脑出血后细胞凋亡和Caspase-3的关系

目的:研究脑出血后血肿周围水肿带细胞凋亡随出血时相点的变化规律,以及脑出血后神经细胞凋亡和Caspase-3的关系,为脑出血的治疗提供理论依据. 方法:健康雄性Wistar大鼠随机分为生理盐水对照组、Ⅳ型胶原酶/肝素钠组,分为术后6 h, 12 h, 24 h, 3 d, 7 d共5个时相点. 术后制作冰冻切片,对切片进行TUNEL染色,以及Caspase-3免疫组化和原位杂交染色,之后利用图像分析仪,观察阳性细胞数. 结果:脑出血后6 h后血肿周围出现TUNEL阳性细胞,3 d左右TUNEL阳性细胞范围最广. Caspase-3的表达和细胞凋亡的变化趋势一致. 结论:脑出血后存在细胞凋亡,且细胞凋亡和Caspase-3表达变化趋势一致,提示Caspase-3的表达决定脑出血后细胞凋亡的发生.     

大鼠脑纹状体出血后神经功能损伤的研究

目的:研究影响大鼠脑出血(ICH)后神经功能的因素。方法:将88只SD大鼠随机分为NCG、SCG、ICHG,各组根据术后时间又分为12h、1d、2d、3d、7d5个亚组;用胶原酶/肝素/生理盐水液注入大鼠脑纹状体制备ICH模型;分别在术前和术后各时间点对大鼠进行神经功能评分;干湿重法测脑水含量;TUNEL法观察凋亡细胞;电镜观察血肿周围细胞超微结构改变。结果:1ICH后大鼠出现不同程度神经功能损伤,在ICH3d神经功能损害最严重;2ICHG脑水含量明显高于SCG,以ICH3d脑水含量最高;3在ICH12h血肿周围出现TUNEL阳性细胞,3dTUNEL阳性细胞数最多,范围最广,以神经细胞为主;4电镜观察到ICHG血肿周围神经细胞出现凋亡细胞的形态改变。结论:ICH后血肿对周围神经组织的压迫、炎症反应、脑水肿以及细胞凋亡均为大鼠神经功能损伤的因素。     

大鼠脑出血后细胞凋亡和bcl-2表达间关系的研究

目的研究脑出血后血肿周围水肿带内细胞凋亡与bcl-2表达的关系.方法使用胶原酶法建立大鼠脑出血模型.于脑出血后6、12、24 h、3、7 d选取血肿灶周围脑组织制成冰冻切片,对切片进行相应染色:用TUNEL法观察血肿灶周围细胞凋亡,通过免疫组化和原位杂交方法分别从mRNA和蛋白的水平观察bcl-2的表达.对染色结果进行图像分析及统计学处理,分析细胞凋亡与bcl-2表达的关系.结果脑出血6 h后血肿周围出现TUNEL阳性细胞,此时bcl-2的表达降低;之后凋亡细胞数量逐渐增加,至3 d达到高峰,此时bcl-2的表达仍处于低水平;3 d至7 d凋亡细胞数量减少,而bcl-2的表达增加.结论脑出血后血肿周围存在细胞凋亡,而bcl-2的表达降低是脑出血后发生细胞凋亡的重要步骤.     

