X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良遗传学研究进展

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda SEDL，OMIM 313400)是一种罕见的遗传性骨软骨发育不良性疾病，遗传方式为X连锁隐性遗传。临床特点为轻中度非匀称性矮小和早发骨关节炎。SEDL的致病基因—SEDL基因定位于Xp22、2，cDNA全长2836bp，编码含140个氨基酸残基的蛋白质，其功能尚未完全明确。51．2％的SEDL基因突变发生在外显子4和外显子5，有多种类型的突变可导致SEDL的临床表型，其中缺失突变最常见，占56．1％。SEDL基因型与临床表型之间有一定的相关性，但也存在表型异质性。     

SEDL基因突变与X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良研究进展

SEDL基因于定位于X短臂（Xp22.2）,含有6个外显子,第3～6外显子为编码外显子,翻译起始密码位于外显子3,翻译产物为含有140个氨基酸的Sedlin。SEDL基因是一个高度保守的基因,参与在内质网至高尔基体间囊泡运输的定位和融合,与蛋白质转运有关。X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良（SEDT）是累及脊椎椎体和身体承重大关节的骨软骨发育障碍性疾病,呈X-连锁隐性遗传。临床特点为短躯干性侏儒和进行性的大关节退行性变,X线检查腰部椎体前部上下缘凹陷、中后部呈驼峰状突起。1999年首次发现SEDT的致病基因为SEDL,迄今为止已在SEDL基因上发现47种突变,其中缺失突变最为常见。本文简要综述了SEDL基因的结构与功能以及SEDT的分子遗传学研究进展,有助于SEDT的基因诊断与产前诊断。     

X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变分析

目的 鉴定中国西南地区一个4代迟发性脊椎骨骺发育不良大家系的分子遗传缺陷.方法 采用X染色体荧光标记微卫星标记物进行连锁分析,并通过直接序列分析筛查SEDL基因突变.结果 DXS987与DXS8051之间呈现连锁(最大LOD值:3.82;θ=0),致病基因定位于Xp22.2-Xp23.1;序列分析发现SEDL基因第4外显子发生点突变(c.239A＞G),导致在第80位编码氨基酸由组氨酸置换为精氨酸(H80R).结论 SEDL基因与此中国迟发性脊椎骨骺发育不良大家系表型完全连锁,并发现该基因新的致病突变(H80R).     

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变研究

目的：确定中国汉族中一个X－连锁迟发性脊椎骨骺发育不良（spondyloepiphyseal dyskplasia tarda,SEDL)大家系SEDL基因突变类型，探讨SEDL发病的分子基础。方法：用聚合酶链反应扩增产物双向直接测序方法检测了患者构成SEDL基因可读框的第3－6外显子及相邻侧翼区的DNA序列，将测序结果与GenBank公布的SEDL基因正常序列对比找出突变。然后在家系其他成员中证实该突变。结果：在2例患者（Ⅳ15、Ⅴ3）SEDL基因第2内含子剪接受体处发现了IVS2－2A→C突变，4个外显子的核苷酸序列未见改变。该突变在4例女性携带者得到证实，她们的基因型表现为野生型与突变型杂合现象。家系中2名未受累男性和15名无关健康个体未检测到这一突变。在该家系还检测出4个无症状的携带者。结论：首次发现SEDL基因IVS2－2A→C突变。该突变引起SEDL基因第2内含子3'端剪接受体改变，使之不能与外显子3正常剪接，可能是SEDL发病的分子基础。检测该突变可进行基因诊断，有重要的临床价值。     

X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良快速基因诊断方法的研究

目的探讨建立X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良（SEDT）快速基因诊断的方法。方法发现一个4代68人累及8例患者的SEDT大家系,呈X连锁隐性遗传。在应用PCR和DNA测序方法对SEDL进行基因突变分析后,提取外周血淋巴细胞RNA,应用RT-PCR扩增cDNA直接测序,建立快速基因诊断方法。结果RT-PCR结果显示,家系8例患者均为SEDL基因外显子6插入突变（c.370-371ins A,）,并发现1例无症状患儿携带相同突变（症状发生前）,6例女性携带者为杂合突变,家系其他成员和正常对照中均未见该插入突变。结沦RT-PCR检测扩增SEDL基因cDNA直接测序是一种快速基因诊断的方法。     

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系基因突变研究

目的 研究X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)患者的发病机理,并探讨该病的快速基因诊断方法.方法 应用逆转录聚合酶链反应,结合序列分析方法,对一个X-SEDL家系2例患者及育龄女性进行SEDL基因突变分析.结果 cDNA序列分析显示患者为G209A突变,并对突变所在第4外显子进行PCR扩增并测序进一步证实.患者女儿为该突变的携带者.结论 由于SEDL基因较小,直接对患者提取总RNA,逆转录后直接进行PCR扩增、测序,可直接发现基因阅读框内的多种类型的突变,相对于针对每一个外显子单独扩增检测更加直接、快速.     

