三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分的分离、纯化及鉴定

目的分离、纯化及鉴定三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分。方法提取三裂叶豚草花粉粗提液,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定其分子量。收集存在变态反应患者血清,通过免疫印迹法(Western-blotting)对花粉致敏蛋白组分进行鉴定,用离子交换层析初步纯化其致敏蛋白组分,并通过Western-blotting鉴定。结果三裂叶豚草花粉有30余条蛋白条带,其中有14条主要条带,其特异性致敏蛋白组分的相对分子质量为63 000、56 000、40 000和36 500,主要为63 000、40 000和36 500。三裂叶豚草花粉通过离子交换层析纯化出相对分子质量分别为63 000、40 000和36 500的致敏蛋白组分主要集中在Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ峰。结论初步分离、纯化及鉴定了三裂叶豚草花粉致敏蛋白组分。     

抗猪囊尾蚴IgG4抗体的特异性抗原筛选

将囊液抗原蛋白采用双向凝胶电泳分离,经考马斯亮蓝染色后用双向电泳图像分析软件分析蛋白点,以脑囊尾蚴病患者血清为一抗进行蛋白质印迹分析(Western blotting),选取阳性蛋白点进行质谱分析,获取肽质量指纹图谱,采用Mascot软件在NCBI中搜寻、比对,筛选出抗猪囊尾蚴IgG4特异性抗原。囊液抗原经双向电泳检测到(201±5)个蛋白斑点,相对分子质量(M_r)为10 000~170 000,等电点(pI)为3.0~10.0。Western blotting分析显示,与患者血清中特异IgG4抗体结合的抗原以小分子量蛋白为主,从中筛选出51个(抗原)点进行质谱分析,其中有21个点峰值大于39。对比分析显示,高峰值点与10种囊尾蚴蛋白有关,其中最为密切相关的为4种蛋白,按分值高低排序分别为Ts8B2、Ts8B3、10ku抗原和Sequence 3。     

霜天蛾昆虫变应原多克隆抗体的制备及免疫特性分析

目的 制备兔抗霜天蛾变应原多克隆抗体,分析其与特异性过敏患者血清抗体成分的异同,为免疫筛选cDNA文库,制备基因重组霜天蛾变应原奠定基础.方法 应用霜天蛾变应原提取液免疫家兔获得霜天蛾变应原多克隆抗体,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定混合免疫兔血清抗体效价:应用免疫印迹的方法对比分析免疫兔血清与特异性过敏患者血清抗体成分的异同.结果 混合免疫兔血清效价经ELISA检测,效价>1:10 000,免疫印迹检测兔抗血清免疫球蛋白G相似文献   

大籽蒿花粉新致敏蛋白组分肌动蛋白(组装)抑制蛋白的鉴定、致敏性及表位

目的研究大籽蒿花粉新致敏蛋白组分肌动蛋白(组装)抑制蛋白(profilin)的基因信息、致敏情况、结构模型和B细胞表位。方法通过转录组测序分析鉴定到一个潜在的profilin基因序列;克隆其基因,表达和纯化得到其蛋白。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹实验研究其致敏性;并利用同源模拟,构建三维结构模型。结果 ELISA表明大籽蒿花粉profilin在蒿属花粉过敏患者血清中的IgE结合率为22%(11/50)。免疫印迹实验表明11份阳性血清中仅5份显示阳性条带。综合分析氨基酸序列和结构模型,获得5个线性B细胞表位和3个构象性B细胞表位。结论大籽蒿花粉profilin在蒿属过敏患者的致敏率为22%,构象性表位在profilin致敏中发挥作用。     

