急性白血病、恶性淋巴瘤患儿大剂量阿糖胞苷治疗的药代动力学及代谢关键酶基因表达研究

目的 探索大剂量阿糖胞苷(HD-AraC)治疗儿童恶性血液肿瘤的药代动力学,以及代谢关键酶基因表达与临床疗效的关系.方法 应用高效液相色谱法测定HD-AraC治疗时血液和脑脊液中药物浓度;采用RT-PCR法检测3种白血病细胞株和48例急性白血病(AL)患儿骨髓细胞中脱氧胞苷激酶(dCK)和胞苷脱氨酶(CDA)基因表达,通过分析不同类型AL患儿,以及初治和复发患儿dCK和CDA mRNA表达差异,探讨dCK和CDA mRNA表达与疗效的关系.结果 ①HD-AraC治疗时血浆药物浓度可达到常规剂量Ara-C的50倍,脑脊液中药物浓度达到血浆浓度的10%;②不同类型儿童AL,以及初治和复发患儿的dCK mRNA表达强度差异有统计学意义,与临床疗效明显相关;③体外实验发现经Ara-C不同剂量和时间作用后,白血病细胞株的dCK和CDA mRNA表达没有变化.结论 HD-AraC治疗可明显提高血浆和脑脊液中药物浓度,是治疗儿童AL的有效疗法.dCKmRNA表达强弱可能为儿童AL远期疗效的重要影响因素之一.     

CCK-8法检测阿糖胞苷对白血病细胞株增殖抑制作用

目的探索阿糖胞苷(Ara-C)治疗急性白血病的剂量、时间与效应的相关性。方法采用CCK-8法,检测不同剂量梯度范围内(0.1～200μmol/L)、Ara-C作用不同时间(4～48 h),对白血病细胞株Jurkat(ALL)和NB4(AML)增殖抑制作用的差异与特征规律。结果 Jurkat细胞和NB4细胞在一定的Ara-C作用浓度范围内,均存在着随作用时间延长,增殖抑制逐渐提升的效应。在4 h和8 h 2个作用时间组中,随着Ara-C剂量递增,Jurkat细胞的增殖抑制率明显增加;而NB4细胞仅在0.5～50μmol/L浓度梯度范围内呈现剂量与效应的相关性。结论 Ara-C作为细胞周期特异性药物(CCSA),对肿瘤细胞的增殖抑制效应存在明显的时间-剂量相关性,Jurkat对Ara-C的敏感性高于NB4。[临床儿科杂志,2012,30(5):460-463]     

阿糖胞苷体外对人白血病细胞株HL-60细胞增殖抑制和诱导凋亡的相关性研究

目的 　研究阿糖胞苷 (Ara -C)在体外对人白血病细胞株HL - 6 0增殖抑制和诱导凋亡的剂量 -时间 -效应关系。通过对Ara -C在不同剂量和疗程时抗白血病的机理研究 ,验证大剂量阿糖胞苷 (HD -AraC)治疗血液肿瘤的优越性。方法 　在体外设定的浓度梯度和作用时间下应用Ara -C处理人白血病HL - 6 0细胞 ,采用四氮唑盐还原法 (MTT法 )检测Ara -C对HL - 6 0细胞增殖抑制的剂量 -时间 -效应关系 ,荧光染色观察凋亡细胞形态学改变 ,琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯带 (DNA ,Lad der) ,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化。结果　荧光染色观察到特异性的凋亡小体形成 ,DNA琼脂糖凝胶电泳显示出典型的电泳条带变化 ,流式细胞仪检查见明显的凋亡峰形成 ,细胞周期主要阻滞在sub -G1期。MTT法显示阿糖胞苷作用于HL - 6 0细胞的半数抑制浓度 (IC50 )分别是 2 .4 1 μM和 1 1 .81 μM。统计分析表明 :随着药物浓度的增加和作用时间的延长 ,Ara -C对细胞的增殖抑制和诱发凋亡作用逐渐增强 (P <0 .0 5)。结论　诱导白血病细胞凋亡可能是Ara -C抗白血病的机理之一 ,通过诱导HL - 6 0细胞凋亡从而对其产生明显的增殖抑制作用 ,且与剂量、时间相关。提示应用HD -AraC治疗白血病 ,可以明显提高疗效。     

