支原体培养上清中Ⅰ型人类免疫缺陷病毒逆转录酶抑制物质的鉴定

据报道发酵支原体的培养上清能抑制HIV—1逆转录酶(RT)活性。本工作对培养上清中抑制RT活性的成份进行了鉴定。用标准检测方法测定RT活性。在RT活性测定系中由培养上清产生的对RT活性的明显抑制作用可被EDTA解除。培养上清显示出DNase和RNase活性,它们分别能够降解在RT检测系中的产物和基质,即plasmidDNA pUC118和poly(rA)·oligo(dT)_(12-18)。结果表明:发酵支原体培养上清对HIV—1 RT活性的明显抑制作用主要来自于培养上清中的核酸酶活性。     

PPD对人PBMC的HIV复制和细胞因子产生的影响

目的：明确结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)对PBMC内HIV-1复制的作用及其对细胞因子分泌的影响。方法：HIV-1 SF-33毒株分别感染结核菌素试验阳性(PPD( ))和阴性(PPD(-))健康人的PBMC后，与PPD共孵育72小时，用ELISA方法检测上清中HIV-1 p24抗原、TNF-α和IL-10的含量。结果：在PPD( )的健康人，PPD能显著诱导PBMC内HIV-1的复制，促进HIV-1感染的PBMC分泌TNF-α，同时抑制IL-10的分泌。在PPD(-)的健康人，未见到PPD显著诱导PBMC内HIV-1的复制。结论：在我国PPD( )的健康人，PPD促进HIV-1感染的PBMC分泌TNF-α，并抑制IL-10的分泌，导致HIV-1复制增加。     

丙型肝炎病毒感染患者PBMC细胞因子的分泌水平

目的 :检测丙型肝炎病毒 (HCV)感染患者外周血单个核细胞(PBMC)体外培养后 ,培养上清中细胞因子分泌的水平 ,以反映HCV患者体内的免疫状况。方法 :患者PBMC培养上清中的细胞因子 (IL 2、IL 4、IL 10、IL 12、TNF γ、TNF α)采用ELISA进行检测。结果 :(1)HCV感染患者的PBMC培养 72h后 ,细胞因子检测结果表明 :与正常对照组相比较 ,HCV患者PBMC培养上清中TNF γ、IL 10和TNF α的水平明显升高 ,而没有检测到IL 2、IL 4、和IL 12的分泌产物。 (2 )轻、中度慢性肝炎 ,以及代偿期、失代偿期肝硬化患者间细胞因子的水平未见明显差异。结论 :(1)HCV感染患者体内细胞因子的分泌倾向于Th2型细胞因子占优势。 (2 )HCV感染患者PBMC分泌IL 2水平的降低可能是HCV免疫逃逸的原因之一     

人肺癌PG细胞培养上清液对PBMC凋亡的影响

目的:探讨PG肿瘤上清对外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖抑制及诱导凋亡方面的影响,并探讨了PG细胞影响PBMC凋亡的作用机制。方法:在PBMC培养体系中分别加入不同条件的PG培养上清。在24、72小时收集PBMC,采用流式细胞术测定其对PBMC细胞周期、凋亡率的影响,另外,通过免疫印迹法、流式细胞术分别测定了Bcl-2、Fas蛋白表达的情况来观察PBMC凋亡相关蛋白的变化。结果:PG肿瘤上清没有抑制PBMC进入细胞周期,在PG上清的作用下,PBMC凋亡率显著增加,并且发现PG上清能够调节PBMC内凋亡相关蛋白Bcl-2、Fas的表达量。结论:PG上清能够调节PBMC凋亡相关蛋白量,进而诱导PBMC凋亡,这可能是导致肿瘤微环境中PBMC数量低下的主要原因。     

香菇多糖体外抗HIV的免疫调节作用的实验研究

目的：探讨香菇多糖在HIV感染中发挥的免疫调节作用，为HIV／AIDS治疗中的免疫重建探讨新的途径。方法：将香菇多糖与不同浓度的感染，未感染HIV的人PBMC经体外培养后通过ELISA法分别检测PBMC分泌IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TNF-α的情况。结果：PBMC在感染HIV前后与香菇多糖体外共培养60小时后，都可检测到IL-2、IL-12、IFN-γ分泌增加、IL-4、IL-10、TNF-α分泌减少，感染HIV组表现更为明显，并且表现出浓度依赖关系。结论：香菇多糖促进感染，未感染HIV的PBMC分泌Ⅰ类细胞因子，抑制分泌Ⅱ类细胞因子。香菇多糖抑制感染HIV-1的PBMC分泌TNF-α。     

