PCR方法快速检测一些常见医学真菌

目的 为选择一种快速、敏感和特异的方法来检测临床感染的真菌。方法 选取真菌１８ＳｒＤＮＡ序列中两个片段设计引物,对１２种菌株进行ＰＣＲ扩增,均扩增出长约３１０ｂｐ产物。对一些临床常见细菌扩增均无反应。对酶母相真菌白念珠菌、新生隐球菌进行敏感性实验检测。结果 发现二者ＰＣＲ最小检出量均为菌体数达每个反应体系１０＾３。本实验过程总耗时３６ｈ以内。结论 本实验方法可快速特异性检测一些常见医学真菌。     

基因释放剂在快速制备医学真菌DNA中的应用

目的 评价基因释放剂在快速制备医学真菌ＤＮＡ中的作用和应用条件。方法 样品加入基因释放剂后分别用程序加热法、微波处理法和煮沸法处理，然后用１８ｓｒＤＮＡ通用引物进行ＰＣＲ扩增。优化ＰＣＲ扩增体系和条件。结果 ３种方法均能达到实验要求，其中以微波处理法中的５档火力７ｍｉｎ条件效果最好，各菌株均可被扩同一条４８２ｂｐ的ＤＮＡ带。敏感性为１０＾１个孢子／ｍｌ。结论 使用基因释放剂可简便快速从小量致病真菌     

应用PCR技术快速诊断马尔尼菲青霉

采用特异性引物和聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，检测６株临床分离的马尔尼菲青霉、２株竹鼠体内分主了的马尔尼菲青霉，及其它致病真菌、细菌、人白细胞系ＤＮＡ。结果（１）８株马尔尼菲青霉的２５℃菌丝相、３７℃酵母相ＤＮＡ均可扩增３４７ｂｐ的特性片段，而其它致病真菌、细菌、人白细胞ＤＮＡ无特性片段扩增。（２）５株马尔尼菲青霉２５℃连续传１０代，其中一株发生变异，５０株马尔尼青霉均可扩增出特性片段。（３）敏感性     

应用聚合酶链反应检测某些机会致病真菌的初步探讨

目的 探讨快速检测某些机会致病性直菌的方法。方法 以源于医学机会致病性真菌１８ｓｒＲＮＡ保守区的一对寡核苷酸序列为引物,利用聚合酶链反应对医学上重要机会致病性真菌ＤＮＡ进行扩增。结果 ３属７种２９株重要机会致病性直菌,经扩增均出现一条１９７ｂｐ的ＤＮＡ片段,而对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、人白细胞则不扩增。以溴化乙啶染色,该ＰＣＲ方法对白念珠菌ＤＮＡ的最低检出限为１ｐｇ。３０份临床标     

聚合酶链反应检测生殖支原体的研究

具有致病性的生殖支原体（Ｍｇ）生长缓慢，不易培养，而血清学诊断与肺炎支原体又有交叉反应，这给Ｍｇ的临床诊断带来困难。为了进一步解决Ｍｇ的临床检测问题，本研究采用Ｍｇ粘附因子基因序列合成一对引物ＭｇＰａ１和ＭｇＰａ３，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测Ｍｇ。结果表明，对Ｍｇ能产生特异性扩增，片段大小为２８１ｂｐ，而对肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、沙眼衣原体及淋球菌等则不能扩增出任何片段。作者认为，ＰＣＲ为一种高度特异和敏感性的方法，它为Ｍｇ的临床检测提供了重要的手段。我们还对引物浓度、退火温度及模板量对ＰＣＲ扩增结果的影响进行了初步探讨。     

真菌特异性通用引物的聚合酶链反应系统的实验与临床研究

目的　为了判断临床和实验室标本中是否存在病原性真菌。方法　设计了一个以热启动聚合酶链反应 (PCR)为基础的实验方法 ,以一段真菌特异性DNA序列作为通用引物进行检测。引物序列为 :①AACTTAAAGGAATTGACGGAAG ;②GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC。结果　该法能在 3小时之内对所用的全部 2 3种共 42株重要病原性真菌及经培养证实有真菌的 2 2份临床标本成功地扩增出一条310bp的DNA片段 ,但对其它微生物和人体细胞均未扩增出类似片段。该法敏感性高 ,特异性强。结论　采用通用性强的引物系统配合特异性高的热启动PCR技术检测临床和实验室标本中是否存在病原性真菌的方法有重要的应用潜力。     

PCR检测石蜡包埋尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒

应用ＰＣＲ从１００％（４０／４０）石蜡包埋尖锐湿疣组织中检测出ＨＰＶＤＮＡ。扩增ＨＰＶＤＮＡ显著地提高了检测速度及敏感性，以致从数张５～１０μｍ厚的石蜡切片中３～４ｈ即能得到结果；且ＰＣＲ扩增产物具有高度的特异性。因此，ＰＣＲ不失为检测ＨＰＶ简便、快速、敏感、特异的方法。     

