蛋白质组学研究技术的现状及进展

蛋白质组学研究的核心技术是蛋白质成分的分离和鉴定。通过鉴定蛋白质组结构、功能及其各蛋白质间的相互作用关系，最终实现蛋白质组表达模式和功能模式的研究，其表达模式的鉴定技术主要有以质谱为核心的技术、蛋白质微测序和氨基酸组成分析等。现综述如下。     

应用肝组织蛋白质组模式诊断乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌的初步研究

目的获得能早期诊断乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(HCC)的癌组织蛋白质组模式。方法应用双向凝胶电泳(2 DE)技术获得癌组织和非癌组织蛋白质表达谱。先对14例癌组织和非癌组织蛋白质表达谱进行分析，在癌组织蛋白质表达谱中发现具有鉴别癌组织和非癌组织的蛋白质组模式，再应用该模式对48例未知的癌组织和非痛组织2-DE图谱进行检测。结果未知的癌组织与非癌组织均得到准确鉴定，灵敏度和特异性均为100％。结论对蛋白质组模式中的蛋白质点进一步分析有助于研究HBV相关性HCC的肿瘤标记。蛋白质组模式技术亦有望成为在高危人群和普通人群中对恶性肿瘤进行筛查的工具。     

应用肝组织蛋白质组模式诊断乙型肝炎病毒相关性肝纤维化的初步研究

目的获得早期诊断乙型肝炎病毒(HBV)相关肝纤维化的肝组织蛋白质组模式。方法采用双向凝胶电泳(2-DE)技术和计算机辅助的图像分析方法获得肝纤维化组织和正常肝组织的蛋白质表达谱。先对6例肝纤维化组织和正常肝组织蛋白质表达谱进行分析,在肝纤维化组织蛋白质表达谱中发现具有鉴别肝纤维化组织与正常肝组织的蛋白质组模式,再应用该模式对14例未知的肝纤维化组织和正常肝组织2-DE图谱进行检测分析。结果未知的肝纤维化组织与正常肝组织均得到准确鉴定,灵敏度和特异均为100%。结论HBV相关肝纤维化组织的蛋白质表达模式能准确判断肝纤维化,对该模式中的蛋白质点进一步分析有助于研究HBV相关肝纤维化的诊断标记。     

肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的比较

目的 比较肝癌发生不同病理阶段血清蛋白质组的表达变化情况,从中寻找特异性标志物.方法 用双向凝胶电泳分离正常人,慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清蛋白质,结合质谱技术对差异点进行鉴定; Western blot检测结合珠蛋白β链以验证蛋白质水平的表达.计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析和LSD检验进行两两比较.结果 4组血清的双向电泳图谱经软件匹配分析,并与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱相结合,成功鉴定出结合珠蛋白,SAA1、SP40等30个差异蛋白质点,K cluster聚类分析不同的变化模式.在差异蛋白质点中,7个蛋白质点均为结合珠蛋白,呈现由正常→肝炎→肝硬化持续下调、到肝癌又上调的模式.Western blot证实结合珠蛋白β链的表达与双向电泳表达相一致.结论 在肝癌发生的动态过程中各疾病阶段的血清蛋白质差异表达有4种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据,与肝癌发生发展相关的结合珠蛋白很可能是肝硬化发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物.     