IL-16在HIV复制中的作用

Baler等报告，以前鉴定的一种细胞因子─—淋巴细胞化学趋化因子（IL－16）可抑制外周血单个核细胞（PBMC）中HIV的复制。他们从刀豆蛋白A（ConA）刺激的非洲绿猴的PBMC中分离IL－16（IL－16AGM），并证明，重组灵长类IL－16与人IL－16有高度同源性，仅有7个氨基酸不同。这些重组分子呈剂量依赖方式抑制HIV在不含CDS＋细胞的PBMC中的复制。≥10ng／ml的IL－16AGM可抑制HIV复制，而≥1000ng／ml的人IL－16方有可检测到的抗病毒效应。他们认为IL－16可能与以前描述的由灵长类CD8＋细胞产生的免疫缺陷病毒抑制性淋巴因子…     

猪IL-10在软骨细胞中的表达

为了构建猪IL 10真核表达载体并在猪软骨细胞中表达。将目的基因酶切连入真核表达载体pcDNA3 1,以FuGENE 6介导转入猪软骨细胞中表达 ,RT PCR检测IL 10在软骨细胞中mRNA表达水平 ,ELISA检测细胞培养上清中IL 10蛋白含量。观察其对效应细胞PBMC分泌IFN γ和软骨细胞MHCII类分子表达的影响。结果显示 ,成功构建了猪IL 10真核表达载体 ,并转入软骨细胞 ,检测到细胞内IL 10mRNA转录 ,细胞培养 2 4、 4 8和 72h后 ,经ELISA检测上清中IL 10蛋白含量分别为 196 1 9、 2 92 5 9和 2 95 3 4pg/ml,能明显抑制经PHA刺激的PBMC分泌IFN γ (抑制率达 6 8 1% )和软骨细胞MHCII类分子的表达。猪IL 10真核表达载体的成功构建并在软骨细胞中表达 ,发挥其免疫调节功能 ,为研究IL 10诱导软骨细胞体内同种异体移植耐受奠定了基础。     

人骨髓瘤单核细胞系(M20)分泌白细胞介素1抑制因子

在体外培养骨髓瘤单核细胞系(M20)的上清液具有抑制白细胞介素1(IL1)的活性。从其上清液中分离出一种因子,该因子能抑制由IL1诱导的小鼠胸腺细胞对PHA反应的增殖,也能抑制依赖IL1的淋巴细胞和成纤维细胞的增殖,但不能抑制IL2诱导的或与IL1无关的其它细胞增殖反应。从正常人外周血单个核细胞(PBMC)     

在前单核细胞系IL-10通过诱导TNF-α及TNFR-1上调HIV-1的表达

白细胞介素10（IL－10）是调节免疫系统细胞因子家族的重要成员。在HIV感染者疾病进展过程中．机体对HIV的免疫反应，由第1型向第2型为主的转换起重要作用，而IL－10可能是导致这一转换过程的重要细胞因子。然而IL－10影响HIV－1复制的精确机制还不完全清楚。该文的目的在于研究潜伏HIV感染模型中，IL－10对HIV表达的上调作用是否由内源TNF－α与TNFR的诱导介导的。方法：已知在HIV潜伏感染的前单核细胞系UI中，IL-10能协调多种细胞因子，包括TNF－α增强HIV复制。该文选择UI细胞系作为研究对象，利用流式细胞仪检测TNF…     