聚合酶链反应检测解脲支原体

我们根据已知的解脲支原体尿素酶基因序列，设计了一对聚合酶链反应引物，该组引物对解脲支原体１４个血清型均能扩增出２８６ｂｐ片段，但对实验所用的其它支原体或细菌不能扩增出任何片段，该２８３ｂｐ片段能被限制性内切酶ＨｉｎｃⅡ降解为１５１，１３２ｂｐ两条片段，使用３５个ＰＣＲ循环，可检测出１０＾－１４ｇ的模板ＮＤＡ，约相当于２０个解脲支原体。通过梯度稀释试验证明４０个ＰＣＲ循环时，ＰＣＲ的敏感性与培养法的     

聚合梅链反应检测杜克雷嗜血杆菌实验研究

目的：近年来，国内不断有囫下疳病例报告，但无１例有可靠的实验室依据。因此，探讨聚合酥链反应（ＰＣＲ）检测杜克雷嗜血杆菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）的方法将其应用于临床实践，是目前我国性病防治工作的迫切要求。方法：根据杜克雷嗜血杆菌的特异性１６ｓｒＲＮＡ基因序列设计上下游引物对两株参考菌株进行ＰＣＲ扩增，其扩增产物以１．５％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并测序证实。并用其它的同源或相关病原微生物进行ＰＣＲ扩增，证实其特异性。再以不同浓度菌悬液扩增检测其敏感性。结果：所试两株不同来源的杜克雷嗜血杆菌的扩增呈现单一扩增区带，电泳片段位置与预期结果４３８ｂｐ相符，测定结果与基因库序列一致，并用具有同源及相关的微生物共１９种在相同条件下同时扩增，除杜克雷嗜血杆菌外，均未扩增出预期片断，测试的最高敏感度可达１０＾－６ｍｇ／μｌ。结论：     

应用PCR技术快速检测淋球菌

自淋球菌４．２Ｋｂ质粒ｐＪＤｌ基因序列选择一对引物序列合成引物，ＰＣＲ扩增产物为２３０ｂｐ片段。经３０次循环后，最低可检出１０ＣＦＵ。特异性试验结果表明，这对引物与白念珠菌有部分同源性，ＰＣＲ扩增产物小于７５ｂｐ。与脑膜炎奈瑟菌及其他１３种常见的细菌、４种念珠菌、沙眼衣原体、解脲支原体、正常女性宫颈分泌物中的细菌均无同源性。临床标本检测结果表明，与涂片法和培养法相比较，阳性检出率可达１００％。试验表明，应用本方法可直接快速检测分泌物中的淋球菌。     

PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定

目的 用PCR法快速鉴定22种(23株)深部真菌病致病菌种。方法 应用荧光标记的真菌通用引物ITS4与ITS86对22种(23株)深部真菌病致病菌种的菌悬液进行PCR扩增，扩增产物经ABI PRISM^TM377测序仪及基因扫描分析软件精确测定片段大小，与对照组——相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果 ①17种致病菌种菌悬液经ITS4、ITS86扩增出单一的片段(除了构巢曲霉和黑曲霉、白念珠菌和类星形念珠菌、裴氏着色真菌和皮炎外瓶霉片段长度相同)。②菌悬液扩增片段的扫描分析结果与其DNA扩增结果相近，差异无显著性。③整个检定过程仅需6h。结论 采用ITS通用引物及菌悬液PCR检测法，结合基因扫描分析技术可准确、特异、快速、敏感地检测并鉴定出22种深部真菌病致病菌种，这将有望成为快速诊断深部真菌病的一种方法。     

聚合酶链反应检测深部致病真菌的实验研究

目的 建立能用于临床实践的检测常见致病真菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法 设计了以热启动PCR为基础的实验方法,首先用真菌通用引物对标本进行单重PCR,若阳性,再用白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的种特异性引物进行三重PCR来检测这3种常见致病真菌.结果 对9属55种78株常见深部真菌均扩增出260bp的DNA片段,而对细菌和人DNA均未扩增出目的 片段,具有高度特异性和敏感性,该方法操作简便且成本低.结论 以热启动PCR为基础的单重PCR和三重PCR方法可能成为临床上深部真菌感染理想的快速诊断工具.     