日本血吸虫SIEA28kDa分子抗原的二维凝胶电泳分析

目的分析鉴定日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原(SIEA)28kDa抗原组分.方法用高效液相离子交换法对电泳纯SIEA28kDa抗原组分进一步分离纯化,对获得的色谱纯SIEA28kDa抗原组分进行二维凝胶电泳分析.结果SIEA经双向凝胶电泳分离、银染后获得的SIEA-2D图谱蛋白斑点以pI 3～7和Mw14～66 kDa范围最多.进一步经图象采集、PDQuest 2D软件分析SIEA双向电泳图谱,计算在相同的设定值条件下获取的蛋白质斑点数,测得SIEA-2D电泳图谱平均为(948±89)个蛋白质斑点数.电泳纯SIEA28kDa抗原组分用高效液相离子交换法纯化后,280、220 nm波长色谱图均为一个两侧对称、光滑的高峰曲线,色谱洗脱液对其活性光密度图也为一个两侧对称、光滑的高峰曲线.二维凝胶电泳银染色可见一个显色饱和度高的蛋白质圆斑,免疫印迹分析为一个显色饱和度高的单一圆斑.结论色谱纯SIEA28kDa抗原组分为单一分子,其等电点为5.7.     

抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的作用

目的 观察抗斯氏按蚊中肠蛋白组分的抗体对约氏疟原虫卵囊的抑制作用。 方法 解剖实验室饲养斯氏按蚊雌蚊，取中肠（胃）制备中肠蛋白抗原并免疫BALB/c小鼠（8只， 100 μg/只)， 共免疫4次， 每次间隔7～10 d，末次免疫后10 d，腋窝动脉取血，分离血清。用蛋白质印迹（Western blotting）分析中肠蛋白的免疫活性抗原。用葡聚糖凝胶过滤法获得相对分子质量（Mr）为38 000~50 000的蛋白。用该中肠蛋白免疫小鼠（12只， 100 μg/只)， 共免疫4次，每次间隔7~10 d。同时设PBS对照组。末次免疫后7 d，ELISA检测小鼠血清中的抗体，抗体效价≥1 : 2 560时，该免疫组小鼠和对照组小鼠经腹腔接种感染约氏疟原虫（约含2×10⁷个感染疟原虫的红细胞），感染后3 d取小鼠尾血镜检，雌配子体数＞2/10个视野的小鼠作为供血鼠，斯氏按蚊成蚊吸血后9 d解剖，计数中肠的卵囊数量。 结果 Western blotting显示斯氏按蚊中肠蛋白抗原的显色区带有8条，其中Mr 38 000~50 000的区带显色较清晰；实验组和对照组中肠卵囊感染率分别为28.70%（62/216）和51.09%（47/92）（P＜0.05），中肠卵囊指数分别为14.14（1 541/109）和26.02（1 223/47），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论 斯氏按蚊Mr 38 000~50 000中肠蛋白有免疫活性；针对该中肠蛋白的抗体对约氏疟原虫卵囊的发育有明显的抑制作用。     

腐食酪螨过敏原的分析鉴定与纯化

目的 分析、鉴定与纯化腐食酪螨过敏原组分。 方法 以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定腐食酪螨蛋白质提取液中的蛋白质组分和过敏原组分，并通过阴离子交换层析和分子排阻色谱进一步纯化。 结果 腐食酪螨的蛋白质粗浸液电泳后可以辨认的蛋白质带共23条，相对分子质量（Mr）分别为177 000、118 000、107 000、70 000、67 000、60 000、52 000、45 000、41 000、40 000、38 000、37 000、35 000、27 000、23 000、22 000、18 000、17 000、16 000、15 000、14 000、13 000和12 000。Western blotting分析显示，腐食酪螨的5条致敏蛋白质带分别为Mr 128 000、67 000～70 000、36 000～37 000、18 000和16 000，其中前3条带特异性结合IgE阳性率均为100％，而Mr 18 000和Mr 16 000条带的阳性反应率分别为77.8%和44.44%。通过阴离子交换层析和分子排阻色谱从腐食酪螨粗浸液中分离到Mr 18 000的过敏原组分。 结论 腐食酪螨有4种主要过敏原及1种次要过敏原。     

