稳定低表达DNA甲基转移酶3b基因对膀胱癌细胞生长和凋亡的影响

目的探讨稳定低表达DNA 甲基转移酶3b（DNMT3b）基因对人膀胱癌细胞生长和凋亡的影响。方法包装表达
DNMT3b siRNA和阴性对照siRNA的慢病毒,通过慢病毒感染的方法获得稳定低表达DNMT3b的膀胱癌细胞BIU-87及对照
细胞。MTT和流式细胞仪检测DNMT3b稳定低表达对细胞增殖和凋亡的影响;体内裸鼠成瘤实验观察DNMT3b稳定低表达
对肿瘤的抑制效果;荧光定量PCR和Western blot检测DNMT3b稳定低表达对细胞生长和凋亡相关基因表达的影响;甲基化特
异性PCR检测对细胞生长和凋亡相关基因甲基化的影响。结果荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,DNMT3b mRNA
和蛋白水平在BIU-87稳定细胞株中稳定低表达;DNMT3b稳定低表达可以抑制BIU-87细胞的生长,并且抑制裸鼠皮下瘤体的
生长;DNMT3b稳定低表达可以促进BIU-87细胞的凋亡;DNMT3b稳定低表达可以增加凋亡及细胞生长相关基因DAPK,Bax
和RASSF1A mRNA和蛋白水平的表达;DNMT3b稳定低表达可以减少凋亡及细胞生长相关基因DAPK,Bax和RASSF1A启
动子区域的甲基化水平。结论DNMT3b稳定低表达可能通过调控凋亡相关基因以及细胞生长相关基因启动子区域的甲基化
水平来影响基因的表达,从而抑制BIU-87细胞的生长,诱导细胞凋亡。
     

FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人FoxM1 shRNA重组慢病毒载体,并构建筛选FoxM1敲低的人前列腺癌稳定细胞
株,检测FoxM1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人FoxM1基因的shRNA靶序列,构建到
pHBLV-U6-ZsGreen-Puro 慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观
察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞FoxM1 mRNA水平,经嘌呤霉素
筛选建立FoxM1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中FoxM1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,
流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对FoxM1
shRNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素
抗性筛选建立了FoxM1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中FoxM1蛋白表达明
显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示FoxM1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表
明FoxM1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了FoxM1 shRNA慢病毒载体,建立了FoxM1敲低稳定前列腺
癌细胞株,抑制细胞内FoxM1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。
     

基因芯片技术筛选和鉴定CD133+CD200+大肠癌干细胞相关基因

目的筛选CD133+CD200+大肠癌细胞并鉴定其相关基因的表达。方法流式细胞术分选CD133+CD200+和CD133-CD200-
大肠癌细胞,应用Affymetrix 人类全基因组表达谱芯片检测这两群细胞的基因表达谱,初步筛选CD133 +CD200 +与
CD133-CD200-大肠癌细胞之间的差异表达基因,进而寻找与大肠癌干细胞特异性相关的主效基因,最后利用qRT-PCR实验对
部分差异表达基因进行验证,以确定芯片检测结果的可靠性。结果芯片结果显示差异在3倍以上的基因共655个,CD200+细胞
表达上调的基因290 个,表达下调的基因共365 个,通过生物信息学分析和GENEMANIA共表达构建,筛选出3 条（MDM2;
PRKACG;CACNA1G）有特异相关的差异基因进行qRT-PCR验证,结果与芯片结果完全相符。结论基因芯片技术通过筛选和
鉴定CD133+CD200+大肠癌干细胞相关基因,建立了特异性大肠癌干细胞基因表达谱,为大肠癌基因靶向治疗及进一步研究提
供依据。
     

稳定表达MACC1的胃癌BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞株的建立及其肿瘤相关基因的研究基因