大鼠脑出血后神经元凋亡与caspase-3表达的关系

目的　研究大鼠实验性脑出血模型中神经细胞凋亡发生的规律以及与caspase 3表达的关系 ,观察caspase抑制剂zVADfmk对出血性脑损伤的保护作用。方法　应用立体定向技术 ,将自体不凝血注入大鼠尾状核区制备脑出血模型 ,将动物随机分为假手术组、出血组和zVADfmk干预组 ,分别在不同时间点断头取脑 ,连续切片作TUNEL染色和caspase 3免疫组化染色。 结果　脑出血后 6h血肿内部及周边组织出现TUNEL阳性细胞 ,72h达高峰 ,2周时仍有少量表达 ;caspase 3在脑出血后 6h表达明显增高 ,2 4h达到高峰 ,各组与假手术组之间差异显著 (P <0 .0 5 )。脑出血后的TUNEL阳性细胞与caspase 3的表达呈正相关 (r =0 .6 0 7,P <0 .0 5 ) ,且caspase 3的高峰时间早于凋亡的发生。经caspase 3抑制剂干预 ,血肿周围组织TUNEL阳性细胞明显减少 ,与对照组相比差异显著 (P <0 .0 5 )。结论　凋亡机制参与了脑出血后继发性损伤的过程 ,而caspase 3的激活在其中起着重要作用 ,通过阻断caspase的激活可以减少脑出血后神经细胞凋亡的发生     

大鼠脑出血模型血肿周围继发损害的分子生物学机制研究

通过大鼠脑出血模型血肿周围组织HSP70、NF κB、Bax和Bcl 2免疫组化研究 ,探讨脑出血血肿周围组织继发性损害的可能机制。制备大鼠脑出血模型 ,实验组分成 1h、3h、12h、2 4h、4 8h、72h及 7d 7个小组 ;生理盐水对照组分成 3h、2 4h及 72h 3个小组 ,在血肿周边区及同侧皮质区分别取脑组织行HSP70、NF κB、Bax和Bcl 2抗体免疫组织化学染色 ,采用HP10 0 0高清晰度彩色病理图像分析系统计数免疫反应阳性细胞数 ,并与生理盐水对照组进行比较。发现 :实验组的HSP70和NF κB在血肿侧术后 72h表达达高峰 (P <0 .0 1) ;血肿侧各时间点HSP70和NF κB阳性细胞数与生理盐水对照组相比差异有统计学意义 (P <0 .0 1) ;实验组Bcl 2在术后 12h表达达高峰 (P <0 .0 1) ,而Bax表达在 2 4h达高峰 (P <0 .0 1) ,二者的血肿侧阳性细胞数与生理盐水对照组相比差异有统计学意义 (P <0 .0 1)。结果提示 :脑出血后血肿周围组织HSP70、NF κB、Bcl 2和Bax蛋白发生动态变化 ,参与了血肿周围继发性损害的病理过程。     

脑出血大鼠颅内压及Bcl－2、Bax表达的变化与血肿周围水肿区细胞凋亡的关系

目的：采用基于F－P与FBG集成的微型化光纤传感系统,实时动态监测脑出血大鼠的颅内压,观察脑出血大鼠的颅内压动态变化规律;观察脑出血大鼠血肿周围水肿区细胞凋亡数量的变化及Bcl－2、Bax的表达,探讨脑出血大鼠颅内压变化与血肿周围水肿区细胞凋亡的关系。方法将43只健康的雄性成年SD大鼠,随机分为4组,分别为生理盐水对照组（A组）、生理盐水测颅内压组（B组）、脑出血模型组（C组）、脑出血测颅内压组（ D组）及1只为空白对照。处死大鼠后取大脑固定,用HE染色法观察各组大鼠大脑半球形态变化,用HE染色观察血肿周围水肿区大脑组织形态,用TUNEL法观察各组血肿周围水肿区细胞凋亡数量的变化,用免疫组织化学方法观察各组血肿周围水肿区Bcl－2、Bax的表达,用实时聚合酶链反应观察各组血肿周围水肿区Bcl－2的表达。结果 HE染色及TUNEL染色发现：大鼠脑出血后会引发细胞凋亡,并可在血肿周围水肿区明显观察到细胞凋亡,并可以持续一段时间;造模后3 d A组和C组的TUNEL阳性细胞计数及凋亡指数均与造模后1 d A组有显著差异（P＜0．05）,而造模后3 d的C组与A组差异有统计学意义（P＜0．05）,造模后7 d的C、D组与A、B组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。 B组和D组均在造模后出现颅内压升高,但差异无统计学意义（P＞0．05）,B组随后颅内压呈下降趋势,而D组的颅内压随后并没有一直下降,与B组比较差异有统计学意义（ P＜0．05）。与A组比较,B、C、D组的Bcl－2、Bax表达的IOD值差异有统计学意义（ P＜0．05）。 C、D组的Bcl－2相对表达量比A、B组要少,差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论大鼠脑出血后颅内压明显上升,并会在3～5 d里保持相对高峰趋势;大鼠脑出血后会引发细胞凋亡,并可在血肿周围水肿区明显观察到细胞凋亡,并可以持续一段时间;大鼠脑出血后颅内压高峰期与凋亡高峰期接近,提示颅内高压可能会导致神经元凋亡。     

