寻常型银屑病（湿热证）的血清蛋白组学表达研究

【目的】应用同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ技术）对寻常型银屑病（湿热证）患者的血清蛋白进行定量分析,探求其与正常人的差异性表达蛋白质,从蛋白组学角度揭示湿热证的部分内涵。【方法】取寻常型银屑病（湿热证）患者（15例）及正常人（10例）血清,予纯化、去丰度等处理后,十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离,经iTRAQ特异性标记酶解后的肽段,采用串联质谱分析鉴定其差异蛋白。【结果】共鉴定出787个蛋白质组,具有生物信息学分析（gene ontology , GO）功能注释的蛋白质共有718个;与正常人比较发现了651个显著性差异蛋白（P<0.05）,其中有强显著性差异的蛋白418个（P<0.01）。【结论】寻常型银屑病（湿热证）患者血清中存在与正常人有差异性表达蛋白,但哪种蛋白在辨别寻常型银屑病“湿热证”中处于关键地位,以及湿热症状与蛋白之间的关系等,还有待进一步研究。     

常见妇科肿瘤患者血清中唾液酸化糖蛋白标志物的筛选分析

建立一个用于血清中唾液酸化蛋白通量化分析的策略,首先去除血清中高丰度的白蛋白和IgG蛋白,然后用黑接骨木凝集素(SNA)选择性地富集血清中的唾液酸化糖蛋白,通过同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)并结合纳升级液相色谱和串联质谱技术对蛋白进行分离鉴定.并将其应用于常见妇科肿瘤标志物的研究,共鉴定到169个糖蛋白,与健康对照组相比,乳腺癌病例组共鉴定到11个差异表达蛋白,宫颈癌病例组共鉴定到8个差异表达蛋白,卵巢癌病例组共鉴定到19个差异蛋白.     

应用iTRAQ技术对支原体肺炎患儿血清差异蛋白的定量分析

【摘要】 目的 应用同位素相对标记与绝对定量技术（iTRAQ）分析支原体肺炎患儿血清蛋白,筛选出差异蛋白并行其功能分析。方法 采用强阳离子交换色谱分析法对8种不同同位素标记的iTRAQ和液相色谱法以及串联质谱分析支原体肺炎组（MPP组）和健康对照组血清蛋白并通过Mascot软件分析和GO分析表达差异的蛋白。 结果 与对照组相比,MPP组中共鉴定出有定量信息的蛋白质66个,包括52个上调蛋白和14个下调蛋白。生物信息学分析显示差异表达的蛋白主要参与急性期反应、急性炎症反应、氧气输送、空气运输、过氧化氢分解过程、细胞氧化解毒、凝血、及细胞解毒等过程,这些表达差异的蛋白中选择6个显著表达差异作为候选蛋白,分别是上调蛋白SAA、CRP、HBB、APOM和下调蛋白APOC3、GPX3。 结论 本研究发现这6种蛋白在小儿支原体肺炎过程中发挥重要作用,可能作为该病潜在的临床筛查生物标志物。     

应用液体芯片-质谱技术筛选肺鳞癌患者血清标志蛋白

目的 探讨液体芯片-质谱技术(CLINPROT系统)在肺鳞癌患者血清标志蛋白筛选中的应用.方法 应用CLINPROT系统检测34例肺鳞癌患者(肺鳞癌组)、46例良性肺疾病患者(良性对照组)及44名正常人(正常对照组)的血清蛋白表达谱,应用FlexAnalysis 3.0软件进行数据分析,筛选差异表达蛋白质;采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术鉴定标志蛋白.结果 分别比较肺鳞癌组与正常对照组以及肺鳞癌组与良性对照组血清蛋白表达谱,在质荷比(M/Z)800～10 000范围内,前者筛选出96个差异表达蛋白峰,其中M/Z为4054.13和4267.46的蛋白峰在2组间差异最大,用这2种差异蛋白建立的坐标系具有良好的区分肺鳞癌与正常人的能力;后者筛选出99个差异表达蛋白峰,其中M/Z为5065.27和4054.02的蛋白峰在2组间差异最大,用这2种差异蛋白建立的坐标系具有良好的区分肺鳞癌与良性肺疾病的能力.取M/Z为1778和1865的蛋白行LC-MS/MS鉴定,结果提示二者可能均为补体C3片段或C3前体.结论 肺鳞癌患者与正常人以及与良性肺疾病患者之间血清蛋白表达谱存在明显差异,应用液体芯片-质谱技术可能从血清中筛选出敏感性高、特异性强的肺鳞癌标志蛋白.     