摘要：目的构建含有全长肠癌转移相关基因( MACC1) 的表达载体,建立稳定表达MACC1 的胃癌BGC-823/
pBaBb-puro-MACC1细胞系,通过基因芯片技术筛选出转染MACC1后胃癌细胞株的差异表达基因,探讨MACC1基因与差异
基因之间可能的调节机制或信号通路。方法以人胚肾293FT细胞为模板,经PCR扩增获全长MACC1 cDNA序列,将目的基
因序列克隆入带有绿色荧光蛋白报告基因的pBaBb-puro表达载体,建立pBaBb-puro-MACC1表达载体。经限制性内切酶酶切
鉴定、测序并转染293FT细胞观察报告基因表达情况判断是否构建成功。构建成功后的pBaBb-puro-MACC1表达载体转染人
胃癌BGC-823细胞,建立稳定表达MACC1的BGC-823/pBaBb-puro-MACC1细胞。qRT-PCR及western blot检测转染细胞的
MACC1基因表达,应用基因芯片技术筛选出转染MACC1基因后胃癌细胞株的差异表达基因并对其探讨研究。结果成功扩
增全长MACC1cDNA,经测序鉴定序列完全正确;转染293FT细胞可见清晰的绿色荧光表达。BGC-823/pBaBb-puro-MACC1
细胞能够稳定表达MACC1。基因芯片筛选出差异基因发现上调基因33个,下调基因24个,这些差异表达基因的功能涉及多个
方面。结论成功构建了含有全长MACC1cDNA的表达载体系统,建立了稳定表达MACC1的BGC-823/pBaBb-puro-MACC1
细胞,通过对差异基因的分析发现MACC1 可能引起胃癌细胞株BGC-823 基因表达谱中一些非常重要的分子的改变,为
MACC1基因进一步研究奠定了良好基础。
     

人Bcl-6 3’UTR区报告质粒及其表达载体的构建和功能检测

目的通过构建bcl-6 基因野生型、突变体3’UTR区及其编码序列（CDS）,观察miR-127 对bcl-6 的直接靶向调控作用及
bcl-6表达载体回复miR-127抑制细胞周期和细胞生长的功能。方法利用PCR方法扩增bcl-6基因3’UTR区序列及其CDS,分
别构建在pcDNA3.0-Luc和pcDNA3.0-Flag载体上,在bcl-6基因3’UTR质粒基础上应用重组PCR方法构建miR-127结合位点
突变的突变体报告基因质粒,应用荧光素酶报告基因系统检测miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用,在肝癌细胞HepG2中检
测过表达及敲低miR-127引起bcl-6基因表达抑制后细胞周期和细胞生长的改变,同时应用表达载体回复bcl-6蛋白水平,检测
bcl-6在miR-127调控细胞周期和细胞生长中的必要性。结果构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确,bcl-6 3’UTR
野生型和突变体报告质粒与miR-127共转293T细胞和HepG2细胞后荧光素酶报告基因检测显示miR-127明显降低野生型报
告质粒的活性,但对突变体活性没有影响,miR-127可引起HepG2细胞G2/M期阻滞并抑制细胞生长,bcl-6可以逆转miR-127
对细胞周期和细胞生长的影响。结论成功构建bcl-6基因3’UTR区野生型、突变体报告质粒和bcl-6基因的表达载体,荧光素酶
报告基因和回复实验证实均具有生物学功能。
     

慢病毒干扰小鼠附睾特异的meClps基因可降低精子的运动能力

目的筛选能有效干扰小鼠附睾特异的类辅脂酶meClps基因表达的RNA靶点,并通过慢病毒介导的RNAi敲低meClps
表达后分析对精子运动的影响。方法构建真核表达载体pDsRed2.0-C1-meClps中并转染NIH-3T3细胞,用meClps抗血清检
测meClps蛋白的表达。针对meClps基因的序列设计并合成3对靶向干扰meClps表达的寡核苷酸序列,构建重组慢病毒载体
pRNAT-U6.2/lenti-RNAi-251、224和286。将重组慢病毒干扰质粒分别与pDsRed2.0-C1-meClps共转染到NIH-3T3细胞,半定
量PCR和Western blotting检测meClps基因在mRNA和蛋白水平的变化。将筛选得到的干扰效果最好的慢病毒载体包装慢病
毒,注射到小鼠附睾头部组织后分析对附睾尾部精子运动性能的影响。结果构建了体外表达meClps 蛋白的
pDsRed2.0-C1-meClps 表达载体和靶向meClps 基因的慢病毒RNAi 载体。靶向meClps 的RNA 干扰载体对转染
pDsRed2.0-C1-meClps后的NIH-3T3 细胞中的meClps 的mRNA和蛋白表达都有抑制,但以转染pRNAT-U6.2/lenti-RNAi-251
对meClps的抑制效果最明显。包装后的慢病毒注射到小鼠附睾头部后附睾尾部组织中的精子运动速率降低（P<0.05）。结论
筛选出RNAi-251能有效干扰meClps表达,通过慢病毒介导的RNAi敲低meClps表达后精子运动性能降低。
     