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良SEDL基因剪接受体突变导致潜在剪接位点激活

目的 深入研究X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良（X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL）的发病机理，为最终防治本病提供依据。方法 应用逆转录-PCR及克隆测序方法对1例涉及SEDL基因第5内含子剪接受体缺失的SEDL患者进行mRNA表达研究。结果 该患者存在2个不同片段长度的mRNA表达产物，与GenBank正常序列进行BLAST比较后发现，393bp的表达产物是第6外显子内一个新的潜在剪接位点激活后形成的产物；433bp的表达产物与8号染色体的部分基因组序列完全一致。结论 SEDL基因第5内含子剪接受体位点及其后的第6外显子共13个碱基的缺失突变导致第6外显子内一个新的潜在剪接受体位点激活，使转录后的mRNA丢失了第6外显子内47bp的编码序列，并使紧接其后的2个密码子产生移码，导致翻译的提前终止（D109-S123del；S124fsX126）。另外，该突变可能激活了8号染色体上假基因SEDLP2的转录，从而部分地补偿了SEDL蛋白的功能。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良SEDL基因新突变

目的　研究X 连锁迟发性脊椎骨骺发育不良 (X linkedspondyloepiphysealdysplasiatarda ,SEDL)的发病机理。方法　应用聚合酶链反应 单链构象多态及变性聚丙烯酰胺测序凝胶电泳技术 ,并结合DNA序列分析方法 ,对 5例SEDL患者及 3 0名正常对照SEDL基因的全部编码外显子及其邻近序列进行突变分析。结果　在 1例SEDL患者中发现了致病突变 ,并经DNA序列分析证实 ,SEDL基因第 5内含子剪接受体处IVS5 2— 1delAG紧接第 6外显子 3 2 2— 3 3 2delTTTTCAATGAA共 13个碱基缺失。结论该突变系国内外尚未见报道的新突变 ,这一突变可引起SEDL。     

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变及基因诊断

目的 确定一个X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)家系的基因突变类型;建立一种快速基因诊断方法.方法 采用体格检查、影像学检查及家系分析进行临床诊断.针对SEDL基因的第3～6外显子及其侧翼序列设计4对引物,建立基于PCR的变性高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)快速基因分型方法.常规酚-氯仿法从该家系3代18名成员的外周血中提取基因组DNA,经PCR/DHPLC分析,筛查出SEDL基因突变所在的片段,对该片段进行序列分析以确定突变位点及类型.结果 DHPLC分析发现该家系的SEDL基因突变位点在第4外显子片段,序列分析证实为c.218C》T突变,导致氨基酸序列S73L改变.在该家系的18名成员中,3例男性患者,5例女性肯定携带者和2例未婚女性携带者均带有该突变,其余表型正常的8名成员中未检测到这一突变.各成员的DHPLC峰型所代表的基因型与表型结果相吻合.结论 首次报告中国人SEDL基因c.218C》T突变,丰富了中国人SEDL基因的突变谱.采用的技术快速、可靠,能对SEDL进行快速基因分型和产前诊断.     

一种DAX-1基因移码突变(428delG)引起的X-连锁先天性肾上腺发育不良

目的 研究1个X-连锁先天性肾上腺发育不良家系的临床特征,检测患者及其家属中是否存在相关DAx-1基因的突变.方法 收集1个临床诊断X-连锁先天性肾上腺发育不良的家系中2例患者及亲属的临床资料和外周血标本;提取基因组DNA,设计4对引物扩增DAX-1基因的2个外显子,PCR扩增DAX-1的全部外显子,扩增产物经纯化后进行直接测序.测序结果 在核苷酸序列数据库进行比较分析.结果 两例患者(表兄弟)DAX-1基因第1外显子处均存在428delG半合子移码突变.而患者的基因型与其临床表型并不一致.家系中有3例女性(他们的母亲及外祖母)为此突变的杂合子,正常人及家族中其他成员无该位点突变.结论 在1个中国人先天性肾上腺发育不良家系中发现DAX-1新的移码突变428delG.各种基因型与表现型之间并无相关性.     