多重PCR诊断甲真菌病的实验研究

目的初步建立多重PCR诊断甲真菌病的方法。方法选择3对引物(真菌通用引物、皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立三重PCR体系,采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性;并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果筛选得到的真菌通用引物NS、皮肤癣菌特异性引物CHS1和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性;在适宜的反应条件下,无论对单模板,还是多模板,该反应体系均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;该反应体系的检测灵敏度为102cfu/ml。结论多重PCR技术是一种快速、敏感和特异诊断甲真菌病的方法。     

皮肤感染性肉芽肿常见病原菌微孔板反向杂交检测法的研究

目的 探讨微孔板反向分子杂交技术与PCR-ELISA相结合的“拟芯片”法检测和鉴定皮肤感染性肉芽肿常见病原菌的方法。 方法 选取、设计真菌和分枝杆菌两对通用引物,及10种皮肤感染性肉芽肿常见的病原菌：结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海鱼分枝杆菌、偶遇分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、申克孢子丝菌、卡氏枝孢霉、裴氏着色真菌、F. Monophora、白念珠菌的特异性探针;采用标准株验证通用引物、特异性探针并检测“拟芯片”法的敏感性、特异性;对19株临床分离株进行检测和鉴定。 结果 两对通用引物均可扩增出对应的菌种基因序列,PCR产物经测序分析与预期相符;“拟芯片”法检测阴性标本吸光度为0.041 ± 0.02,公式计算得临界值为0.101,在此基础上测得其敏感性为1 × 10 ~ 1 × 102个菌细胞/ml。各病原菌与相应的探针杂交,吸光度均 ＞ 0.101,为阳性;而与非对应的探针杂交,则吸光度 ＜ 0.101,为阴性,特异性高;对临床分离株的菌种鉴定准确率高。 结论 “拟芯片”法可应用于皮肤感染性肉芽肿常见病原菌的实验室快速检测和鉴定。     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。     

多重RT-PCR诊断甲真菌病的体外模拟研究

目的:拟建立多重RT-PCR诊断甲真菌病的方法。方法:采用Trizol提取真菌的RNA;选择3对引物(真菌通用引物,皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立3重RT-PCR体系,采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性;并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果:(1)所采用的真菌通用引物28srDNA、皮肤癣菌特异性引物ACT和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性;(2)在适宜的反应条件下,无论对单模板,还是多模板,该反应体系均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;(3)该反应体系对模拟临床标本的检测灵敏度为102cfu/mL。结论:多重RT-PCR技术可在较短时间内检测出皮肤癣菌、酵母和霉菌等,并可判断菌的活力,将为临床快速诊断和及时、合理地治疗甲真菌病和其他真菌性疾病提供参考。     

用内转录间隔区通用引物的聚合酶链反应快速测定念珠菌菌种

目的：应用内转录间隔区（ITS）通用引物建立一种较为快速、简便的检测和鉴定念珠菌的聚合酶链反应（PCR）方法。方法：采用两对ITS通用引物ITS1、ITS4和ITS86、ITS4对7种（8株）念珠菌菌县液进行PCR扩增。结果：两对引物3.5h内对7种念珠菌的菌县液扩增出种特异的DNA多带，而第2对引物其种特异性更强。结论：采用ITS通用引物结合快速PCR检测法，可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这将在今后念珠菌病的早期诊断和治疗上有潜在的应用价值。     

聚合酶链反应快速检测丝状真菌

目的　建立并评价一种新的丝状真菌的快速PCR检测方法。方法　将 13种培养的不同丝状真菌菌种经匀浆器研磨处理后直接放入一个新建立的PCR体系 ,用 2对真菌通用引物进行PCR扩增。结果　 13种不同的丝状真菌菌种均在 2h内通过该PCR方法成功地获得了靶DNA的扩增 ,无需任何DNA抽提步骤 ,可用于直接扩增处于任何生长期的未经处理的丝状真菌DNA。结论　此法简便、快速 ,敏感性、特异性均高 ,对丝状真菌引起的深部真菌感染的早期诊断将具潜在意义。     

多重PCR-反向线点杂交技术在检测女性念珠菌和阴道毛滴虫感染中的应用

目的建立和评价多重PCR-反向线点杂交技术(mPCR-RLB)快速同时检测阴道毛滴虫和念珠菌感染的方法。方法分别选择阴道毛滴虫特异性DNA重复序列设计一对特异性引物,以念珠菌属28srRNA至5.8s rRNA间隔序列Ⅱ(ITS2)为靶基因设计一对检测念珠菌的通用引物,构建二重PCR同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌DNA,然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷核探针杂交,并对女性阴道试子标本进行检测。结果多重PCR可同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌临床或标准菌株DNA,上述念珠菌标准菌株可扩增出302～441bp DNA片段,阴道毛滴虫临床株可扩增出262bp DNA片段。6种念珠菌和阴道毛滴虫的特异性寡核苷酸探针可分别与其相应的PCR产物杂交。通过对150例女性阴道试子进行检测,mPCR-RLB检测念珠菌的阳性率为47.33%,阴道毛滴虫的阳性率为6.67%,二者同时阳性率为1.33%。而培养法检测念珠菌阳性率为36.00%,阴道毛滴虫的阳性率为2.00%,二者同时阳性率为0.67%。明显高于培养法(P<0.05)。结论多重PCR-RLB可快速同时检测念珠菌和阴道毛滴虫,为女性阴道炎的临床诊断提供了一种可靠的方法。