奥美拉唑对人脐静脉内皮细胞全基因表达谱的影响及机制分析

摘要：目的研究奥美拉唑对体外培养人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）基因表达谱的影响,探讨奥美拉唑对内皮细胞作用的分子
机制。方法10-5 mol/L奥美拉唑与人脐静脉内皮细胞株共培养48 h,运用Affymetrix U133 plus 2.0全基因组表达芯片,检测奥
美拉唑对人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,分子注释系统MAS3.0 软件进行聚类分析。RT-PCR验证基因表达谱结果,
Western blotting验证相关蛋白水平的变化。结果奥美拉唑作用内皮细胞48 h后,基因芯片分析筛选出差异表达大于1.5倍的
基因282个,其中上调基因236个,下调基因46个,包括转录调节、炎症反应、免疫反应、细胞粘附、抗凋亡、信号转导等相关基因,
RT-PCR和Western blotting结果与基因芯片结果一致。结论奥美拉唑在基因水平通过多条通路调节内皮功能。
     

敲低MSX2对胰腺癌PANC-1细胞上皮-间充质转化的影响

目的研究MSX2 基因在胰腺癌PANC-1 细胞的上皮-间充质转化（EMT）/间充质-上皮转化（MET）转变中的作用。方法
通过脂质体2000将含有MSX2干扰序列的质粒（共3种,分别命名为shMSX2-1、shMSX2-2和shMSX2-3,转染空质粒的阴性对
照组NC）转染PANC-1细胞,利用Real-time RT-PCR、Western blot等技术检测MSX2在基因和蛋白水平的表达,检测干扰效率,
并选取干扰效率最高的一组用于后续试验;进而检测EMT相关上皮标志分子E-cadherin、间质标志分子Vimentin在基因和蛋白
水平的表达变化;采用CCK-8法检测干扰前后细胞的增殖能力变化,Transwell和划痕试验比较细胞的侵袭转移能力变化。结
果3组干扰质粒中shMSX2-1的干扰效率最高,CCK-8试验结果显示敲低MSX2可明显抑制PANC-1细胞增殖能力,与对照组
相比差异有显著性（P<0.05）;敲低MSX2 可明显抑制PANC-1 细胞的侵袭转移,差异有统计学意义（P<0.05）;EMT相关分子
E-cadherin表达升高,而Vimentin表达降低,且与对照组相比均有统计学意义（P<0.05）;倒置显微镜下观察敲低MSX2后细胞形
态由松散的长梭形变成紧密连接的椭圆形。RT-PCR 发现敲低MSX2 后转录因子twist 和snail 表达降低（P<0.05）,而slug 和
zeb1 表达变化无差异（P>0.05）。结论敲低MSX2 可抑制胰腺癌PANC1 细胞的增殖、侵袭转移能力,并且上皮标志分子
E-cadherin表达升高,间质标志分子Vimentin表达降低,有发生MET的趋势,MSX2可能通过twist、snail发挥其抑制作用
     

TGF-β1诱导的肿瘤细胞CSRNP1/AXUD1 基因的表达及转录调节机制

目的探讨TGF-β1诱导的肿瘤细胞中CSRNP1/AXUD1基因的表达及其调控机制。方法分别用不同浓度的TGF-β1或
相同浓度下不同处理时间处理指数生长期的人肺腺癌细胞A549和人前列腺癌细胞PC-3,荧光定量RT-PCR检测TGF-β1对两
种肿瘤细胞中半胱氨酸-丝氨酸蛋白（cystein-serine-rich nuclear protein, CSRNP1）基因表达的剂量和时间依赖性效应;培养的
A549细胞血清饥饿后,分别在有无TGF-β1（20 ng/ml）和环己亚胺（30 μg/ml）作用下处理24 h,检测TGF-β1诱导的CSRNP1基
因的表达是否需要新蛋白的合成;最后,分别将SMAD3表达质粒flag-SMAD3和显性失活突变体表达质粒（flag-SMAD3-mu
转染A549细胞中,并以空质粒pcDNA3.1作为对照。血清饥饿后,进行有无TGF-β1（20 ng/ml）处理24 h,Western blot 确定外
源性SMAD3的过表达,荧光定量RT-PCR检测SMAD3的过表达对TGF-β1诱导的CSRNP1基因表达的影响。结果TGF-β1以
浓度和时间依赖的方式诱导肿瘤细胞中CSRNP1 基因的表达,并需要新的蛋白合成。SMAD3 的过表达增加TGF-β1 诱导的
CSRNP1的表达,而显性失活的SMAD3突变体（SMAD3-mu）的过表达则显著降低TGF-β1诱导的CSRNP1的表达。结论肿瘤
细胞中TGF-β1可能通过激活SMAD3 及其下游信号通路而诱导CSRNP1基因的表达。
     

