视或显微镜下行全切除或大部分切除术,残腔周围脑组织内每隔1cm、深1.5cm用微量注射泵注入预制的基因工程细胞,10～14d后开始每天2次静脉内滴入GCV5mg·kg-1·12h-1,共14d,术后4～5周按常规给予化疗药物氯乙环已亚硝脲（CCNU）和（或）表鬼臼毒噻吩糖苷（VM26）。同时,与我院以往病情相近的经常规治疗的30例恶性胶质瘤（间变型29例,多形性胶质母细胞瘤1例）的生存率相比较。结果25例均安全渡过围手术期。在22个月以前,基因治疗组的情况均优于手术加化疗（ACCNU和VM26）的常规治疗组。基因组的中位生存时间为（470±93.17）d,12个月的生存率为0.6,18个月为0.35;常规治疗组的中位生存时间为（395±93.15）d,12个月的生存率为0.5,18个月为0.33。1例间变型少突胶质瘤患者至今已正常生活60.3个月;1例间变型星形细胞瘤患者已正常生活25个月,尚未见再发征象;另有1例多形性胶质母细胞瘤在2年时MRI才见有肿瘤扩增（47.9个月后失访）;4例星形细胞瘤术     

胸苷激酶基因治疗人脑胶质瘤SHG44的研究

构建了含有ｐｇｋ启动子驱动的ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ｐＬＮＴＫ，并成功地转移至人脑胶质瘤ＳＨＧ４４细胞。体内实验证实，ＡＣＶ可抑制ＳＨＧＬＮＴＫ的肿瘤形成，并可抑制ＳＨＧＬＮＴＫ肿瘤的生长。原位基因转移治疗ＳＨＧ４４肿瘤效果明显。提示其可作为脑肿瘤治疗的一种新方法。     

多形性胶质母细胞瘤基因治疗的研究进展

基因治疗有望改变胶质母细胞瘤临床疗效。目前在导入自杀基因、修复或导入抑癌基因、肿瘤免疫基因治疗、血管生成抑制基因治疗、溶瘤病毒治疗等基因治疗策略方面展开了广泛的研究。但因存在GBM发病机制不明确,基因载体、基因转染调控技术不完善,安全性等问题。目前尚没有基因治疗在临床中取得良好效果的报道。     

恶性脑胶质瘤的基因治疗

恶性胶质瘤是最常见的颅内肿瘤 ,传统的治疗方法主要有外科手术、放疗、化疗 ,但是疗效均不甚理想。 1 992年Ｏｌｄｆｉｅｌｄ首次采用基因治疗恶性脑胶质瘤患者并取得一定疗效后 ,得到众多学者的认同和参与 ,并在全球得以深入开展。目前恶性脑胶质瘤基因治疗主要采用自杀基因 (ＴＫ、ＣＤ) ,抑癌基因 (Ｐ53、Ｐ1 6、Ｐ2 1 ) ,细胞因子免疫基因 (ＩＬ2、ＩＬ4、ＩＦＮａ)、反义基因 (ＶＥＧＦ、ＴＧＦ ａ、ＥＧＦＲ)等方法。在治疗中涉及的技术因素主要有基因的转移 ,基因治疗的策略等。现将有关内容综述如下。1　基因的转移　基因指编码蛋…     

FasL基因治疗移植于裸鼠的人脑胶质母细胞瘤的实验研究

目的 :探讨FasL基因在体内诱导胶质瘤细胞凋亡和抑制增殖的作用。方法 :在裸鼠皮下种植Fas表达阳性的人脑胶质母细胞瘤细胞系TJ90 5 ,成瘤后 ,利用脂质体介导FasL基因瘤内治疗 ,在 3 9d观察期间 ,用千分尺测量肿瘤生长 ,最终取出肿瘤 ,用原位杂交 ,免疫组化鉴定FasL基因和蛋白的表达 ,应用TUNEL法检测细胞凋亡 ,Ki 67免疫组化检测细胞增殖。结果 :FasL基因瘤内注射观察 3 9d后 ,治疗组瘤体积明显小于对照组 (P <0 0 1) ,肿瘤组织细胞内FasL基因表达增加 ,凋亡细胞数增多 ,细胞增殖率降低。结论 :FasL基因对Fas表达阳性胶质瘤有治疗作用。     