阿糖胞苷作用下白血病细胞膜人核苷转运体1基因表达变化研究

目的检测肿瘤细胞膜上人平衡型核苷转运体1(human equilibrative nucleoside trans-porter 1,hENT1)基因表达及其变化,探索影响阿糖胞苷(Ara-C)治疗急性白血病(AL)疗效的相关因素。方法根据目前临床采用的低剂量、中剂量和大剂量Ara-C(HD-AraC)治疗时所能达到的血浆药物浓度,分别采用0.5～100μmol/L中的6种不同剂量(0.5、1.0、5.0、15、50、100μmol/L)体外作用于白血病细胞株Jurkat和NB4,经4～48 h的5个时间段(4、8、12、24、48 h)作用后,采用定量RT-PCR方法测定hENT1 mRNA表达及其变化。结果 (1)Jurkat和NB4细胞的hENT1mRNA原始相对表达量(ΔCt值)分别为5.21±0.02和5.34±0.05,两者差异无显著性(P0.05)。(2)在较低剂量Ara-C(0.5～15μmol/L)作用下,hENT1 mRNA表达恒定,与阴性对照组差异无显著性(P0.05);但在高浓度Ara-C(50μmol/L和100μmol/L)作用48 h后,Jurkat和NB4细胞的hENT1 mRNA表达明显增强,ΔCt分别为2.02±0.17和2.19±0.02,与对照组(5.21±0.02)比较差异均有显著性(P0.05)。(3)同一种细胞在50μmol/L和100μmol/L两个剂量组的hENT1mRNA表达增高程度,差异无显著性(P0.05);分别来源于ALL和AML的Jurkat和NB4细胞的表达量间差异亦无显著性(P0.05)。结论 HD-AraC处理48 h后,Jurkat和NB4细胞的hENT1mRNA表达可明显提高,有利于药物进入细胞,以增强抗白血病效应,推测临床HD-AraC疗法采用48～72 h的疗程是必要的。     

氨肽酶抑制剂对人白血病细胞株凋亡的研究

目的 探索氨肽酶抑制剂对体外培养人红白血病细胞株K562作用及其机制。方法 应用四甲基偶氮唆唑蓝(MTT)法、荧光显微镜、透射电检测镜、流式细胞仪观察氨肽酶抑制剂对人红白血病细胞株K562生长的影响。结果 氨肽酶抑制剂能明显抑制白血病细胞生长，其半数生长抑制剂量为28．8μg/ml；透射电镜超微结构证实氨肽酶抑制剂能诱发肿瘤细胞凋亡的典型形态变化；流式细胞仪检测证实氨肽酶抑制剂可诱发细胞凋亡；免疫组化SP法及流式细胞仪定量分析发现氨肽酶抑制剂能使癌基因Bcl—2表达降低、抑癌基因P^53表达增强。结论 氨肽酶抑制剂能诱导K562细胞凋亡，其作用机制可能与癌基因Bcl—2表达减少、P^53表达增强有关。     

去铁胺联合阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡作用的实验研究

目的：探讨铁螯合剂联合阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的作用。方法：实验分为5组：空白对照组、去铁胺组、阿糖胞苷组、去铁胺+ 阿糖胞苷组、去铁胺+阿糖胞苷+三氯化铁组。上述各组与HL-60细胞共同培养6,12,24,4 8 h。通过测定细胞活力、形态学变化、流式细胞仪检测和DNA凝胶电泳等观察细胞凋亡等方法观察诱导HL-60细胞的作用。结果：去铁胺+阿糖胞苷可协同降低HL-60 细胞活力、抑制HL-60细胞增殖、诱导HL-60细胞凋亡,其作用随培养时间延长及药物浓度增加而增强。结论：铁螯合剂协同阿糖胞苷具有增强诱导HL-60细胞凋亡 的作用。     