凋亡抑制因子5的表达在乳腺癌预后中的意义

目的:分析凋亡抑制因子5(BIRC5)基因表达水平与乳腺癌患者预后之间的关系。方法:首先通过癌症基因组图谱(TCGA)公共数据库研究BIRC5在乳腺癌患者中的表达,并在乳腺癌细胞系中进行验证。其次在乳腺癌基因表达数据库bc-GenExMiner v4. 0中,利用COX风险回归模型对BIRC5与乳腺癌患者预后进行分析。最后在乳腺癌细胞系中通过RNA干扰技术敲低BIRC5基因后观察其对乳腺癌细胞增殖及迁移的影响。结果:通过对TCGA数据库的分析发现,BIRC5基因的表达在多种乳腺癌中呈现上升趋势,且BIRC5基因的表达与乳腺癌患者预后密切相关,敲低BIRC5后,乳腺癌细胞生长明显受到抑制。结论:BIRC5基因表达水平对乳腺癌患者的预后具有显著意义。     

硼替佐米耐药多发性骨髓瘤细胞株KM3/BTZ的建立

目的   建立人多发性骨髓瘤耐硼替佐米的细胞株,并对其生物学特性及耐药机制进行初步探讨。方法   采用浓度梯度递增法,以人多发性骨髓瘤KM3细胞株为亲本,建立耐硼替佐米的多发性骨髓瘤细胞株,绘制生长曲线,并计算倍增时间;MTT法鉴定耐药细胞株的耐药性;RT-PCR方法检测MDR-1在亲代和耐药细胞株中的表达情况。结果   成功建立耐硼替佐米的多发性骨髓瘤细胞株KM3/BTZ,耐药倍数为19.7倍。与亲代细胞相比,耐药细胞株倍增时间延长（P＜0.05）。多药耐药相关基因MDR-1未参与耐药性的发生。结论   成功建立人多发性骨髓瘤耐药细胞株KM3/BTZ,耐药性稳定,为研究耐药机制及逆转耐药提供了理想的模型。     

甲基化修饰致PCDH10基因在多发性骨髓瘤中沉默

目的研究PCDH10基因在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者及细胞系KM3、RPMI-8226中的甲基化状态,分析甲基化对其沉默的影响。方法常规骨髓穿刺术获取MM患者骨髓样本,培养骨髓瘤细胞系KM3、RPMI-8226,以增生性骨髓象骨髓样本作为对照。RT-PCR检测其中PCDH10基因表达水平,甲基化特异性PCR(methylation-sensitive PCR,MSP)法检测PCDH10基因甲基化状态,通过5-氮杂-2’-脱氧胞苷和组蛋白去乙酰化酶抑制剂[5-aza-2’-deoxycytidine(Aza)and trichostatin A(TSA),A+T]处理MM细胞系,检测药物处理前后PCDH10甲基化状态及表达水平。结果 PCDH10基因在正常人群中表达,但在MM患者骨髓及细胞系中广泛低表达,且77.27%(34/44)的MM患者PCDH10呈甲基化状态。PCDH10基因可经A+T试验逆转甲基化状态并恢复表达。结论 DNA甲基化可能在多发性骨髓瘤的PCDH10基因沉默中发挥作用,从而参与骨髓瘤的发生。     

Human cytomegalovirus protects multiple myeloma cell line KM3 cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal

Background There is a higher rate of cytomegalovirus (CMV) reactivation in patients with multiple myeloma after an autologous stem cell transplantation, but no attention has been given thus far to a possible pathogenetic interplay between CMV and multiple myeloma. CMV can infect many kinds of cells, and CMV infection has been shown to inhibit apoptotic responses in several cell systems. In this study the authors investigated the alterations in apoptosis in the multiple myeloma cell line KM3 after infection with CMV and DroDosed a Possible mechanism.Methods KM3 cells were infected with 100, 10, or 1 TCID50 of CMV and then cultured in serum-free RPMI 1640. An RT-PCR-based assay was used to detect mRNA expression of CMV-IE,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), and IL-6 in CMV-infected and mock-infected cells. Flow cytometry was used to detect apoptotic cells. CMV particles and apoptotic cells were also examined with an electron microscope.Results CMV-infected KM3 cells clearly expressed immediate early (IE) antigen mRNA when compared to uninfected cells, and there were fewer apoptotic cells among cells treated with 100 or 10 TCID50 of CMV after culturing in serum-free RPMI 1640. CMV particles were observable in infected cells under an electron microscope. Expression of IL-6 mRNA increased after infection.Conclusion CMV can infect the multiple myeloma cell line KM3, inhibit the apoptotic response in these cells after apoptosis induction in serum-free culture, and increase the expression of IL-6 mRNA.     