人结肠癌与结肠腺瘤的定量蛋白质组学研究

目的 研究结肠癌（CC）与结肠腺瘤性息肉（CAP）组织差异定量表达蛋白质谱.方法 激光捕获显微切割（LCM）技术分别获取结肠癌及结肠腺瘤性息肉组织上皮细胞,应用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）及纳米液相色谱-串联质谱（NanoLC-MS/MS）技术分离鉴定CC和CAP的差异表达蛋白质,并用生物信息学方法对差异蛋白质在结肠癌变过程中的生物学意义进行分析.结果 共鉴定266个差异蛋白质,其中103个蛋白质在CC上调,163个蛋白质下调,这些差异蛋白质涉及细胞代谢,免疫,运输,发育,细胞黏附,细胞周期,凋亡等过程.结论 上述差异蛋白质的鉴定为结肠癌癌变机制的研究及分子标志物确定提供了有益的科学依据.     

人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析

目的分析人胚胎生殖细胞（hEGC）向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法组织块培养法体外培养hEGC,采用抗坏血酸诱导hEGC向心肌细胞分化,通过免疫荧光法检测诱导后细胞中肌钙蛋白T（cT-nT）的表达;分别提取hEGC及诱导分化2周后的细胞总蛋白,采用iTRAQ标记、液相色谱（LC）分离总蛋白,串联质谱（MS/MS）鉴定差异蛋白。结果诱导后细胞阳性表达cTnT;通过质谱分析和数据库搜索共鉴定出349种蛋白,其中27种蛋白差异显著。结论 hEGC能诱导分化为心肌细胞;蛋白质组学方法可以高通量筛选hEGC向心肌细胞分化相关的重要蛋白。     

应用iTRAQ技术筛选DNT与低级别胶质瘤差异表达蛋白

目的 应用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术(iTRAQ)联合液相串联质谱筛选胚胎发育不良性神经上皮肿瘤与低级别胶质瘤的差异表达蛋白。 方法 收集胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(编号113)与低级别胶质瘤(编号114)各6例实体组织冻存新鲜标本,各组标本混合,通过蛋白质提取,蛋白质浓度测量(采用Bradford定量),聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质酶解,iTRAQ标记,SCX分离,再进行基于QE的液质联用分析,得到信息数据。使用蛋白质鉴定软件Mascot 2.3.02,选择UniProt-Human数据库,然后进行数据库搜索和生物信息学分析。依据蛋白质丰度水平,当差异倍数达到1.3倍以上,且经统计检验其P＜0.05时,视为差异蛋白。 结果 鉴定出了中国大陆黄种人DNT相对于低级别胶质瘤的差异蛋白质88个,其中上调蛋白质44个,下调蛋白质44个。这些差异蛋白具有不同生物学活性,并参与多种代谢及信号通路。其中重要的蛋白有水通道膜内在蛋白1、丝氨酸／苏氨酸激酶、细胞内氯离子通道蛋白1、膜联蛋白A1、谷氨酰胺合成酶、硫酸软骨素多糖蛋白4、S100A9、S100A16、S100A13、异柠檬酸脱氢酶等。 结论 iTRAQ技术实用可靠,有效筛选出胚胎发育不良性神经上皮肿瘤与低级别胶质瘤的差异表达蛋白。      

小鼠细胞差异表达蛋白SWATH定量方法的建立

<正>在生物学和临床医学研究中,基于质谱的蛋白质组学研究方法已成为一种强有力的工具~([1-2]),目前,比较主流的蛋白质组学研究方案是使用液相色谱-串联质谱联用系统(liquid chromatograph with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS),一次实验可鉴定到上万种蛋白质。在发现蛋白组学研究领域,稳定同位素标记和无标记相对定量的方法已被广泛用于差异蛋白表达谱研究~([3-4]),特别在最近一段时期,由于高分辨定量蛋白质组     

基于iTRAQ技术探索刮痧干预腰椎间盘突出症的生物学基础

目的应用绝对定量同位素标记(iTRAQ)结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术分析刮痧干预后腰椎间盘突出症模型大鼠背根神经节的蛋白质变化,探究刮痧治疗作用的生物学基础。方法将18只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和刮痧组,每组6只。刮痧组大鼠造模后第5天行刮痧干预,隔日1次,共刮9次。应用iTRAQ结合LC-MS/MS技术对大鼠背根神经节行蛋白质组学分析,采用UniProtKB/Swiss-Prot等数据库对差异蛋白行生物信息学分析。结果共鉴定出106个差异蛋白,其中41个蛋白表达上调,65个蛋白表达下调。分析获得富集度最高的5个典型信号通路和1个信号网络。结论刮痧可以通过减少氧化及炎症损伤、保护神经组织、抑制椎间盘退化等环节治疗腰椎间盘突出症。     