河流漫游球菌蛋白质组鉴定及功能初探

目的 基于高精度串联质谱技术的蛋白质组方法,对河流漫游球菌的蛋白质组组分进行全面鉴定,并对其生物学功能开展探讨。方法 通过分离临床骨科患者深部组织穿刺液获得并鉴定得到一株河流漫游球菌,采用液相色谱-串联质谱系统开展无标定量蛋白质组实验,对河流漫游球菌进行蛋白质组组分鉴定,将分析所得的数据通过MaxQuant软件进行数据库检索完成蛋白质的鉴定和相对定量,并对鉴定出的蛋白质从生物学途径、分子功能和细胞组分,以及KEGG通路多个方面进行分类和注释分析。结果 通过3次质谱重复实验,共鉴定得到河流漫游球菌的1 372个蛋白质;通过功能注释分析发现大部分蛋白质主要参与维持细菌生存的转录翻译、代谢以及物质的生物合成等生物过程。结论 河流漫游球菌蛋白质丰度排名前10的主要为酶和核糖体蛋白,其中高富集蛋白质烯醇化酶、磷酸甘油酸激酶为参与糖酵解功能的关键酶,并有可能与河流漫游球菌毒性密切相关。本研究构建的河流漫游球菌蛋白质组表达谱数据集为临床河流漫游球菌的诊断与治疗提供了新的蛋白质组实验数据参考。     

糖尿病肾病患者血浆动态蛋白质组学研究

目的探讨糖尿病肾病（DN）患者血浆差异蛋白表达情况,为寻找DN敏感血浆蛋白标志物提供依据。方法 4例确诊的DN患者（DN组）和4例健康人群（对照组）作为研究对象,应用荧光差异双向凝胶电泳分析两组血浆蛋白质组差异表达,以上调或下调1.5倍为截断值筛选出差异表达的蛋白质斑点进行质谱分析。结果成功构建DN患者血浆蛋白差异表达双向凝胶电泳图谱,并分析鉴定出6种差异表达蛋白;通过质谱分析和蛋白质数据库（UniProtKB/Swiss-Prot）比对鉴定出6种蛋白质,分别为补体C3、C4、凝溶胶蛋白前体、纤维蛋白原γ、载脂蛋白E和细胞骨架蛋白16。结论荧光差异双向凝胶电泳可鉴定筛选出DN患者与正常人群差异表达的血浆蛋白质,并为进一步筛选DN血浆蛋白标志物提供依据。     

RAW264.7细胞泡沫化前后差异蛋白质组分析

目的 应用凝胶内差异显示电泳技术和质谱技术研究小鼠巨噬细胞RAW264.7泡沫化前后蛋白质组的差异.方法 体外培养RAW264.7细胞,用氧化型低密度脂蛋白作用使其转变为泡沫细胞.分别提取RAW264.7细胞泡沫化前后的细胞总蛋白,用荧光染料Cy3或Cy5进行标记,与Cy2标记的内标等量混合后在同一胶中进行电泳分离,经不同光激发后扫描得到不同样品的蛋白质组图谱.采用DeCyder 6.5软件进行差异蛋白质组分析,筛选出12个差异蛋白质.经质谱鉴定和分析,其中10个蛋白质得到鉴定.结果 RAW264.7细胞泡沫化后,应激蛋白70、二硫键并构酶、细胞质肌动蛋白和一种未命名的蛋白质表达量降低,而葡萄糖调节蛋白、烯醇酶、Enol蛋白、Peroxiredoxin4、Stathmin 1和BID蛋白表达量上升.结论 本研究建立了巨噬细胞泡沫化前后蛋白质组图谱,并成功进行差异蛋白质组分析,从蛋白质组水平增加了对细胞泡沫化的机制认识,为细胞泡沫化形成动脉粥样斑块的干预研究提供新思路和新靶点.     

蛋白质组学技术及其在寄生虫学研究中的应用

该文介绍了蛋白质组学研究的核心技术,即蛋白质组分分离、鉴定,利用蛋白质组信息学进行结构和功能预测,以及蛋白质组学技术在寄生虫学研究中的应用和前景。     

蛋白质组技术在研究肺癌发病机制中的作用

蛋白质组是在一种细胞内存在的全部蛋白质，功能蛋白质组指细胞内与某个功能有关或在某种条件下的一群蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域，它从整体水平研究细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，解释蛋白质功能与细胞生命活动的规律。蛋白质组技术的应用为研究肺癌的发生、发展机制提供了新的手段。     