水蛭热刺激分泌物与日本血吸虫成虫可溶性物质的免疫交叉反应性分析

目的分析水蛭热刺激分泌物(Wp-hs)与日本血吸虫成虫可溶性物质(Sj-Ds)间的共同组分,探讨两者之间免疫交叉反应的物质基础。方法通过升高温度刺激水蛭虫体产生Wp-hs,同时收集室温放置的水蛭分泌物作为对照,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Wp-hs与Sj-Ds之间的共同蛋白组分;将这些共同蛋白组分分别与日本血吸虫病患者混合血清、兔抗Wp-hs免疫血清、健康人混合血清进行斑点酶联免疫吸附试验和免疫印迹试验,找出具有免疫交叉反应活性的共同蛋白组分。结果Wp-hs与Sj-Ds之间存在着分子量(12.6~85.4kDa)相近的蛋白条带。Wp-hs抗原在21.6~95.4kDa分子量范围内与日本血吸虫病患者混合血清反应尤为明显,且不与正常人血清反应;Sj-Ds(40.1~89.0kDa)与兔抗Wp-hs免疫血清能较好的结合。结论Wp-hs与Sj-Ds之间至少存在3种具有免疫活性的共同蛋白组分。     

染氟成骨细胞的双向电泳和质谱鉴定

目的探讨双向电泳和质谱鉴定技术在染氟成骨细胞蛋白表达变化中的意义,为探索氟骨症发病机制提供有效手段。方法采用小鼠乳鼠颅骨来源的成骨细胞进行培养,抽提染氟(2mg/L)72h组和对照组成骨细胞蛋白,用双向凝胶电泳进行分离及ImageMaster2DElite软件分析电泳图谱,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪对两组间比较具有统计学意义的差异蛋白点进行鉴定。结果在对照组成骨细胞蛋白双向电泳图谱上可观察到671个蛋白点,而在染氟组双向电泳图谱上可见到837个蛋白点;在染氟成骨细胞表达有明显差异的蛋白点经质谱鉴定出12种(7种蛋白表达增多,5种降低),主要是与细胞代谢旺盛、蛋白质氧化折叠和氧化应激等相关的蛋白。结论实验所采用的双向电泳和质谱鉴定方法可有效分离和鉴定成骨细胞蛋白点,为氟骨症的发生机制提供了有价值的新线索,表明蛋白质组学技术较其他方法具有很大的优越性。     

柏树花粉主要致敏蛋白Cup a 1的分离纯化

目的 提取和分离纯化柏树花粉主要致敏蛋白Cup a 1.方法 使用40 mmol/L NH4 HCO3缓冲液作为提取液对柏树花粉致敏蛋白进行粗提取,利用离子交换层析初步纯化其主要致敏蛋白Cup a 1,收集400 mmol/L NH4 HCO3组分的洗脱液,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对收...     

应用双向电泳及蛋白质印迹分析弓形虫特异性抗原

将感染弓形虫速殖子的SD大鼠血清和健康大鼠血清作为一抗进行蛋白质印迹（Western blotting）分析,比较杂交蛋白点的差异,分析弓形虫速殖子特异性抗原。弓形虫速殖子总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱（7 cm×8 cm, pH 3～10）共检测到209个蛋白质斑点。Western blotting显示实验组抗原抗体反应点17个,对照组仅2个非特异性的蛋白结合点。     

三裂叶豚草花粉新致敏蛋白组分超氧歧化酶克隆表达与致敏性

目的 克隆和表达三裂叶豚草花粉中的一种新致敏蛋白组分超氧歧化酶,探讨其在中国人群中的致敏特征。方法 通过对三裂叶豚草花粉转录组学研究,鉴定到一种潜在的超氧歧化酶基因序列,对基因进行克隆,通过表达和纯化获得蛋白,用clustalX2将已报道的超氧歧化酶与该基因进行多重序列比对,通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)研究三裂叶豚草花粉超氧歧化酶的致敏性。结果 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶序列编码区含465个碱基,编码154个氨基酸。多重序列比对发现三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与橄榄花粉过敏原Ole e 5氨基酸序列存在一定的保守性,为53.9%。ELISA结果显示三裂叶豚草花粉超氧歧化酶的IgE结合率为12%(5/42),5份阳性血清在免疫印迹实验中均显示阳性结合带。结论 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶是一种新的致敏蛋白组分,本研究对完善三裂叶豚草花粉过敏原组分信息具有重要意义,为三裂叶豚草花粉过敏疾病的组分解析诊断方法的建立奠定了基础。     