大鼠脑出血后血肿周围组织细胞凋亡及抑肽酶的干预作用

目的探讨脑出血后血肿周围细胞凋亡的规律以及抑肽酶的干预作用。方法采用未抗凝新鲜自体股动脉血注入大鼠尾状核建立脑出血动物模型。将75只大鼠随机分成对照组、脑出血组、抑肽酶组，各实验组分6h、1d、3d、5d及7d5个时间点。分别采用TUNEL染色法观察血肿周围细胞凋亡的发生。结果脑出血后72h血肿周围组织可见大量凋亡细胞，抑肽酶干预可使凋亡细胞的数量明显下降（P〈0．01）。结论提示抑肽酶可以减轻脑出后血肿周围脑组织细胞凋亡。     

大鼠脑血肿周围Caspase-3的表达与神经细胞凋亡的关系

目的研究大鼠脑血肿周围脑组织Caspase-3的表达和神经细胞凋亡及探讨二者之间的关系。方法60只Wistar大鼠随机分为假手术组（30只）和出血组（30只）。采用大鼠自体股动脉血注入尾壳核建立脑出血模型,分别于术后6、12、24、48、96h5个时间点取脑,应用免疫组化方法检测血肿周围组织Caspase-3的表达,TUNEL法检测血肿周围神经细胞凋亡。结果出血组大鼠脑血肿周围组织Caspase-3的表达及细胞凋亡明显高于假手术组（P〈0．01）,Caspase-3的表达与血肿周围神经细胞凋亡呈正相关性（r=0．956,P〈0．05）。结论Caspase-3、神经细胞凋亡参与了大鼠脑血肿周围脑组织损伤的病理过程。     

实验性大鼠脑出血细胞凋亡与Bcl-2和Bax表达关系的研究

目的 研究大鼠脑出血（ICH）后血肿周围细胞凋亡及其与凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的变化规律和关系.方法 90只SD大鼠随机分为正常对照组（n=10）,假手术组（n=40）,ICH组（n=40）.假手术组和ICH组又依术后12h、1d、2d、3d和7d各分为5个亚组.用胶原酶配合肝素诱导大鼠脑尾状核出血,末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记法（TdT-mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL）观察不同时间点细胞凋亡的变化, SABC法观察Bcl-2和Bax蛋白在各时点表达的变化,免疫印迹（Western-blot）技术检测Bcl-2和Bax蛋白相对光密度比值,电镜观察细胞超微结构改变.结果 ①ICH组TUNEL阳性细胞12h可检测到,3d达高峰,7d仍有表达（P＜0.01）,阳性细胞主要见于血肿周围,多见神经元,有少量神经胶质细胞和血管内皮细胞;②ICH组Bcl-2和Bax蛋白免疫反应阳性细胞分别于出血2、3d达高峰,7d仍有表达,主要表达于血肿区及血肿周围、同侧及对侧皮层;多见神经元,少数为神经胶质细胞、吞噬细胞和中性粒细胞;③Western-blot 正常对照组和假手术组均可检测到Bcl-2、Bax蛋白,但相对光密度比值较小;ICH组Bcl-2相对光密度比值2d达最大值,Bax则3d达最大值,在7d仍明显高于正常对照组（P＜0.05）.结论 ICH后存在细胞凋亡;Bcl-2和Bax参与了ICH细胞凋亡;ICH组TUNEL阳性细胞7d仍可检测到,提示ICH后7d内进行抗凋亡治疗可以不同程度地阻止细胞凋亡的发生.     