X-连锁无汗性外胚层发育不良一家系EDA新发突变

目的检测一X连锁无汗性外胚层发育不良家系EDA基因突变。方法提取先证者、其姐和父母外周血基因组DNA,PCR扩增EDA基因编码区的8个外显子,PCR产物测序,明确突变位点。结果先证者EDA基因6号外显子第781位胞嘧啶C突变成胸腺嘌呤T,使其编码的蛋白第261位谷氨酰胺密码子CAA变成终止密码子UAA,蛋白表达提前终止;患者的姐姐和母亲在该位点均为C/T杂合子,患者父亲在该位点为C纯合子。结论本家系中c.781C>T突变为国内外首报,是导致X连锁无汗性外胚层发育不良临床表型的原因。     

利用全外显子测序技术发现BTK基因新生突变

目的利用全外显子测序技术,对疑似X-连锁无丙种球蛋白血症患儿及父母进行测序,发现致病基因突变并明确临床诊断,探讨基因型与临床表型之间的关系及分子诊断的意义。方法提取疑似X-连锁无丙种球蛋白血症患儿及其父母外周血,应用全外显子组捕获高通量测序筛查患儿及父母基因组DNA。通过生物信息学分析,结合dbSNP、千人基因组、ExAC、gnomAD数据库分析变异频率,确定突变位点,用Sanger测序法进行验证。结果通过全外显子测序,在患儿BTK基因中找到一个新发错义杂合突变c.1781GA(p.G594E),该位点位于已报道的热点位置,其父母此位点为正常基因型。结合临床表型和基因检测结果,该患儿被确诊为X-连锁无丙种球蛋白血症。结论本研究明确了X-连锁无丙种球蛋白血症临床表型和该BTK突变位点的相关性。通过全外显子测序技术成功鉴定了BTK基因的突变,强调了该技术在儿童先天性免疫缺陷病的明确诊断和遗传咨询中的实用性     

两个X连锁少汗性外胚层发育不良家系的基因突变分析

目的 对两个X连锁隐性遗传少汗性外胚层发育不良(X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia,XLHED)家系进行ED1基因突变分析,为罹患家庭提供遗传咨询及产前诊断.方法 综合应用序列分析及多重连接依赖性探针扩增方法,对两个家系的先证者进行ED1基因突变分析,并针对检测到的突变位点对女性成员进行检测.采集家系1胎儿的羊水细胞进行产前诊断,包括致病突变位点的分析、ED1基因内4个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点的单倍型连锁分析、性别鉴定及核型分析.结果 家系1先证者缺失ED1基因第1外显子及下游2个STR位点DXS8269,DXS1422区域,其余外显子序列分析未见异常,其女儿为该缺失突变的携带者;结合连锁分析、性别鉴定及核型分析结果,家系1胎儿为男性非ED1基因缺失突变携带者,胎儿足月分娩后随访,为健康个体.家系2先证者经序列分析检测到ED1基因第3外显子c.463C＞T(R155C)错义突变,母亲为c.463C＞T(R155C)杂合突变携带者.结论 ED1基因第1外显子区域缺失和错义突变R155C是导致2个少汗性外胚层发育不全家系患者临床表型的主要原因,ED1基因的突变检测结合单倍型分析,能准确地对该类家系提供产前诊断.     

X连锁重症联合免疫缺陷病一家系遗传学分析

目的 X连锁重症联合免疫缺陷病是一种在临床上较为罕见的隐性遗传病,为了探究该病的遗传机制,以期降低家系中该患儿的出生风险,需要对患者家系相关成员进行全外显子测序以及遗传学分析。方法 经家属知情同意,采用全外显子组高通量测序检测技术对先证者进行基因检测,调查家族遗传图谱,进行遗传学分析。结果 家系图谱中由先证者曾祖母遗传下来的X连锁重症联合免疫缺陷病,患者均为男性,并且均在婴幼儿时期死亡,而大多数女性为携带者。该家系中一共有5人进行全外显子测序,检测到先证者IL2RG基因上发生c.854G>A半合子突变,先证者母亲和表姨发生杂合突变,父亲和表弟未突变,经家系分析和测序结果证实该位点变异遗传于母系。结论 X连锁重症联合免疫缺陷病在遗传上具有规律性,当临床上出现典型的症状以及指标时,应当进行基因检测及家系调查,尤其是女性携带者的检出,是预防本病的枢纽。     