丙戊酸诱导白血病细胞凋亡机理的实验研究

目的从分子水平探讨丙戊酸(VPA)诱导白血病细胞凋亡的机制,为临床治疗白血病提供理论依据.方法将U937、Jurkat clone E6-1(Jurkat)、BALL-1分别分为1 mmol/L VPA组、1 mmol/L VPA+1 μmol/L zVAD-fmk组(zVAD为N-苯甲基氧化炭酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸)和空白对照组,作用72 h后在流式细胞仪上检测细胞凋亡;采用流式细胞仪检测各组细胞中Bcl-2、Bax和Bcl-xl的平均荧光指数(MFI)以及胱冬肽酶(caspase)3、8和9的含量;Western-blotting检测各组作用前后P44/42有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)表达及磷酸化水平.结果 1 mmol/L VPA诱导U937和Jurkat的凋亡率分别为(75.8±4.2)%和(53.5±5.9)%,与对照组比较,P<0.01;多caspase抑制剂zVAD-fmk可全部抑制U937凋亡,凋亡率为(2.9±0.4)%;可部分抑制Jurkat凋亡,凋亡率下降至(15.4±1.4)%,与1 mmol/L VPA组比较,P<0.01.1 mmol/L VPA未能诱导BALL-1凋亡(P>0.05).VPA对3种细胞内Bcl-2、Bax和Bcl-xl无明显影响.VPA作用后U937中caspase-3水平由(14.09±1.19)%上升至(32.30±2.47)%,caspase-8水平由(4.58±1.41)%上升至(86.47±3.26)%,均P<0.01,caspase-9变化不显著.Jurkat中caspase-3由(12.01±1.63)%上升至(35.56±0.27)%,caspase-9由(13.89±1.71)%上升至(75.89±4.08)%,均P<0.01,caspase-8变化不显著.BALL-1中caspase-3 略有减少,P＜0.05.VPA作用后3种细胞均表现为P44/42MAPK蛋白总量及磷酸化水平下降,P<0.01.结论 VPA通过激活caspase-3和caspase-8诱导U937凋亡;诱导Jurkat凋亡时涉及caspase-3、9的活化;抑制P44/42MAPK通路是VPA诱导凋亡的另一机制.VPA并非通过改变细胞中Bcl-2等的含量造成上述细胞凋亡.高表达Bcl-2可对抗VPA的作用.     

MS275对发育期惊厥大鼠p38 MAPK信号通路的调控机制研究

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS275在发育期大鼠惊厥发病中对p38 MAPK信号通路的调控机制。方法 将32只雄性大鼠随机分为对照组、戊四唑（PTZ）组、低剂量MS275组（3?mg/kg）及高剂量MS275组（6?mg/kg）（n=8）。通过腹腔注射PTZ制作发育期大鼠惊厥模型,对照组仅注射生理盐水;MS275在PTZ诱导惊厥前2?h腹腔注射给药。造模成功后24?h,每组取6只大鼠,Western blot法检测海马组织p38、MK2、CREB和IL-6蛋白表达;qRT-PCR法检测p38、MK2、CREB和IL-6 mRNA表达;苏木精-伊红（HE）染色观察脑组织病理变化;Western blot法检测小胶质细胞活化标志物CD11b的表达。结果 PTZ组大鼠海马组织中p38、MK2、CREB和IL-6 mRNA及其蛋白的表达均较对照组显著增高（P < 0.05）;而MS275能抑制上述指标mRNA及其蛋白在发育期惊厥大鼠中的表达水平（P < 0.05）;6?mg/kg MS275对CREB mRNA及其蛋白、IL-6 mRNA的抑制作用比3?mg/kg MS275更显著（P < 0.05）。HE染色结果可见PTZ组海马组织有明显的神经元凋亡及细胞水肿,伴有较多的炎性细胞浸润;而MS275干预组能减轻发育期惊厥大鼠神经元凋亡及细胞水肿,同时减少炎性细胞浸润。PTZ组小胶质细胞活化明显增多,而MS275能抑制发育期惊厥大鼠小胶质细胞活化（P < 0.05）;且6?mg/kg MS275的抑制作用比3?mg/kg MS275更显著（P < 0.05）。结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS275能抑制发育期惊厥大鼠p38 MAPK信号通路、海马神经元的凋亡和小胶质细胞活化,从而减少炎症反应及惊厥性脑损伤;且MS275的作用可能存在剂量依赖性。     

抗CD47抗体联合阿糖胞苷靶向治疗NOD/SCID小鼠单核细胞白血病的研究

目的：探讨CD47在急性髓细胞白血病NOD/SCID小鼠模型中的预后意义及靶向治疗的最佳策略。方法：将分选的CD34+CD38-白血病干细胞（leukemia stem cells, LSCs）移植入NOD/SCID小鼠体内,建立小鼠急性单核细胞白血病模型;抗人CD47单克隆抗体单独或联合阿糖胞苷治疗白血病小鼠7~14 d,并进行疗效分析。将LSCs与小鼠巨噬细胞在含抗CD47单克隆抗体的培养液中共培养,观察CD47对巨噬细胞吞噬LSCs能力的影响。结果：THP-1细胞中存在CD34+CD38- LSCs,比例约为0.12%±0.06%,将分选后的CD34+CD38- LSCs（比例高达97.0%±1.7%）移植入NOD/SCID小鼠后成功建立白血病模型。体内实验表明,阿糖胞苷（7 d）联合抗CD47单克隆抗体（14 d）治疗后,白血病小鼠外周血和骨髓中CD33+CD45+白血病细胞下降最明显（P<0.01）,生存时间明显长于其它各组。体外共培养2 h后,抗CD47单克隆抗体组吞噬指数（76.9%±12.2%）明显高于抗CD45单克隆抗体组（7.60%±2.4%,P<0.01）。结论：CD47高表达是急性髓细胞白血病的预后不良因素。阿糖胞苷联合抗CD47单克隆抗体可有效杀灭普通白血病细胞和白血病干细胞,对彻底治愈急性髓细胞白血病具有重要临床意义。     