人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系“BT325”的建立及其生物学特性

本文报道一例人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系“BT325”的建立及其生物学特性,至今已传180代,维持4年以上,生长稳定,每周传代一次,细胞形态多样,星球状,双极形,星形及少量多核巨细胞。透射电镜可见多量微管及束状微丝。异种移植至裸鼠皮下生长肿瘤,病理切片经 HE、PTAH 及 Foot's 染色均证实为恶性胶质瘤。免疫化学染色胶质纤维酸性蛋白(GFAP)呈阳性反应,生长曲线计算倍增时间为36.5小时,染色体组型显示亚四倍体,90%以上显示有标记染色体。细胞周期时相分析用FCM 法计算出各时相的百分比为 G_1=52.94%,S=28.08%,G_2+M=18.98%,用 PLM 法计算出各时相的时间为 T_c=37.5小时、TG_1=16.2小时,T_s=10.5小时,TG_2+M=10.8小时,TM 估计值为0.8小时,细胞冻融存活率为77%左右,认为本系细胞生长和特性稳定,可作筛选化疗药物,有一定帮助。     

反转录病毒介导的HSV-tk基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的：进行Ｃ６大鼠脑胶质瘤的基因治疗实验研究。方法：采用反转录病毒介导的基因转移和ＡＣＶ体内治疗方法进行研究。结果：构建了带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ，应用脂质体转移方法将ＧＩＮａＴＫ导入反转录病毒包装细胞ＰＡ３１７，成为产病毒细胞ＰＡ３１７ＴＫ，用带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的复制缺陷型反转录病毒感染Ｃ６细胞，命名为Ｃ６ＴＫ细胞，对ＧＣＶ和ＡＣＶ的敏感性分别高于亲本４５０倍和１０倍；成功地建立了大鼠脑胶质瘤模型，并证实转染细胞Ｃ６ＴＫ的成瘤效应未改变，存活期约为１５天；而经ＡＣＶ治疗后，含有Ｃ６ＴＫ细胞的肿瘤生长明显被抑制，大鼠生存期延长为５７．８±８．０７天，尤其是采用ＰＡ３１７ＴＫ细胞混和治疗组和原位治疗组，肿瘤基本消失，大鼠生存期显著延长，混和治疗组存活１２０天以上，原位治疗组存活至７１．４±３６．１天。ｔ检验，Ｐ值均小于０．００１。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗大鼠脑胶质瘤疗效显著。     

5'-FITC标记的PCNA反义寡核苷酸在人多形性胶质母细胞瘤细胞BT325中的分布和稳定性分析

目的 观察修饰型和非修饰型PCNA反义寡核苷酸在阳离子脂质体介导下或直接转染人多形性胶质母细胞瘤细胞BT325后在细胞内的分布及其稳定性,探讨其机理。方法 将异硫氰酸荧光素(5’-FTTC)标记的18mer硫代磷酸化修饰型及未修饰型PCNA反义寡核苷酸在脂质体介导下或直接转染人多形性胶质母细胞瘤细胞BT325,应用荧光显微镜动态观察荧光在转染细胞内的时相分布。结果 修饰型反义寡核苷酸直接转染细胞30min后,荧光在胞浆内呈现离散型点状分布,6h后胞浆荧光较强但仅有极少数细胞核有荧光积聚。在脂质体介导下,荧光细胞数目明显增加,2h后几乎所有细胞核内均出现荧光,持续24h后核内荧光逐渐减弱。而未修饰型反义寡苷酸在直接转染或脂质体介导下均发现荧光在数小时后消散。结论 阳离子脂质体DOSPER不仅能促进PCNA反义寡核苷酸进入BT325细胞核,而且其与反义寡核苷酸形成的脂质体/反义寡核苷酸复合物对反义寡核苷酸有一定的保护作用;硫代磷酸化修饰能增加PCNA反义寡核苷酸在BT325中的稳定性。     

逆转录病毒载体介导中国单疱病毒TK基因转导脑胶质瘤细胞

目的：研究载中国单疱病毒胸苷激酶基因逆转录病毒重组体（ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ）和羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）体外转染和杀伤脑胶质瘤效果，探索应用该系统基因治疗脑胶质瘤。方法：ＲＶ－ＨＳＶ－ＴＫｃ重组体病毒感染胶质瘤细胞，Ｇ４１８筛选转染阳性胶质瘤细胞克隆。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测抗Ｇ４１８胶质瘤细胞中的ＴＫｃ基因表达。药物敏感实验观察ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的毒性反应。结果：１．０ｍｇ／ｍｌＧ４１８筛选１０～１４天获抗性胶质瘤细胞克隆；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示抗Ｇ４１８细胞ＴＫｃ基因明显表达；ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ高度敏感，其ＥＤ５０为：Ｃ６ＴＫｃ０．０２μｇ／ｍｌ，Ｕ２５１ＴＫｃ０．００６μｇ／ｍｌ，Ｕ８７ＴＫｃ０．００４μｇ／ｍｌ，ＴＫｃ胶质瘤细胞对ＧＣＶ的敏感性是非转基因胶质瘤细胞的５００倍以上。结论：载中国ＴＫｃ基因逆转录病毒重组体可有效转染脑胶质瘤细胞并使其对ＧＣＶ高度敏感，该系统可望用于脑胶质瘤的基因治疗。     