银杏叶提取物对大鼠脑出血后早期血肿周围神经元凋亡的作用

目的探讨银杏叶提取物对大鼠脑出血后早期血肿周围神经元凋亡的影响。方法将36只SD大鼠随机分为正常组、出血组、术前24 h预防用药组、术后0 h治疗组、6 h治疗组和24 h治疗组,每组6只,出血组和治疗组采用尾状核注入Ⅶ胶原酶建立脑出血模型,预防用药组和各治疗组于相应时间点给予银杏叶注射液2 mL.kg-1腹腔注射,各组大鼠均于术后72 h处死。用免疫组化方法观察各组出血灶周围凋亡神经元的Bcl-2、Bax和Caspase-3的阳性细胞数量变化。结果 HE染色显示出血组大鼠尾状核部位的脑组织大量坏死,各治疗组大鼠尾壳核部位的出血坏死灶较出血组缩小,脑组织水肿减轻,其中术前24h预防用药组表现最为明显;Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白在正常组均有少量表达,脑出血后明显增加;预防用药组和各治疗组中,Bcl-2蛋白阳性细胞数较出血组明显升高（P〈0.01）,Bax与Caspase-3蛋白的阳性细胞数较出血组明显降低（P〈0.01）;预防用药组Bcl-2蛋白阳性细胞数比各术后治疗组多,Bax与Caspase-3蛋白的阳性细胞数比术后各治疗组少。结论银杏叶提取物能保护大鼠脑出血后血肿周围神经元,抑制神经元凋亡,并且早期用药效果较好。     

凝血酶对大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤的动态研究

目的　研究脑出血血液凝固释放的凝血酶对神经细胞DNA的损伤 ,探讨脑出血神经细胞损伤的机制。方法　采用立体定位技术 ,将 15U凝血酶注入大鼠右侧尾状核 ,并用凝血酶的特异抑制剂水蛭素进行干预 ,于不同时相点测定TUNEL阳性细胞及caspase 3免疫反应性 (Immunoreactivity ,IR)细胞的表达。结果　凝血酶组TUNEL阳性细胞于造模后 12h出现 ,3d达到高峰 ,1周仍有较多表达 (P <0 0 1) ;caspase 3IR 6h开始表达 ,1d达高峰 ,1周仍有少量表达。水蛭素干预组TUNEL阳性细胞较凝血酶组明显减少 (12h ,1d ,3d ,1周 ,P <0 0 1) ;caspase 3IR较凝血酶组明显降低 (6h ,12h ,1d ,3d ,P <0 0 1;1周 ,P <0 0 5 )。结论　 15U的凝血酶可导致大鼠尾状核区神经细胞DNA损伤 ,损伤持续时间 1周以上 ;凝血酶释放很可能是脑出血神经细胞凋亡的机制之一。     

HtrA2 mRNA在大鼠脑出血模型中表达的实验性研究

目的探讨HtrA2（也称作0mi）在大鼠脑出血急性期的作用及其机制。方法雌雄各半SD大鼠150只,随机分为正常组、假手术组及脑出血后3h、6h、12h、1d、3d、5d组和7d组,每组10只。在脑立体定向仪下采用自体血注入尾状核法制备脑出血模型。于相应时间点处死动物,用干湿重法测量脑含水量（BWC）;进行ICH组神经功能缺失评分;RT-PCR法检测HtrA2 mRNA表达水平。结果各组均有HtrA2 mRNA表达,但脑出血后各组手术侧表达明显增加（P〈0.05）,尤其是3d组,与脑含水量呈正相关;而脑含水量与神经功能缺失评分呈负相关。结论大鼠脑出血后HtrA2 mRNA表达增加,并与脑水肿程度呈正相关,推测HtrA2参与ICH后灶周围组织神经元凋亡的过程及ICH后灶周脑组织水肿的过程,诱导或加重了神经元的凋亡及脑水肿。     