非酒精性脂肪性肝病患者的肝组织差异蛋白的定量分析:基于iTRAQ技术

目的 应用蛋白质组学在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝脏组织中筛选差异蛋白,寻找关键的作用靶点。方法 收集符合纳入标准的肝脏组织,通过 HE 染色病理切片筛选出非酒精性脂肪性肝炎样本（NASH组）3例和正常对照样本3例。提取NASH组及正常对照组的肝脏蛋白,使用iTRAQ试剂对多肽进行标记进行液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）检测,用蛋白质鉴定软件Mascot2.3.02比对UniProt蛋白数据库搜索鉴定,应用GO数据库对差异表达蛋白质进行注释和富集,应用KEGG数据库进行差异蛋白质涉及信号通路富集。实时荧光定量PCR（qPCR）检测显著差异表达蛋白对应的mRNA表达水平。结果 NASH组和对照组相比,以差异倍数（>1.2或<0.8）且P<0.05为阈值质谱分析鉴定到648个显著差异蛋白,其中表达量上调的蛋白有246种,下调的蛋白有402种。GO功能富集分析结果显示,差异表达蛋白主要参与小分子代谢、有机酸代谢、含氧酸代谢等生物学过程,在代谢途径、补体凝血级联、核糖体等KEGG通路上富集。荧光定量PCR对差异倍数（>2.0或<0.5）且P<0.05的25个显著差异表达蛋白进行筛选,共有6个蛋白与蛋白组学的结果趋势一致,包括5个下调蛋白：Jumonji 蛋白（JARID2）、莱伯西林样蛋白（LCA5L）、突触素1（SYN1）及胶原α-1（XIII）链（COL13A1）、FYVE,RhoGEF和PH结构域蛋白5（FGD5）,以及1个上调蛋白：谷胱甘肽S-转移酶Mu 4（GSTM4）。结论 iTRAQ技术和生物信息学方法在NASH肝脏组织筛选出差异表达蛋白648个,其中JARID2、SYN1、COL13A1、FGD5、GSTM4可能是NASH的关键靶向蛋白。     

基于iTRAQ标记结合生物信息学技术的风湿性疾病湿热证血清蛋白组学研究

目的 应用iTRAQ标记结合生物信息学分析技术,开展风湿性疾病湿热证的血清蛋白组学研究。方法 对强直性脊柱炎湿热证、痛风湿热证、正常对照共3组各20例血清,进行iTRAQ标记结合液相串联质谱蛋白组学分析,应用DAVID、UniProtKB/Swiss-Prot、IPA等网络数据库平台对风湿性疾病湿热证的差异蛋白进行生物信息学分析,并对显著差异蛋白进行验证。结果 获得15个湿热证差异蛋白,其中表达上调的蛋白12种,下调蛋白3种。通过分析得到差异表达蛋白所涉及的5个最有意义的典型生物信号通路。这些差异蛋白功能及生物信息学分析提示与疾病急性期反应和疾病活动度有关。验证实验结果与iTRAQ检测结果一致。结论 为风湿性疾病湿热证的分子机制以及候选诊断治疗标志物的进一步研究提供了依据。      

胃癌差异表达蛋白的蛋白质组学分析

目的筛选与鉴定胃癌差异表达蛋白质分子。方法采用定量蛋白组学方法,通过同位素i TRAQ标记胃癌与正常胃黏膜组织总蛋白,然后用强阳离子交换/反相液相色谱(SCX/nano HPLC)进行电喷雾串联质谱分析(ESI-MS/MS),获得两组样本的多肽及相对丰度信息,通过数据库搜索与比对,鉴定差异表达蛋白质。结果共鉴定出319个蛋白质,其中表达差异在2倍以上的88个,在胃癌中呈高表达的12个、呈低表达的76个。按蛋白质功能分为七大类:细胞骨架蛋白、分子伴侣、信号传导、生物代谢、凋亡,蛋白质合成与代谢类及其他蛋白质。结论成功筛选了胃癌差异表达蛋白质分子,这些蛋白质的表达改变,可能参与了胃癌的发生和发展。     