siMDR1基因转染人类BT325胶质瘤细胞系的表达

目的探讨siMDR1基因转染人类胶质母细胞瘤细胞BT325后细胞的表达能力。方法设计并合成siRNA质粒,取培养对数期生长良好的胶质母细胞系BT325,传代培养。将阳离子脂质体(Lipofectamine 2000)和质粒MDR1 DNA按比例共转染。瞬时对转染成功的细胞系应用抗性药物-嘌呤霉素进行筛选,筛出稳定的细胞系后,分别在荧光显微镜下分析转染情况。通过免疫细胞化学染色及图像分析对瞬时转染和稳定转染的BT325细胞进行检测,确定MDR1基因产物P-糖蛋白(P-gp)表达水平。阿霉素对瞬时转染及稳定转染的BT325耐药性进行分析。结果成功构建了逆转录病毒si RNA质粒载体,经过瞬时转染BT325细胞生长状态良好,48h表达绿色荧光最强。加入嘌呤霉素筛选后,在第8天出现单细胞克隆。免疫细胞化学染色证实瞬时转染与稳定转染BT325细胞P-gp的表达下降。细胞的转染效率为70%～80%。BT325细胞经过RNA干扰,细胞对MDR1耐药性明显下降,IC_(50)降低,细胞的耐药因子(RF)有所升高。结论siMDR1基因瞬时转染和稳定转染都可以抑制P-gp蛋白的表达,其可以作为基因治疗的重要手段。     

EGF抑制BT325细胞生长的相关基因分离、克隆

目的 寻找抑制胶质瘤细胞生长的新的相关基因。方法 应用mRNA差异显示技术与cDNA array反向Northern杂交相结合，分离、克隆表皮生长因子（EGF，100ng/ml)作用后生长抑制的人脑多形性胶质母细胞瘤BT325细胞与对照组（不加EGF）相比新表达或表达明显上调的基因。结果 克隆了6个BT325细胞生长抑制后表达明显增高的EST（expressed sequence tag)，其中1个为新基因序列，另5个分别与CGI－51、转醛缩酶（Transaldolase、TAL）、核糖蛋白L35a、40s核糖相关蛋白基因及BC－2蛋白mRNA有不同程度的同源性，其中功能分析提示TAL表达增加可诱导细胞凋亡。6个EST均投递GenBank，分别获得了接受号：AW408844－408848。结论 所分离、克隆的基因可能与胶质瘤的生长抑制有关。     

Neuron specific enolase (NSE) and thymidine kinase (TK) as markers in biological fluids of brain tumor patients

We studied the activity of two enzymes NSE and TK in the biological fluids of 104 patients with nervous system diseases, who fell into 4 groups. 20 subjects out of 35 in the tumor group had glial tumors. We fixed a cut-off value of NSE and TK activity at the 95^th percentile of the control group, both in serum and in CSF. The aim of our investigation was to assess the reliability of TK and NSE assays in separating brain tumors from other neurological diseases. In our patients, most of the TK activity above the cut-off value was found in the tumor group. Serum TK seems to be a useful marker for following up cerebral tumors after surgery, but NSE is less useful for this purpose.

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Sommario Abbiamo studiato l'attività di due enzimi NSE e TK nei liquidi biologici di 104 Pazienti affetti da patologie del sistema nervoso. I Pazienti sono stati divisi in quattro gruppi: dei 35 Pazienti affetti da neoplasie 20 erano portatori di un tumore della serie gliale. Su liquor e su siero il valore cut-off dell'attività di NSE e TK è stato fissato al 95^o percentile del gruppo controllo. Lo scopo del nostro studio è stato quello di stabilire la affidabilità del dosaggio della NSE e della TK nel separare i tumori cerebrali da altre patologie d'interesse neurologico. Nei nostri Pazienti la maggiore attività enzimatica al di sopra del valore cut-off è stata riscontrata nel gruppo tumorale. I livelli serici di TK sembrano essere un utile marker per la valutazione del follow-up post-chirurgico dei Pazienti affetti da tumore gliale, mentre la valutazione dei valori della NSE non sembra utile a tale scopo.