槲皮素对脑出血大鼠神经细胞凋亡与Bcl-2、Bax蛋白表达的作用研究

目的通过观察大鼠脑出血后神经细胞凋亡与Bcl-2、Bax蛋白表达的动态变化及槲皮素的干预作用,探讨槲皮素可能的神经保护作用及机制。方法以雄性健康SD大鼠通过自体血注入法制备大鼠脑出血模型,并随机分为假手术组、脑出血模型组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组,共4组,每组30只;槲皮素低剂量组和槲皮素高剂量组分别给予槲皮素10、50 mg/(kg·d)腹腔内注射,假手术组和脑出血模型组给予同等体积生理盐水腹腔内注射,每日1次,连续7 d;各组大鼠分别在术后第6小时、1天、2天、3天、7天通过前肢放置试验评分法评估神经功能缺损,采用TUNEL法检测血肿周围神经细胞凋亡,采用Western blot法检测血肿周围Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果与模型组比较,槲皮素低剂量组在脑出血后第3天、7天及槲皮素高剂量组在第2天、3天、7天的前肢放置试验评分和Bcl-2蛋白表达均明显增加(P<0.01);与模型组比较,槲皮素低剂量组在第3天、7天及槲皮素高剂量组在第1天、2天、3天、7天的神经细胞凋亡率和Bax蛋白表达均明显降低(P<0.01)。结论槲皮素能减轻脑出血后神经功能损伤,其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,从而减少神经细胞凋亡有关。     

肌红蛋白诱导的内质网应激及细胞凋亡在挤压综合征中的机制初探

目的 建立挤压综合征急性肾损伤(AKI)小鼠模型,探究肌红蛋白诱导的肾小管上皮细胞内质网应激及细胞凋亡在挤压综合征中的致病机制。方法 体内实验:将C56BL/6小鼠随机分为对照组、模型组8 h及模型组24 h,每组6只,模型组于小鼠大腿外侧肌注50%甘油生理盐水溶液（8 μL/g）建立挤压综合征模型,对照组注入等量生理盐水。分别于注射后8、24 h麻醉处死动物,检测血清肌酐（sCr）,获取完整肾脏标本进行电镜及TUNEL染色观察凋亡,采用免疫组化、实时荧光定量PCR等检测凋亡及内质网应激相关蛋白表达。体外实验:将人近端肾小管上皮细胞随机分为对照组、干预组6 h及干预组12 h,对照组加入标准细胞培养液,干预组加入等量含马肌红蛋白的细胞培养液,分别于6、12 h后收取细胞进行流式分析检测细胞凋亡。结果 注射甘油8 h后sCr明显升高,挤压综合征模型建立成功。电镜示与对照组相比,模型组肾小管上皮细胞内质网、线粒体等细胞器肿胀较明显。TUNEL染色提示模型组肾组织凋亡细胞百分比高于对照（P<0.05)。免疫组化染色和实时荧光定量PCR示模型组肾组织凋亡标志蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）3及内质网应激标志蛋白CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、caspase12表达高于对照组（P<0.05）。细胞流式分析提示马肌红蛋白干预组细胞凋亡比例较对照组升高（P<0.05）。结论 内质网应激及凋亡参与了挤压综合征导致AKI的发病机制,肌红蛋白可能是诱导细胞凋亡的重要因素。     