核苷二磷酸激酶等蛋白在人胰腺癌与癌旁组织中的差异表达

目的 应用比较蛋白质组学方法研究人胰腺导管腺癌组织和癌帝组织之间差异的蛋白质.方法利用双向凝胶电泳(2-DE)对8例胰腺导管腺癌组织和癌旁组织的总蛋白进行分离,两组间差异蛋白质点用质谱和数据库检索鉴定利用蛋白质印迹分析和免疫组织化学法检测差异蛋白在胰腺癌和癌旁组织的表达.结果 鉴定出30个差异表达蛋白,包括亲环素A、过氧化氧化还原蛋白1、14-3-3 sigma、Annexin Ⅱ、热休克蛋白27、核苷二磷酸激酶(NDPD)等.差异表达蛋白NDPK在35例胰腺癌组织表达率为77.1%,而配对癌旁组织为28.6%.结论 2-DE为基础的蛋白质学技术是研究肿瘤的一种重要手段.NDPK等差异表达蛋白可能是潜在的胰腺癌诊断标记物.     

活化大鼠肝星状细胞的蛋白质表达谱

目的 用在线二维纳升高效液相结合串联质谱(2D nanoLC-MS/MS)技术分析体外培养大鼠原代肝星状细胞(HSC)的蛋白质表达谱. 方法 分离培养大鼠原代HSC,取体外培养第10天自动活化的大鼠HSC总蛋白质,通过2D nanoLC-MS/MS对酶解所获肽段进行分离和鉴定,并对鉴定的蛋白质进行细胞定位和功能分类. 结果从50μg HSC总蛋白质中鉴定出1014种蛋白质,相对分子质量范围为7832～588 364;主要分布于细胞核、细胞骨架、线粒体、内质网,分别占25%,17%、13%、13%.蛋白质功能主要与核酸代谢,细胞器组装、信号传导、能量代谢等生理进程有关,分别占17%、14%,10%、9%;其中细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白,波形蛋白和结蛋白是活化大鼠HSC特异性表达的蛋白质.结论 本研究获得了目前较为全面的活化大鼠原代HSC的蛋白质表达谱,为深入研究HSC的活化机制奠定了基础.     

刀豆蛋白A诱导小鼠肝损伤模型的血清蛋白质差异分析

目的 研究刀豆蛋白(Con)A诱导小鼠肝损伤模型血清中蛋白质的变化,分析特异蛋白质与疾病进展的关系.方法 25只小鼠分为空白对照组,PBS对照组,ConA诱导肝损伤模型1、3、6 h组,取血清,运用ProteoExtract~(TM)白蛋白去除试剂盒纯化小鼠血清,去除白蛋白,利用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定差异性表达蛋白质.结果 通过对各组双向凝胶电泳图像的比较分析发现,ConA诱导肝损伤模型6 h组有2种明显差异表达的蛋白质.经质谱鉴定,这2种蛋白质分别为血清淀粉样蛋白酶A2前体蛋白和血清淀粉样蛋白酶A1前体蛋白.结论 在ConA诱导小鼠肝损伤模型6 h时,发现血清淀粉样蛋白酶A2前体蛋白和血清淀粉样蛋白酶A1前体蛋白,可能与疾病进展有关.     

血清蛋白质组学在肝细胞癌的应用进展

蛋白质组学是以基因组编码全部蛋白质为研究对象,采用高分辨率的蛋白质分离手段,结合高通量的蛋白质鉴定技术,全面研究在特定情况下蛋白质表达谱,从细胞水平和整体水平研究蛋白质的组成及其变化规律,深入认识机体的各种生理和病理过程,因而具有发掘和寻找潜在肿瘤标志物的能力,     