抗重组人白细胞介素18单克隆抗体的制备与特性研究

目的 :获得有生物活性的小鼠抗重组人白细胞介素 18(rhIL 18)单克隆抗体。方法 :采用重组hIL 18免疫BALB C小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并经多次克隆化。结果 :建立了 2株小鼠抗hIL 18单克隆抗体杂交瘤细胞 1C7和 1F5 ,染色体数目分别为 92条和 90条 ,所分泌的抗体分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型 ,腹水IgG抗体经亲和层析法纯化后纯度达 95 %以上 ,效价为 1× 10 - 4和 1× 10 - 5,Westernblot显示 2株单抗均能特异性识别 18 3kD处的rhIL 18蛋白。 1C7单抗的亲和常数Ka=1 7× 10 5,1F5的亲和常数Ka=1 3× 10 5。 2株单抗识别不同抗原表位。结论 :制备的 2株单抗为进一步研究IL 18的分子结构、生物学功能及其与免疫相关性疾病的关系提供了实验材料。     

IL-18和HIV-1 gag-gp120嵌合基因DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答

目的 :探讨IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法 :构建含IL 18的真核表达质粒pVAXIL18,将他与表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌注免疫BALB/c小鼠 ,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果 :联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平均显著高于单独免疫组 (P <0 .0 5 ) ,空白质粒对照组 (P <0 .0 1)和PBS对照组 (P <0 .0 1)。结论 :IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫 ,且IL 18发挥了免疫佐剂的作用。     

卡介苗多糖核酸对过敏性支气管哮喘外周血单个核细胞TH1/TH2反应的作用

目的观察卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)对支气管哮喘患者外周血淋巴细胞TH1/TH2反应的作用,并与结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)进行比较. 方法缓解期过敏性支气管哮喘患者16例,对照组健康成人13例,分离外周血单个核细胞(PBMC),分别加入不同浓度的BCG-PSN(1、10、100、1000 μg/ml)、TB-PPD(10 μg/ml)、尘螨抗原(DerP, 10 μg/ml)体外培养4 d,不加刺激剂者为阴性对照.收集培养上清,ELISA检测IFN-γ、IL-5浓度的变化. 结果 PSN(1～100 μg/ml)刺激正常人PBMC分泌IFN-γ水平均高于哮喘患者(P＜0.05).BCG-PSN(10 μg/ml)可以刺激哮喘患者PBMC分泌IFN-γ(358.7 pg/ml,范围0～2433.0 pg/ml),但显著低于同等浓度的TB-PPD刺激作用(13 036 pg/ml,范围600.5～35 100.0 pg/ml,P＜0.01).PSN刺激PBMC分泌IFN-γ呈浓度依赖性,当浓度达到100 μg/ml时,与低浓度相比刺激作用显著增强(P＜0.01),与TB-PPD的刺激作用类似.DerP刺激哮喘患者PBMC分泌IL-5水平显著高于正常人(P＜0.05).BCG-PSN刺激PBMC分泌IL-5的作用较弱,显著低于TB-PPD和DerP的刺激作用. 结论 BCG-PSN具有一定的TH1刺激作用,但低于TB-PPD的刺激作用,有待对BCG-PSN组分进一步优化以增强疗效.     

体外培养系统中各细胞组分在IL-18诱导的肿瘤特异性CTL中的作用

应用rhIL 18在体外培养系统 (coculturesysteminvitro ,CCS )中诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxicTlympho cyte ,CTL ) ,探索不同细胞在IL 18起动和促进肿瘤特异性免疫应答方面的作用。采用StemSepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突细胞 (DC ) ,流式细胞仪分析细胞表型 ,12 5I UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性。结果表明 ,在肿瘤抗原存在的条件下 ,CCS中rhIL 18能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应 ;并且 ,在rhIL 18诱导肿瘤特异性CTL的过程中 ,rhIL 18、NK细胞、DC及T细胞均起着十分重要的作用 ,缺少任一组份 ,均对诱导肿瘤特异性CTL有明显差异 (P <0 0 1)。提示在CCS中 ,rhIL 18诱导的NK细胞快速杀伤效应及DC的抗原提呈作用 ,在肿瘤特异性CTL产生过程中 ,均起着决定性的作用。     