EPO对大鼠脑缺血再灌注后脑水肿及MMP-9的影响

目的观察促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损评分、脑水肿及MMP-9影响。方法将健康SD大鼠150只分为假手术组、缺血组及EPO组,线栓法复制大鼠左侧大脑中动脉缺血再灌注模型,缺血2 h后,缺血组于再灌注开始前10 min经腹腔注入生理盐水2 ml,EPO组注射重组人红细胞生成素(3 000 U/kg)+生理盐水2 ml,再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d及10 d,采用Zea Longa法测定大鼠神经功能缺损评分后,断头取脑,按Elliot公式计算脑组织含水量,免疫组织化学法测定相应时间点MMP-9免疫阳性细胞数。结果缺血组再灌注6 h出现神经功能障碍,48h最严重,72 h开始恢复;缺血组脑含水量在再灌注6 h轻度升高,24-48 h时达高峰;缺血组再灌注6 h有少量表达MMP-9的免疫阳性细胞,12 h开始增多,48 h达到高峰,72 h后有所下降,7 d、10 d明显降低。EPO治疗组与缺血组相比,神经功能缺损评分降低、脑含水量和MMP-9免疫阳性细胞数明显减少(P<0.05)。结论 EPO对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定保护作用,其作用机制可能与降低MMP-9表达有关。     

脑出血后氧化应激对神经细胞凋亡及c-myc蛋白表达的影响

目的 观察脑出血后氧化应激与神经细胞凋亡的相关性及对凋亡相关蛋白c-myc表达的影响。 方法 选择SD雄性大鼠84只,随机分为假手术组、模型组、MPEG-SOD组,每组28只,自体血注入法建立脑出血模型,MPEG-SOD组建模前腹腔注射MPEG-SOD;术后12 h、1 d、3 d、7 d不同时间点行神经功能缺陷评分(NDS),取脑组织测定脑组织含水量,分光光度法测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD),免疫组化法测定核因子κB(NF-κB) p65阳性细胞表达,TUNEL测定神经细胞凋亡,Western blot测定c-myc蛋白表达水平。 结果 与假手术组比较,模型组各时点NDS评分、SOD活性明显降低,脑组织含水量、MDA含量、c-myc蛋白、NF-κB p65、TUNEL阳性细胞表达明显升高(P<0.05),术后3 d达峰值,与模型组同时点比较,MPEG-SOD组NDS评分、SOD活性明显升高,脑组织含水量、MDA含量、c-myc蛋白、NF-κB p65、TUNEL阳性细胞表达明显降低(P<0.05),c-myc蛋白表达与TUNEL阳性细胞数呈正相关(模型组r=0.83,MPEG-SOD组r=0.91,P<0.05)。 结论 脑出血后氧化应激诱导神经细胞凋亡可能与启动凋亡相关基因c-myc有关。      

大鼠脑出血蛋白激酶C与细胞凋亡关系的实验研究

目的：研究大鼠脑出血后血肿周围蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）及神经细胞凋亡的表达及其多黏菌素B（polymyxin B PMB）对上述表达的影响。方法：将100只SD大鼠随机分为四组：假手术组、脑出血组、小剂量多黏菌素B干预组（0.4mg/kg.d）、大剂量多黏菌素B干预组（0.8mg/kg.d）,立体定位仪定位注射自体不凝血制造大鼠脑出血模型,分别为术后6h、12h、24h、72h、120h处死,免疫组织化学法检测血肿周围区PKC、TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）数的表达、TNF-α（肿瘤坏死因子-α）含量、NO（一氧化氮）含量以及大小剂量PMB对其干预后的影响。结果：假手术组PKC少量表达,偶见凋亡细胞;脑出血组自6h起PKC、凋亡细胞及TNF-α、NO含量大量增加,72h达高峰,PKC在120h基本降至假手术组,但凋亡细胞TNF-α、NO含量仍处于较高水平,与假手术组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;大小剂量多黏菌素B干预组均有明显抑制PKC、凋亡细胞、TNF-α含量的表达,有统计学意义（P〈0.01）;但PMB剂量的大小无明显差异性（P〉0.05）。结论：脑出血后血肿周围存在大量PKC表达上调、神经细胞凋亡、TNF-α、NO含量增加,PMB能够明显抑制PKC激活,TNF-α、NO释放,减少血肿周围细胞凋亡,起到神经元保护作用。