乙型肝炎病毒基因调控的小鼠肝细胞质膜蛋白质变化

目的 通过对转HBV全基因小鼠肝细胞质膜蛋白质组的分析,研究病毒基因对宿主肝细胞质膜蛋白质表达的影响,探讨HBV感染机制. 方法 以HBV转基因C57小鼠和正常鼠肝为材料,通过蔗糖密度梯度离心结合抗体亲和法纯化肝细胞质膜.用Western blot法验证质膜的纯度和转基因鼠肝细胞质膜中HBV外膜蛋白质的表达.对纯化的质膜组分进行差异蛋白质组学分析. 结果 亲和纯化法较密度梯度离心法能进一步富集质膜近3倍,线粒体的污染减少近2倍;HBV外膜蛋白质只在转基因鼠肝细胞质膜中表达.蛋白质双向电泳分离得到500多个蛋白质点,分析得到26个具有2倍以上差异的蛋白质点,准确鉴定出7个蛋白质.结论 获得了好的质膜纯化方法;HBV基因调节了小鼠肝细胞质膜蛋白质的表达,鉴定得到了与HBV病毒感染相关蛋白质,为进一步探讨HBV感染机制打下了基础.     

肝癌及癌旁肝组织的高尔基体差异蛋白质分析

目的 筛选并鉴定肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组中差异表达的蛋白质,从高尔基体层面解释肝癌的发生和发展机制,为早期诊断和抗癌药物的研发提供线索.方法 应用亚细胞比较蛋白质组学研究方法,比较分析肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组.收集肝癌患者手术切除的癌组织和癌旁肝组织标本,蔗糖密度梯度离心法分离高尔基体.建立并优化两种组织高尔基体的双向电泳方法,用PD-Quest软件分析差异表达的蛋白质点,然后用质谱仪获取相应蛋白点的肽质指纹图谱,联网到Swiss-Prot蛋白质组数据库鉴定获得的差异蛋白质点,最后用Western blot验证双向电泳结果.蛋白质相对表达量的比较采用配对t检验.结果 获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱.与癌旁肝组织相比,肝癌高尔基体蛋白质组有包括膜联蛋白5在内的27个蛋白质位点表达上调,包括染色体修饰蛋白2b在内的20个蛋白质位点表达下调,初步鉴定出了其中17个蛋白质,并用Western blot从蛋白质水平上验证了双向凝胶电泳结果.结论 肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组具有不同的蛋白质位点,这些差异表达的蛋白质涉及到细胞的能量代谢、肿瘤的侵袭和转移,细胞周期调控等方面,为进一步阐释高尔基体在肿瘤的发生和发展中所起的作用提供了有价值的信息.     

人小脑与额叶的比较蛋白质组学分析

目的对小脑及额叶进行比较蛋白质组学研究以探讨其对变性损伤敏感性不同的原因。方法死亡24h内新鲜取材尸检小脑及额叶组织,经提取蛋白质,以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳(2DE),图像分析软件分析电泳图谱,MALDI TOF质谱或MALDI TOF/TOF串联质谱鉴定蛋白质。结果发现3个蛋白质点在小脑表达量增加,7个蛋白质点在额叶表达量增加。以质谱鉴定了3个小脑中表达量增加的蛋白质点分别为抗氧化蛋白2、肌酸激酶前体(线粒体)和果糖二磷酸醛缩酶C,2个在额叶增加的蛋白质点为胶质纤维酸性蛋白、丙酮酸激酶。30个表达量在额叶及小脑没有显著变化的蛋白质点通过MALDI TOFMS/TOFTOF MSMS和蛋白质数据库检索得到鉴定。结论本研究结果进一步丰富了人脑蛋白质组数据库。额叶与小脑的差异表达蛋白质为深入理解脑老化及变性痴呆分子机制提供了有益的线索。     