     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因和更昔洛韦系统的灵长类动物体内毒副作用

目的在灵长类动物中观察单纯疱疾病毒１型胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）及更昔洛韦（ＧＣＶ）系统的短期和长期毒副作用。方法恒河猴７只，其中１只设为正常对照，其余６只动物于右侧额叶白质内注射ＨＳＶ－ＴＫ的包装细胞悬液（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ），细胞注射后７天起，其中３只动物经外周浅静脉滴注ＧＣＶ，剂量５ｍｇ／ｋｇ·ｄ，共１４天；另外４只不用药。动物在不同时间点处死，取注射针道周围的脑组织进行ＨＳＶ－ＴＫ序列原位杂交，并取全身各脏器进行全面组织学检查和ＨＳＶ－ＴＫ序列ＰＣＲ检测。结果３个月内，中枢神经系统的主要病理变化为脑干脱髓鞘变。其它病理变化包括心肌间质灶性炎症，肝脏浊肿变性，肾小管浊肿变性甚至水样变性，但这些病理变化在３个月后处死的动物中已不存在。ＨＳＣ－ＴＫ序列原位杂交结果见细胞注射后３周内有阳性细胞存在，３个月后处死的动物呈阴性改变。实验过程中动物的血液和脑脊液各项指标的动态观察未见有特异性改变。结论ＨＳＶ－ＴＫ及ＧＣＶ系统在用药后短期内对灵长类动物的心脏、肝脏和肾脏有一定的毒性损害作用，但是可恢复的。关键词##4脑肿瘤;;胸苷激酶基因;;更昔洛韦;;逆转录病毒     

突变型胸苷激酶对鼠C6胶质瘤细胞的杀伤效应

目的 观察比较突变型单纯疱疹胸苷激酶(HSV1-sr39tk)/更昔洛韦(GCV)和野生型HSV1-tk/GCV对鼠C6胶质瘤细胞的杀伤效应.方法 利用真核表达载体转染目的 基因到C6细胞,RT-PCR鉴定.通过MTT实验和活体植瘤,比较各组对GCV敏感性.结果 成功获得分别转染有HSV1-tk(C6/tk)和HSV1-sr39tk(C6/sr39tk)、的C6细胞.GCV浓度在0～400μmol/L时,C6/sr39tk细胞存活率由(99.96±3.54)%下降到(4.75±1.79)%;C6/tk细胞存活率从(100.03±2.95)%降至(59.16±3.48)%,未转染组细胞存活率则从(100.29±1.20)%到(83.62±7.56)%.同一GCV浓度时,各组间细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05).各组细胞在活体均能致瘤,GCV治疗10 d后,C6、C6/tk和C6/sr39tk组肿瘤大小分别为(1287.24±364.84)mm3、(928.47±165.61)mm3和(574.08±107.72)mm3,较治疗前均有一定程度的生长,但后两组生长较前组明显减缓,以C6/sr39tk组生长减缓最明显.组间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 体外和体内实验证实HSV1-sr39tk比HSV1-tk对GCV更敏感,可提高其与GCV所组成的自杀基因系统对C6胶质瘤细胞的杀伤效应.     

FasL基因转染NIH3T3细胞诱导BT325胶质瘤细胞凋亡作用的研究

目的探讨FasL基因诱导胶质瘤细胞凋亡的作用。方法以脂质体将FasL基因转染NIH3T3纤维母细胞,采用免疫组化染色法和RT-PCR法检测NIH3T3/FasL细胞中目的基因的表达和转录,Hochest33342荧光染色法和TUNEL法检测共培养条件下观察其对胶质瘤细胞BT325诱导凋亡的作用。结果NIH3T3/FasL细胞能有效表达FasL,与NIH3T3细胞(对照组)相比,有显著诱导BT325细胞凋亡的作用(P﹤0.05)。结论转染了FasL基因的NIH3T3细胞可诱导胶质瘤细胞凋亡。     

人类野生型p53基因对9L胶质肉瘤的抑制作用

目的：观察人类野生型ｐ５３基因对ｐ５３突变的大鼠胶质肉瘤细胞９Ｌ的抑制作用。方法：在体外用逆转录病毒载体转移人野生型ｐ５３基因到９Ｌ胶质肉瘤细胞中，经Ｇ４１８筛选后，体外培养和大鼠体内接种；观察瘤细胞形态和肿瘤重量变化，用免疫组化法检测人ｐ５３蛋白的过度表达。结果：人野生型ｐ５３基因在体内体外均可明显抑制９Ｌ瘤细胞的生长，皮下肿瘤抑制率６２．９３％，脑内肿瘤抑制率为８５．１８％。转ｐ５３基因后肿瘤分化程度提高，部分肿瘤有非肿瘤性纤维母细胞增生和大量浆细胞浸润，瘤细胞生长状态欠佳。结论：转移异源性ｐ５３基因可以重建ｐ５３的肿瘤抑制功能；并可能增强免疫系统对表达异源性ｐ５３蛋白的瘤细胞的识别，激发抗肿瘤免疫反应。因此产生双重的抗肿瘤作用，有潜在的临床应用价值。