不同丙戊酸负荷量对癫痫持续状态的治疗效果分析

目的了解不同丙戊酸负荷量对癫痫持续状态患儿的治疗效果。方法收集2013年1月1日至2017年12月31日在浙江大学医学院附属儿童医院重症监护室住院治疗的癫痫持续状态患儿的病例资料,根据丙戊酸负荷量进行分组,了解各组患儿癫痫持续状态的控制情况。结果(1)66例癫痫持续状态患儿,包括癫痫36例(54.5%),颅内感染16例(24.2%),缺氧窒息3例(4.5%),颅内肿瘤2例(3.0%),脑发育异常2例(3.0%),颅内出血2例(3.0%),病因不明确5例(7.6%)。(2)所有癫痫持续状态患儿根据不同的丙戊酸负荷量(0 mg/kg,10~15 mg/kg,16~39 mg/kg,40 mg/kg)分为4组,各组间的性别、年龄差异无统计学意义,癫痫持续状态控制时间和癫痫控制情况差异无统计学意义(P=0.402、0.340)。(3)所有患儿予丙戊酸钠应用后都有监测肝功能,无一例患儿出现肝功能损害的表现。结论不同丙戊酸负荷量对于癫痫持续状态患儿的治疗效果无明显差异,并且接受负荷量为40 mg/kg治疗的癫痫持续状态患儿未出现相关不良反应。     

Hyperamino-acidaemia and hyperammonaemia in epileptic children treated with valproic acid

Serum amino acid pattern, blood ammonia, and serum valproic acid (VPA) levels were estimated in 75 epileptic children with and without VPA therapy. The incidence of patients with hyperammonaemia (>60 mol/l) in patients treated with only VPA or with a combination of VPA and other antiepileptic drugs was 19% and 20% respectively. Hyperammonaemia was not observed in patients receiving other drugs. Elevated levels of serum glycine, alanine and serine were more common in epileptic patients treated with VPA alone and with VPA in combination with other drugs than in patients receiving other drugs. A significant positive correlation was found between the serum levels of glycine and alanine, of glycine and serine, and of serine and alanine. These findings may indicate a mitochondrial dysfunction caused by VPA.Abbreviation VPA valproic acid     

丙戊酸诱发肝衰竭1例报告及文献复习

报道1例丙戊酸(VPA)诱发婴儿肝衰竭病例。患儿,女,8个月16天,自生后1月余即被诊断为婴儿痉挛,以较大剂量VPA及氯硝西泮(CNP)治疗,近日合并肺炎伴癫癎发作加重,且颜面、颈胸部出现较多针尖大小出血点,伴牙龈出血,四肢尤双下肢明显凹陷性水肿。实验室检查见血象三系降低,严重低蛋白血症,但肝酶谱ALT正常,VPA及CNP血药浓度均高于参考范围,考虑为VPA诱发肝衰竭。结合该病例的特殊临床表现和近年文献复习,对VPA诱发肝衰竭的高危因素、发生机制、早期临床判断、以及防治对策进行分析讨论。     

The influence of valproic acid treatment on hair and serum zinc levels and serum biotinidase activity

Some of the side effects that develop during long-term valproic acid (VPA) treatment are similar to symptoms of zinc and partial biotinidase deficiencies. This situation suggests an association between these side effects and biotinidase and/or zinc deficiencies. In 32 pediatric patients (22 females, 10 males) receiving VPA treatment, hair and serum zinc levels and serum biotinidase activity (BA) were measured prior to and in the 3rd and 6th months of treatment. Also, serum VPA levels were measured in the 3rd and 6th months of treatment. The mean serum and hair zinc levels were found to be reduced in the 3rd and 6th months of treatment as compared with the pre-treatment values, while the mean serum BA was lower than the pre-treatment values in the 3rd month of treatment, but returned to initial values in the 6th month of treatment. In the 3rd and 6th months of treatment, patients complaining about hair loss had lower hair and serum zinc levels and serum BA but greater mean serum VPA than those who did not. However, the differences between parameters were not statistically significant. Our findings suggest that hair loss in patients can be attributed to zinc and BA depletion within the first 3 months, and to zinc depletion only by the 6th month.     