钉螺肝脏蛋蛋白质双向电泳方法的建立

目的建立针对钉螺肝脏蛋白质组阵列分离的双向电泳方法。方法分析裂解液、细胞破碎、沉淀方法对钉螺肝脏蛋白质提取的影响,并优化双向电泳参数,建立钉螺肝脏蛋白质的提取方法和双向电泳条件。结果LysisⅢ（8mol/L尿素,4%CHAPS,65 mmol/L DTT,40 mmol/L Tris,0.5%IPG Buffer）提取钉螺肝脏总蛋白,2-D Clean-up试剂盒处理纯化总蛋白,等电聚焦参数为8000 v,50000 vh,成功获得了分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,凝胶经EMBL银染,可分辨蛋白质斑点数约430个。结论建立了钉螺肝脏蛋白质双向电泳技术,为开展钉螺蛋白质组学研究奠定了良好基础。     

血清蛋白质组分析技术筛选肝癌自发抗体

目的采用血清蛋白质组分析技术(SERPA)筛选、鉴定肝癌自发抗体。方法双向电泳分离肝癌细胞系HCCLM3的总蛋白后将其转膜,肝癌、肝炎和正常组血清各8份与膜免疫印迹,图像分析确定不同血清免疫印迹图谱间的差异点及其与双向电泳图谱的对应关系,最后用基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行鉴定。结果建立了高重复性HCCLM3的双向电泳图谱及其肝癌、肝炎及正常组血清的免疫印迹图谱,图谱均点数分别为603、70.75±24.25、68.50±23.44和41.38±15.05,肝癌、肝炎组图谱点数明显多于正常组,但肝癌与肝炎组差异无统计学意义。质谱鉴定确定了核蛋白、细胞骨架、代谢酶及热休克蛋白等五类肝癌自发抗体。结论SERPA是一种高通量筛选、鉴定肿瘤自发抗体的新技术,大量肝癌自发抗体的发现为肝癌进一步的免疫诊断及治疗奠定了基础。     

蚯蚓与常见蠕虫共同蛋白组分及生物学活性的初步研究

目的初步探讨蚯蚓与血吸虫、并殖吸虫、囊尾蚴和旋毛虫的共同蛋白组分及其免疫活性。方法用SDS-PAGE分析蚯蚓可溶性抗原(PaAg)、血吸虫可溶性成虫抗原(SjAg)、并殖吸虫可溶性成虫抗原(PwAg)、囊尾蚴囊液抗原(TcAg)和旋毛虫可溶性幼虫抗原(TsAg)的蛋白组分;并将其蛋白组分分别与血吸虫病、并殖吸虫病、猪囊尾蚴病和旋毛虫病患者阳性血清和兔抗蚯蚓血清进行免疫印迹试验(Westernblot)分析。结果PaAg与SjAg、PwAg、TcAg、TsAg的蛋白组分间存在较多分子量相近的蛋白条带。分子量在39~70kDa范围内的PaAg与血吸虫病、并殖吸虫病、猪囊尾蚴病和旋毛虫病患者血清的交叉反应尤其明显。SjAg、PwAg、TsAg和TcAg也能与兔抗蚯蚓血清较好的结合。结论PaAg与SjAg、PwAg、TcAg、TsAg之间存在着具有免疫活性的共同蛋白组分和特异性的蛋白组分。     

投氟大鼠肾组织蛋白质组学的初步研究

目的探讨蛋白质组学技术在投氟所致大鼠肾组织蛋白质的整体表达变化研究中的价值，为氟中毒肾损害机制的研究提供新途径。方法采用固相pH梯度（IPG）等电聚焦双向凝胶电泳方法，对投氟（100mg／L）8周和对照大鼠肾组织的蛋白质进行分离，使用Image master 2Delite图像软件分析电泳图谱．利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪对两组间比较具有统计学有意义的差异蛋白点进行鉴定。结果在对照组大鼠肾组织蛋白双向电泳图谱上可观察到624个蛋白点．而投氟组肾组织双向电泳图谱上可见到776个蛋白点。与对照组比较，在投氟组大鼠肾组织表达明显改变的蛋白点经质谱鉴定出13种，主要是与细胞代谢、增殖和氧化应激相关的蛋白，其中11种蛋白表达增多，2种降低。结论本实验所采用的双向电泳和质谱鉴定方法可有效分离和分析肾整体蛋白点，并反映出投氟大鼠肾组织细胞代谢旺盛、增殖活跃和氧化应激明显的特点．表明蛋白质组学技术在氟中毒肾损害研究中具有实用价值。     