狼疮性肾炎患者外周血中IL-18的表达以及FK506、CsA和DEX的抑制作用

目的 :探讨IL 18在活动性狼疮性肾炎 (LN)患者中的表达以及免疫抑制剂FK5 0 6、环孢霉素A(CsA)和地塞米松 (DEX)对其表达的抑制作用。方法 :取 16例活动性LN患者和 10例正常人空腹静脉全血 ,分为未刺激组、脂多糖 /植物血凝素(LPS/PHA)刺激组、LPS/PHA FK5 0 6组、LPS/PHA CsA组和LPS/PHA DEX组在体外培养 2 4h ,采用ELISA法检测培养上清中IL 18的水平 ,应用半定量的RT PCR检测全血培养细胞中IL 18mRNA的表达 ,以及FK5 0 6、CsA和DEX对其表达的抑制作用。结果 :活动性LN患者全血培养的细胞自发及以LPS/PHA刺激后 ,IL 18mRNA和其蛋白的表达显著高于正常对照组 (P <0 .0 1) ;FK5 0 6、CsA和DEX对LPS/PHA刺激的LN患者全血培养细胞IL 18mRNA及其蛋白表达的抑制作用明显大于对正常对照组的抑制作用。结论 :IL 18在活动性LN患者LN的发病机制中可能起着重要的作用 ,抑制IL 18的产生有望成为活动性LN治疗的一个新途径     

慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA含量和IL-12对其PBMC产生Th1/Th2类细胞因子影响的相关性研究

目的：研究慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA含量对IL－12诱导其PBMC产生Th1/Th2类细胞因子协同效应的影响。方法：分离50例慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞，分别与PHA（100μg/ml）、HBcAg（1μg/ml）、HBeAg（1μg/ml）单独或联合IL－12（10ng/ml）体外培养48h，ELISA法检测培养上清液细胞因子IL－2、IFN－γ、IL－10。荧光定量PCR检测患者血清DNA含量，并分成HBVBDNA小于10^3拷贝／ml、1063-10^5拷贝／ml、1065-10^7拷贝／ml、大于10^7拷贝/ml4组。结果：以HBVDAN小于10^3拷贝／ml组做对照组，比较发现无论抗原（PHA、HBcAg、HBeAg）单独诱导还是联合IL－12共同诱导，随着血清HBVDNA含量的增高，PBMC产生IL－2和IFN-γ水平逐渐降低，产生IL－5和IL－10水平逐渐升高，并且IL－12对PBMC产生IFN－γ的增殖效应逐渐减弱，特别是血清HBVDNA大于10^7拷贝／ml患者几乎无明显增殖效应。结论：高水平血清HBVDNA含量对IL－12诱导慢性乙型肝炎PBMC产生IFN－γ协同效应有抑制作用。     

IL-18基因修饰增强肿瘤抗原多肽致敏的树突状细胞体内诱导的抗肿瘤免疫反应

目的 :研究肿瘤抗原多肽致敏的白细胞介素 18(IL 18)基因修饰的树突状细胞体内诱导的抗肿瘤免疫反应。方法 :①以Lewis 3LL肺癌细胞特异性抗原肽mut1冲击致敏IL 18基因修饰的骨髓来源的树突状细胞 (DC IL 18 mut1) ,每次用其 1× 10 5 只皮下免疫小鼠 2次 ,然后测定脾细胞的NK活性及CTL杀伤活性 ;②以DC IL 18 mut1每次 2× 10 5 只皮下免疫 1次 ,然后再以 5× 10 53LL细胞攻击 ,在诱导及效应阶段分别以单抗阻断不同免疫成份 ,观察肿瘤的生长。结果 :以DC IL 18 mut1皮下免疫后可诱导出比DC mut1等免疫组更高水平的 3LL肺癌细胞特异性CTL ,并使NK活性明显增加 ;单抗体内阻断实验提示在DC IL 18 mut1免疫诱导阶段 ,CD4 + T细胞和抗原共刺激分子、IFN γ均起到重要作用 ,而效应阶段CD8+ T、IFN γ、NK起作用 ,而CD4 + T则是非必需的。结论 :DC IL 18 mut1皮下免疫后可诱导高水平的抗肿瘤免疫活性 ,其机理与抗原有效提呈、特异性CTL诱导、NK活性增加以及CD4 + 、CD8+ T、NK细胞、IFN γ参与密切相关。     