对MITF基因突变导致Waardenburg TypeⅡ综合征患者临床表型和遗传学分析

目的探讨1例虹膜色素沉着异常,感音神经性耳聋,皮肤白斑患者的遗传学病因。方法应用单核苷酸多态性芯片(single nucleotide polymorphism array,SNP array)检测患者染色体微小异常。用全外显子测序(whole exome sequencing,WES)分析及Sanger测序验证,对患者进行遗传学分析。结果 SNP array检测结果正常。全外显子测序结果及OMIM数据库分析结合患者临床表型得出MITF基因c.775CT突变,259位置氨基酸由精氨酸突变为终止密码子。Sanger测序结果全外显子检测一致,显示患者MITF基因c.775CT(p.Arg259)杂合突变。结论本例患者异常表型是由于MITF基因c.775CT(p.Arg259)杂合突变导致的,并表现为Waardenburg syndrome Ⅱ型,对其家系有遗传指导意义。     

中国皖南地区家族性肥厚型心肌病MYH7基因筛查结果及临床特征

目的研究皖南地区汉族人群家族性肥厚型心肌病（HCM）的致病基因β肌球蛋白重链（MYH7）突变,并分析基因型与表型的关系。方法对4个HCM家系先证者的MYH7基因,经PCR扩增其外显子片段,用双脱氧末端终止法测序做突变初筛,对阳性结果患者进行家系调查,分析其临床表型。结果在MYH7基因18外显子中发现其中一家系中患者发现Arg663His突变,另一家系患者发现nt2013c缺失、nt2025C插入,此为一国内罕见移码突变。结论MYH7基因可能是皖南地区HCM较常见致病相关基因之一,其某些突变可在同一家系内遗传并致病,所致HCM临床症状较轻,症状出现较晚、进展较慢。同一突变携带者的临床表型存在异质性提示多因素参与了HCM的发生和发展。     

晶体蛋白βA1 基因缺失突变导致常染色体显性遗传核性先天性白内障

目的 对一个中国人的常染色体显性遗传核性先天性白内障家系的致病基因进行定位克隆研究。方法 选取候选基因附近的短串联重复序列多态性标记进行连锁分析，对提示连锁的染色体区域内的候选基因测序，寻找突变。结果 该家系致病基因定位在17q11．1-12约11．78cM的范围内，并在候选基因晶体蛋白βA1基因(CRYBA1)的外显子4发现一个密码子缺失(△G91)与家系患者共分离，在正常人群中没有检测到。结论 该家系的核性先天性白内障系由CRYBA基因外显子4的缺失突变△G91引起．这是首次报道由CRYBA1基因突变导致先天性核性自内障表型的发生。     

小头畸形-骨发育不良-原基性侏儒症Ⅱ型家系的临床及遗传学分析

目的 小头畸形-骨发育不良-原基性侏儒症Ⅱ型（MOPDⅡ）罕见病家系的中心粒周蛋白基因（PCNT）新发变异的鉴定,以及流产胚胎的PCNT基因突变筛查。方法 对两名MOPDⅡ疑似患儿及其父母进行全外显子测序（WES）的家系分析,并通过一代测序和实时荧光相对定量PCR验证。同时,对流产组织进行全外显子测序分析以筛查PCNT基因的突变情况。结果 通过全外显子测序发现先证者及其弟弟的PCNT基因外显子34存在c.7469＿7472del杂合突变,以及17～21号外显子杂合缺失。经过父母的验证,c.7469＿7472del缺失遗传自父亲,17～21号外显子缺失遗传自母亲。对30例流产组织进行筛查,发现有4例突变,其中有3例为杂合突变且均为新的突变位点,1例为复合杂合突变。结论 在先证者及家系中发现了一个新的插入缺失突变（InDel）变异和一个新的拷贝数变异（CNV）,复合杂合突变是导致MOPDⅡ发生的主要原因。对流产组织的检测,进一步揭示了PCNT基因突变在流产患儿中的携带率。     

一个异染性脑白质营养不良家系ARSA基因突变分析

目的分析并确定一个异染性脑白质营养不良（metachromatic leukodystrophy，MLD）家系芳基硫酸酯酶A（arylsulftase A，ARSA）的基因（ARSA）突变及遗传特征。方法收集先证者及其家系成员临床资料，采用聚合酶链反应和DNA直接测序方法进行ARSA突变检测，确定基因突变的位点，分析基因型与表型的关系。结果该家系先证者的ARSA基因同时存在第2外显子G251A（R84Q）与G296T（G99V）两个杂合突变，具有相似表型的胞弟与先证者的测序结果完全一致，先证者之父母分别携带ARSA基因第2外显子G251A（R84Q）与G296T（G99V）的杂合突变，表型正常的先证者之姐未发现这些突变。结论该家系中两位患儿均为ARSA基因复合杂合突变致病，其G251A（R84Q）突变来自父亲，G296T（G99V）突变来自母亲，其父母均为表型正常的基因突变携带者。