Endocrine effects of valproic acid therapy in girls with epilepsy: A prospective study

Background/aimIt is controversial whether the endocrine dysfunction in epilepsy patients is caused by the epilepsy itself, the antiepileptic therapy, or both. We prospectively evaluated the long-term impact of valproic acid monotherapy compared to other anti-epileptic drugs on anthropometric, metabolic, hormonal, and ultrasonographic parameters in girls with epilepsy.MethodsFifty-seven female patients with epilepsy who had started therapy at mean age of 11.5 ± 3.3 years, 42 with valproic acid (mean dose 13.1 ± 7.0 mg/kg/day and 15 with other anti-epileptic agents were followed for a mean of 3.2 years (range 1.0–8.5 years) in our center. Clinical, hormonal and transabdominal pelvic ultrasound data were collected at 3 time points: before and 6–12 months after onset of anti-epileptic drug treatment; and at the last visit while patients were still taking anti-epileptic drugs.ResultsThere were no significant between-group differences regarding changes in height, body mass index standard deviation score, levels of glucose and insulin, or lipid and endocrine profile from first to last visits. Mean thyroid-stimulating hormone level increased significantly between first and last visit only in the valproic acid group (p < 0.001), with no significant difference in free T4 level over time or between groups. The rate of clinical polycystic ovary syndrome for the valproic acid group (11%) was comparable to that reported in healthy controls (5–10%).ConclusionsAdministration of valproic acid had no adverse effect on body weight, metabolic status or endocrine function over an average follow-up of 3.2 years. Valproic acid appears to be safe for use in girls with epilepsy.     

地塞米松对缺氧缺血新生大鼠脑组织兴奋性氨基酸和C-fos蛋白表达的影响

目的观察地塞米松（DXM）对缺氧缺血新生大鼠脑组织兴奋性氨基酸（EAA）和C-fos蛋白表达的影响，探讨其在缺氧缺血性脑损伤（HIBD）中的应用价值。方法建立HIBD动物模型，应用高效毛细管电泳和免疫组化方法，分别检测假手术组、HIBD组、小剂量DXM干预组（0．5mg／kg）及大剂量DXM干预组（10mg／kg）的脑组织EAA含量及C-fos蛋白表达水平。结果HIBD组的EAA含量及C-fos蛋白表达均较假手术组明显升高（P〈0．01）；小剂量DXM组的EAA含量及C-fos蛋白表达较HIBD组无明显变化（P〉0．05）；大剂量DXM组EAA含量较HIBD组明显减少（P〈0．01），较小剂量DXM组减少（P〈0．05）；大剂量DXM组C-fos蛋白表达较HIBD组及小剂量DXM组均明显降低（P〈0．01）。结论缺氧缺血促进脑组织EAA的释放，诱导C-fos蛋白表达；大剂量DXM干预可能通过抑制EAA释放，降低C-fos蛋白表达而对缺氧缺血脑损伤起保护作用。     

地塞米松对缺氧缺血新生大鼠脑组织兴奋性氨基酸和C-fos蛋白表达的影响

目的观察地塞米松(DXM)对缺氧缺血新生大鼠脑组织兴奋性氨基酸(EAA)和C-fos蛋白表达的影响,探讨其在缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的应用价值。方法建立HIBD动物模型,应用高效毛细管电泳和免疫组化方法,分别检测假手术组、HIBD组、小剂量DXM干预组(0．5 mg/kg)及大剂量DXM干预组(10mg/kg)的脑组织EAA含量及C-fos蛋白表达水平。结果 HIBD组的EAA含量及C-fos蛋白表达均较假手术组明显升高(P<0．01);小剂量DXM组的EAA含量及C-fos蛋白表达较 HIBD组无明显变化(P>0．05);大剂量DXM组EAA含量较HIBD组明显减少(P<0．01),较小剂量 DXM组减少(P<0．05);大剂量DXM组C-fos蛋白表达较HIBD组及小剂量DXM组均明显降低(P< 0．01)。结论缺氧缺血促进脑组织EAA的释放,诱导C-fos蛋白表达;大剂量DXM干预可能通过抑制EAA释放,降低C-fos蛋白表达而对缺氧缺血脑损伤起保护作用。