人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨

目的：利用含重组质粒pBAD/HBs Fab的Top10大肠杆菌，优化表达人源抗－HBs Fab。方法：选取含pBAD/HBs Fab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养，将制备的二级种子液接种于摇瓶和KLF2000发酵罐中，摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间。发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度。诱导表达完毕后，纯化蛋白，比较表达量，并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性。结果：用摇瓶优化表达后，Fab蛋白占菌体总蛋白的6％，为0.8%mg/g菌体，利用发酵培养可进一步增加菌量，使蛋白表达量达80mg/L。所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性。结论：用重组质粒pBAD/HBsFab,Top10表达系统，可得到80mg/L的具有较好生物学活性的人源抗－HBs Fab蛋白，为批量生产作了准备。     

克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究

目的:通过比较肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)分泌因子及菌体成分对经过digitonin处理和未处理的肺上皮细胞株IL8分泌的影响,进一步了解克雷伯杆菌诱导肺上皮细胞炎症反应的信号转导机制。方法:实验分为两组,一组使用能使细胞膜通透性增加的温和去污剂digitonin处理,而另一组不处理。分别用Kp03183的细菌培养上清和超声处理的菌体成分刺激肺上皮细胞株A549,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞IL8表达水平。并用RT-PCR的方法检测肺上皮细胞胞内模式识别受体NOD1的表达。结果:Kp培养上清对未经digitonin处理的细胞IL8分泌无明显增强作用,与对照相比差异无显著意义(p>0.05),菌体成分能刺激IL8分泌增加(P<0.01),但增高不超过一倍。经digitonin处理使细胞膜通透性增加后,Kp培养上清及菌体成分刺激细胞IL8的作用都增强,菌体成分刺激IL8效果更为显著,为对照的3倍,而培养上清作用相对较弱。RT-PCR检测结果表明,肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1。结论:菌体成分是诱导炎症反应更有效的刺激物,肺炎克雷柏杆菌侵入肺上皮细胞可能是引发细胞炎症反应的始动环节。肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1,它是否参与肺上皮细胞识别肺炎克雷伯杆菌菌体成分,值得进一步的研究。     

重组人IL-18在大肠杆菌中的表达及其抗肿瘤作用

目的：获取rhIL-18原核表达产物并研究其活性。方法：用本室构建的含基因重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌DHSot，经42℃热诱导表达和包涵体提取纯化后获取rhIL-18蛋白；采用ELISA试剂盒检测rhIL-18刺激PBMC分泌IFN-γ的活性及MTT法检测其对NK细胞杀伤K562细胞自然杀伤活性；同时用荷瘤小鼠模型检测其体内抗瘤功能。结果：诱导含重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌D145ct后，蛋白电泳显示出一条相对分子量（Mτ）为18000的蛋白条带；10μg rhIL-18蛋白体外刺激PBMC后，其分泌IFN-γ的能力与对照组相比提高了8倍，细胞毒性提高3倍；同时rhIL-18蛋白能明显抑制肿瘤生长和延长荷瘤鼠生存期。结论：获得了有免疫调节功能和抗肿瘤活性的rhIL-18蛋白。为今后IL-18重组产物的研制和开展肿瘤的生物治疗提供了实验依据。     

体外诱导和检测人类B细胞产生抗HLA抗体的研究

目的 体外诱导和采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测人类B细胞产生的抗HLA抗体.方法 对7名健康志愿者采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)并体外培养5 d,以B细胞多克隆刺激原美洲商陆丝裂原(PWM)、葡萄球菌A蛋白菌体(SAC)体外刺激PBMC,采用EHSA和ELISPOT方法分别测定培养上清中Ig浓度和抗体分泌B细胞数,探索体外诱导PBMC产生Ig的适宜方法.采用该刺激方法和HLA特异的ELISPOT法,诱导和检测9例拟行肾移植预致敏对象PBMC产生的抗HLA抗体.结果 与PWM单刺激相比,PBMC在PWM和SAC联合刺激后,有更多细胞存活的趋势(P=0.052),且培养上清中IgM的水平明显增加(P=0.03),而IgG的水平无明显变化(P>0.05).6例预致敏对象诱导和检测到抗HLA抗体.其特异性与各自培养上清中检测到的抗HLA抗体一致.结论 PWM和SAC体外刺激PBMC,结合HLA特异的ELISPOT方法,能诱导和榆测到人类B细胞产生的HLA抗体.