四氯化碳肝纤维化大鼠肝组织差异蛋白质组的动态变化

目的 探索肝纤维化形成过程中肝组织蛋白质组的变化,部分解析肝纤维化发生、发展的病理生理机制. 方法 采用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型,应用双向凝胶电泳技术分离大鼠肝组织总蛋白质,经考马斯亮蓝染色、图像分析、识别差异表达的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱及数据库查询鉴定差异蛋白质点.采用Western blot、免疫组织化学方法对细胞角蛋白(CK)8、CK18进行蛋白质表达水平的验证.计量资料采用单因素方差分析中的LSD法或非参数检验中的H检验进行统计学分析. 结果 大鼠造模后,随时间的推移,肝纤维化评分逐渐增加(3周组＜6周组＜9周组),建立了正常大鼠和大鼠CCl4肝纤维化形成过程3、6、9周肝组织双向凝胶电泳图谱,质谱鉴定了44种差异蛋白质;采用Western blot、免疫组织化学方法对CK8、CK18的验证结果与双向凝胶电泳结果基本一致.正常组及3、6、9周模型组CK8/CK18蛋白相对表达量分别为:0.113±0.005/0.170±0.030、0.473±0.046/0.530±0.070、0.682±0.087/0.780±0.080、0.837±0.096/1.390±0.130,各组间差异均有统计学意义(F值分别为196.085/74.088、13.870/16.115、75.800/75.900,P值均＜0.01). 结论 CCl4大鼠肝纤维化形成与发展过程中差异表达蛋白质的功能主要涉及细胞生长、发育与分化,细胞增殖与凋亡,血管新生或重构,氧化应激,物质代谢及转运,信号转导等.     

脾虚小鼠小肠上皮细胞蛋白质组特征及白参的干预作用研究

[目的]研究脾虚型小鼠小肠上皮细胞蛋白质组特征及白参的调节作用.[方法]昆明种小鼠60只,利血平法复制动物模型,随机分为正常、脾虚模型和白参汤剂组,双向凝胶电泳技术分离蛋白质,改进的考染法染色,以PDQuest软件分析图谱,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行质谱分析.[结果]鉴定出的33个蛋白质点中有27个表达明显减弱,6个表达增强.经白参汤剂治疗后,其表达多数得以回调.各蛋白质的功能类型几乎涉及小肠细胞各主要功能.[结论]脾虚型小鼠小肠上皮细胞的蛋白质组特征主要表现为蛋白质表达呈双向变化,以下调为主.表达变化的蛋白质涉及细胞各部位,白参汤剂对小肠上皮细胞蛋白质组的调节作用是白参健脾的重要机制之一.     

HBV相关性肝细胞癌肝组织蛋白质组差异的初步分析

目的分析HBV相关性肝细胞癌蛋白质组与癌周组织（肝硬化组织、慢性肝炎组织）蛋白质组之间的差异，鉴定其中的差异蛋白质点。方法应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，对18例肝细胞癌组织与12例肝硬化组织、6例慢性肝炎组织的蛋白质组表达谱进行差异分析，应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行了鉴定。结果肝细胞癌组织与癌周组织的对比中，共发现有表达水平存在显著差异的47个蛋白质点，17个差异蛋白质点得到了初步鉴定，其中8个蛋白质点在既往文献中未曾报道其与肝细胞癌变相关。结论慢性肝炎基础上发生的癌变与肝硬化基础上发生的癌变，其癌变机制存在差别。本实验研究中初步鉴定的差异蛋白质，可能有助于HBV相关性肝细胞癌的癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。     

核苷二磷酸激酶等蛋白在人胰腺癌与癌旁组织中的差异表达

目的应用比较蛋白质组学方法研究人胰腺导管腺癌组织和癌旁组织之间差异表达的蛋白质。方法利用双向凝胶电泳（2-DE）对8例胰腺导管腺癌组织和癌旁组织的总蛋白进行分离，两组间差异蛋白质点用质谱和数据库检索鉴定。利用蛋白质印迹分析和免疫组织化学法检测差异蛋白在胰腺癌和癌旁组织的表达。结果鉴定出30个差异表达蛋白，包括亲环素A、过氧化氧化还原蛋白1、14-3-3sigma、AnnexinII、热休克蛋白27、核苷二磷酸激酶（NDPK）等。差异表达蛋白NDPK在35例胰腺癌组织表达率为77．1％，而配对癌旁组织为28．6％。结论2-DE为基础的蛋白质组学技术是研究肿瘤的一种重要手段。NDPK等差异表达蛋白可能是潜在的胰腺癌诊断标记物。