酶联免疫电转移印迹技术在囊尾蚴病诊断中的应用

目的　应用高度敏感、特异的酶联免疫电转移印迹技术(EITB)诊断囊尾蚴病。　方法　用双向电泳法对囊液抗原进行分离、纯化 ,并通过免疫印迹 ,用囊尾蚴病患者、棘球蚴病患者和其他异源血清筛选高免疫反应性和高特异性抗原组分 ,以此建立EITB诊断方法 ,与传统的ELISA法相比 ,并比较血清和滤纸干血浸出液两种样本的敏感性。　结果　得到了等电点为9.4,相对分子质量为14 000和16 600两组特异性抗原组分 ,以此为诊断抗原建立了EITB诊断方法 ,其敏感度和特异度分别高达92.5%和100% ,显著高于ELISA法。在EITB中血清和滤纸干血浸出液的敏感性相似。　结论　EITB诊断囊尾蚴病较ELISA法敏感性高、特异性强     

复方鳖甲软肝片治疗免疫性肝纤维化大鼠肝细胞质膜蛋白质组分的变化

目的研究复方鳖甲软肝片治疗肝纤维化大鼠肝细胞质膜蛋白质组分的变化,以寻找与肝纤维化逆转相关的质膜蛋白质。方法以猪血清腹腔注射大鼠8周制备肝纤维化模型,再以复方鳖甲软肝片灌胃治疗8周。采用蔗糖密度梯度离心获得肝组织匀浆和质膜组分,采用免疫印迹法检测质膜的纯度,分析差异蛋白质组学变化。结果病理学检查发现实验8周后,大鼠肝脏发生中度肝纤维化;经鳖甲软肝片治疗8周后肝纤维化程度减轻,基本恢复到正常水平;免疫印迹检测显示质膜组分得到了较好的富集,其中线粒体等其他细胞器蛋白减少;通过差异蛋白质组学分析发现,治疗组中有22个3倍以上差异蛋白质点,准确鉴定了9个蛋白质,通过免疫印迹验证发现了Ⅱ型细胞支架蛋白8和膜联蛋白A2的差异表达。结论鳖甲软肝片治疗后,大鼠肝纤维化发生了逆转,并伴随一些质膜蛋白质的表达变化。     

旋毛虫新生幼虫抗原的免疫印迹分析

利用免疫印迹法分析了旋毛虫的新生幼虫(NBL)抗原,并与旋毛虫的成虫和肌肉期幼虫抗原加以比较。NBL虫体组分经SDS-PAGE分离出约40条区带,与成虫和肌肉期幼虫的电泳图谱明显不同。免疫印迹表明,用NBL作免疫原可诱导家兔产生具有期特异性的免疫反应,其有抗原性的分子量分别为129、120、89、87、79、72、64、58、43、40、38、34、32和20kDa。但在自然感染过程中,宿主体内未检测到抗NBL的抗体。     

日本柳杉花粉变应原致敏蛋白组分

日本柳杉花粉变应原致敏蛋白组分目前已分离纯化并鉴定的有Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3、CJP-6、CJP-4、CJP-8及CPA9等,其中某些致敏蛋白组分还具有多种异构体,因此日本柳杉花粉变应原的成分构成十分复杂。Cry j 1和Cry j 2是目前公认的日本柳杉花粉的主要致敏蛋白组分,二者均为糖蛋白,分子结构中均包含B细胞表位和T细胞表位,也与柏科其他植物花粉致敏蛋白组分具有很高的交叉反应性。其中Cry j 1具有果胶裂解酶活性,Cry j 2则有聚甲基半乳糖醛酸酶活性。后续发现的日本柳杉致敏蛋白组分Cry j 3、CJP-6、CJP-4、CJP-8及CPA9等也均有与花粉症患者血清IgE有较高的结合能力,这些蛋白质特点各异,但都具有与其他植物来源变应原的交叉反应性。