Discovery of chrysoeriol,a PI3K-AKT-mTOR pathway inhibitor with potent antitumor activity against human multiple myeloma cells <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

This study was designed to determine the impact of chrysoeriol on proliferation and cell cycle progression in the human multiple myeloma cell lines RPMI 8226 and KM3,and its related molecular mechanisms.Chryseoriol was identified by using the phosphorylated AKT-specific cytoblot high throughput assay.CCK-8 assay was employed to examine the growth inhibition rate and IC 50 (48 h) in peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs),RPMI 8226 and KM3 cells treated with chrysoeriol at various concentrations.Cells were labeled with 5-6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE),and the proliferation dynamics was detected by flow cytometry and analyzed with ModFit software.The cell cycles of RPMI 8226 and KM3 cells were measured by flow cytometry when the IC 50 concentration of chrysoeriol was adopted.The alterations in cell-cycle related proteins (Cyclin B1,Cyclin D1,p21) and proteins in PI3K-AKT-mTOR pathway were determined by Western blot analysis.The results showed the proliferation of multiple myeloma cells was significantly inhibited by chrysoeriol,resulting in cell cycle arrest in G 2 /M phase.Chrysoeriol could significantly reduce the expression of p-AKT (s473) and p-4eBP1 (t37/46) protein,meanwhile enhanced Cyclin B1 and p21 protein expression.Similar effects were not observed in PBMNCs from normal donors.It was concluded that chrysoeriol was a selective PI3K-AKT-mTOR pathway inhibitor.It restrained the proliferation of human multiple myeloma cells,but didn’t affect proliferation of PBMNCs from normal donors.It might exhibit the cell cycle regulatory effect via the inhibition of PI3K-AKT-mTOR signal pathway.     

筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4B慢病毒L02稳定株差异表达基因和基因通路

目的：筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢
病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用
及机制提供依据。方法：将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2- mkate2复苏
扩增;应用Human Gene 1.0ST 芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因。基于京都基因和基因组百科全书(kyoto
encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行
显著性分析。应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶C 结合蛋白(protein kinase C delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤
蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt 鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物1 (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列 (baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平。结果：以LO2-NS4B与LO2-mkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上
调和1 236个基因表达下调。上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用
通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通
路、Wnt信号通路和细胞周期通路等。Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一
致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60%。结论：HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和
细胞增殖等有关的多种基因表达,主要影响与细胞凋亡、细胞周期和癌症相关的信号转导通路。     

雄黄对多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞基因表达谱的作用

目的：应用cDNA芯片研究雄黄作用多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞后对其基因表达的影响。方法：应用包含4096条人类基因的cDNA表达谱芯片,检测雄黄作用于RPMI8226细胞前及48h后基因的表达。结果：在mRNA水平上,164条基因显著改变,53条基因上调,111条基因下调。结论：雄黄作用RPMI8226细胞株后可引起一系列基因改变,许多基因涉及了多发性骨髓瘤的发病机制,其中BTG1,TXNIP及ALK1基因可能与RPMI8226细胞的分化和凋亡有密切关系。     

RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活

目的利用慢病毒干涉下调内源性RNF31 表达,研究NF-κB通路的活化及对细胞凋亡的影响。方法将人RNF31 的
shRNA片段克隆到慢病毒表达载体pGreenPuro中,瞬时转染HEK293T细胞,筛选出有效的干涉片段。将重组表达质粒与包装
质粒PMD、SPA共转染293T 细胞,在24 h、48 h 分2 次收集慢病毒上清,用流式细胞术检测病毒滴度。将获得的病毒感染
HEK293细胞,提取细胞蛋白,Real-time PCR以及Western Blot 检测RNF31干涉效果;报告基因实验检测敲低RNF31对NF-κB
转录活性的影响;Real-time PCR检测干涉RNF31对TNF-α诱导的NF-κB下游靶基因的影响;Western Blot 检测下调RNF31对
IκBα活化的影响;Hochest染色检测下调RNF31对细胞凋亡的影响。结果成功构建RNF31干涉慢病毒pGreenPuro-RNF31载
体并获得慢病毒颗粒,病毒滴度可达3×107 pfu/ml。在HEK293细胞中下调RNF31,抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性,并抑
制NF-κB下游靶基因的表达;下调RNF31抑制TNF-α刺激的IκBα的活化;此外,在TNF-α刺激细胞24 h时,RNF31表达下调使
细胞凋亡增多。结论RNF31表达下调抑制TNF-α刺激的NF-κB通路的激活。