应用同位素标记相对和绝对定量技术筛选白厚苔和黄厚苔乳腺癌患者唾液差异表达蛋白

目的：筛选乳腺癌白苔和黄苔患者与健康对照组之间的唾液差异表达蛋白,以寻找乳腺癌早期诊断的生物标记物,探索中医舌苔形成的机制。方法：纳入具有典型的白厚苔或黄厚苔的乳腺癌患者以及薄白苔健康人各10例。采集唾液提取蛋白,然后进行蛋白变性、还原及酶解,最后进行同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags forrelative and absolute quantitation,i TRAQ）标记和液相色谱串联质谱联用技术鉴定,得到的峰图用Data Analysis4.0,Mascott2.2软件和Scaffold软件分析,得出表达量差异结果。鉴定蛋白的组间比值〉1.5或〈0.6被认为存在表达差异。结果：共鉴定出464个蛋白,其中达到严格定量标准的蛋白125个。与健康对照组比较,乳腺癌白苔组和黄苔组共筛选出9个唾液差异表达蛋白,乳腺癌白苔组和黄苔组之间筛选出16个差异蛋白。结论：本研究证实i TRAQ结合液相色谱串联质谱联用技术能够快速、有效地进行差异蛋白质组学研究,发现一些蛋白与乳腺癌的发生以及中医舌苔形成机制相关。     

S100A4:潜在抑制膀胱癌干细胞的靶分子

目的 应用siRNA技术沉默S100A4基因表达对膀胱癌干细胞增殖及成瘤能力的影响.方法 筛选鉴定出MB49膀胱癌干细胞后,应用核素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术,发现MB49膀胱癌细胞与膀胱癌干细胞表达差异的蛋白质S100A4蛋白.设计并合成S100A4基因特异性的siRNA序列,转染膀胱癌干细胞,应用Western blot和qPCR检测在siRNA对S100A4的影响,体内、外实验观察siRNA抑制S100A4后对膀胱癌干细胞增殖及成瘤能力的影响.结果 通过iTRAQ核素标记结合液相色谱和串联质谱分析,共鉴定出差异蛋白共65个,S100A4在基因表达水平差异最显著(差异为5.70,P<0.05).与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4 siRNA转染组的S100A4基因和蛋白表达降低(P<0.05).CCK8实验和裸鼠成瘤实验发现,与空白对照组与阴性对照组相比较,siRNA干扰S100A4表达后,膀胱癌干细胞生长明显受到抑制,成瘤能力受到抑制(P<0.05).结论 膀胱癌干细胞中S100A4表达与膀胱癌的复发、转移有关,S100A4蛋白可能成为消灭膀胱癌干细胞,治疗膀胱癌的分子靶标.     

基于iTRAQ技术的肝细胞生长因子促进乳腺癌细胞侵袭的蛋白质组学研究

目的基于i TRAQ多重标记串联质谱技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异。方法提取血清蛋白,采用i TRAQ标记和ESJ-QTOF-QⅡ质谱检测,搜库和Scqffold软件分析得到各组间血清差异表达蛋白,采用蛋白质印迹法即免疫印迹法(Western Blot)对差异蛋白进行验证。结果 i TRAQ标记图谱显示乳腺癌组与健康对照组之间血清肝细胞生长因子(HGF)表达水平比较差异有统计学意义,Western Blot验证结果证实,乳腺癌患者血清中HGF表达水平同健康对照组比较,明显较高(P0.05)。结论通过i TRAQ技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异,发现乳腺癌细胞高表达HGF。     

iTRAQ技术筛选急性心肌梗死动物血清早期潜在标记物的试验研究

目的利用同位素标记相对和绝对定量（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ）技术筛选急性心肌梗死（AMI）后表达的差异蛋白，寻找可早期诊断AMI的潜在血清标记物。方法32条成年比格犬分为假手术组和AMI组（采用冠状动脉注射聚乙烯微球悬浮制剂和凝血酶粉剂制作动物模型），分别收集造模前和造模后1、2、3、6h血清。利用8标iTRAQ技术分析两组血清中蛋白质的表达情况，将表达差异倍数＞1.2倍（上下调）且P＜0.05的蛋白视为差异蛋白，并对差异蛋白进行基因本体(Geneontology，GO)功能注释和富集分析。结果AMI后1h出现的差异蛋白有51种，上调28种，下调23种。AMI后2h出现的差异蛋白有54种，上调28种，下调26种。AMI后3h出现的差异蛋白有43种，上调24种，下调19种。AMI后6h出现的差异蛋白有54种，上调29种，下调25种。综合分析前6h差异蛋白，查阅文献资料排除未命名蛋白和犬特有蛋白后，共发现15种差异蛋白在AMI后6h内稳定表达，上调7种，下调8种。结论利用iTRAQ技术筛选出15种与早期AMI相关蛋白，对筛选出的差异蛋白进行功能分析并查阅相关文献，其中肌球蛋白作为早期诊断AMI的新型血清标记物可能有较大潜力。     

SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术建立胃癌血清特异性标志物诊断分类树研究

目的:观察胃癌手术前后血清蛋白质谱的变化,筛选能够快速诊断胃癌的特异性标志物。方法:采用IMAC#3蛋白质芯片和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)蛋白质芯片技术,对46例胃癌患者和40例正常人的血清蛋白质谱进行分析。结果:胃癌术前血清与正常人血清蛋白质谱有14个蛋白质表达量有明显差异。以热休克蛋白27、葡萄糖调节蛋白、抑制素、蛋白质二硫化物异构酶A 3这4个蛋白质所组成的模板,可将胃癌与正常人正确分组,利用该模板建立胃癌诊断的分类树模型用于诊断胃癌的灵敏度95.7%,特异性92.5%,术后血清蛋白质谱中,原表达上调的蛋白质明显下调。结论:SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术为建立蛋白质模板用以诊断胃癌提供了可靠的技术平台。     

无标记定量方法在小鼠精子发生相关蛋白质组学研究中的应用

目的: 利用无标记定量蛋白质组学技术筛选在3周龄及成年小鼠睾丸中差异表达的蛋白质?方法:分别抽提3周龄及成年小鼠睾丸蛋白,酶解后所得肽段经纳升液相色谱分离,并经LTQ Obitrap质谱鉴定,在获得蛋白鉴定信息的同时根据相应肽段离子质谱峰强度对蛋白进行相对定量?结果:在3周龄及成年小鼠睾丸中共鉴定到非冗余蛋白319种,其中30种蛋白在两者之间存在显著的表达差异,这些蛋白主要参与形态发生?收缩?胞吞?受精等细胞事件,与精子变形过程及精子功能相关?结论:无标记定量蛋白质组学技术,具有方法简便?通量大?成本低廉等优点,利用其寻找睾丸发育,精子发生/功能相关蛋白具有广阔的前景?     

采用iTRAQ方法研究男性弱精子症精子蛋白的差异表达

目的:探讨精子蛋白在成年男性弱精子症中的差异表达情况。方法:用iTRAQ标记以及二维高效液相色谱/串联质谱联用的方法研究成年男性正常精子以及轻、中、重度弱精症患者的精子蛋白表达情况。结果:以正常组作为参照,本研究共发现1 073个蛋白质与弱精症相关。其中,与正常相比,轻度、中度和重度精子表达上调蛋白数为474,232和311,精子表达下调蛋白数为529,800和719,上调和下调的蛋白质数量在弱精子症患者组构成比存在明显差别(P<0.05),以蛋白质表达数量降低为主。经蛋白功能注释,弱精症中明显上调和下调的蛋白质主要为结合、酶催化、分子结构、酶调节以及氧化还原功能等相关蛋白。其中,38个蛋白明确与精子发生、精子活动及受精过程相关。结论:采用iTRAQ标记技术能很好的应用于弱精症精子蛋白质组学研究。同时,弱精症中部分精子蛋白质表达以蛋白质数量降低为主,并且其变化幅度与弱精症严重程度相关。     

多发性硬化患者用药前后脑脊液蛋白质组学液相色谱技术体系的建立

目的 建立多发性硬化(MS)患者用药前后脑脊液蛋白质组一维、二维液相色谱分离的技术体系.方法 以MS患者用药前后脑脊液为研究对象,提取脑脊液蛋白质组,分别采用超高压液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)技术和二维色谱聚焦-反向液相色谱(PF-2D)技术进行分离鉴定.结果 分别获得MS患者用药前后脑脊液蛋白质组一维和二维液相色谱图谱,分离方法有良好的重现性.筛选并鉴定出表达有明显差异的蛋白质.结论 用液相色谱技术筛选差异蛋白有助于寻找具有临床治疗意义的MS疾病标识物,为MS疾病的早期诊断和治疗提供理论和实验依据.