华支睾吸虫severin蛋白体外对HBV复制的影响

目的探索华支睾吸虫severin(Cs severin)蛋白体外对乙肝患者外周血单核细胞(PBMC)乙肝病毒(HBV)复制水平的影响及对干扰素-α(IFN-α)清除HepG2.2.15细胞内HBV的影响。方法采用逆转录荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测不同浓度(0、60、80、100μg/mL)Cs severin作用乙肝患者PBMC 48 h后HBV DNA拷贝数;采用RTqPCR法检测不同浓度(0、60、80、100μg/mL)Cs severin作用HepG2.2.15细胞以及不同浓度(0、60、80、100μg/mL)Cs severin与IFN-α同时作用下的HBV DNA拷贝数;RT-qPCR检测HepG2.2.15细胞中STAT1 mRNA水平。结果 Cs severin单独作用时不影响PBMC的HBV DNA拷贝,组间差异无统计学意义(P0.05)。在HepG2.2.15细胞中,Cs severin的存在增强了IFN-α清除HBV的作用,且在60～100μg/mL范围内,随着Cs severin浓度的升高,HBV DNA拷贝数下降(P0.05)。STAT1 mRNA水平在Cs severin存在的情况下高于对照组,各组间差异有统计学意义(P0.05)。且随着Cs severin浓度的提高,STAT1 mRNA水平也随之上升。结论 Cs severin不能直接影响HBV复制水平,但可能通过影响STAT1基因的表达而提高IFN-α清除HBV的能力。     

华支睾吸虫分泌排泄蛋白对肝癌细胞株PLC增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的探讨华支睾吸虫分泌排泄蛋白(CsESP)对肝癌细胞株PLC增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法 CCK-8实验检测不同浓度CsESP(10、50、100、200μg/ml)对肝癌细胞PLC增殖能力的改变;使用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测华支睾吸虫分泌排泄蛋白(CsESP)对肝癌细胞株PLC内细胞周期的相关指标(CyclinB1、CyclinD1、CyclinE1、CDc2、CDK4、CDK2、Rb),细胞凋亡相关指标(Mcl-1、Bcl-2)mRNA表达水平。结果 CCK-8实验显示CsESP(10μg/ml)能明显促进肝癌细胞株PLC增殖能力,qRT-PCR实验检测出CyclinB1、CyclinD1、CyclinE1、CDc2、CDK4、CDK2、Mcl-1、Bcl-2明显高于CsESP 0μg/ml组,Rb明显低于CsESP 0μg/ml组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 CsESP可促进肝癌细胞株PLC的增殖,其可能与影响细胞周期和抑制细胞凋亡相关。     

华支睾吸虫重组14-3-3ε蛋白对胆管癌CCLP-1细胞迁移侵袭的作用研究

目的 探讨华支睾吸虫重组14-3-3ε蛋白(rCs 14-3-3ε)对肝内胆管癌细胞株CCLP-1细胞波形蛋白(vimentin)表达的影响,观察该过程中CCLP-1细胞侵袭和迁移能力的变化.方法 用不同浓度(1、5、10 μg/ml)rCs 14-3-3ε与CCLP-1细胞共孵育24、48、72 h后,通过Q-PCR、Western blot等实验方法检测vimentin的表达水平.用划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验检测rCs 14-3-3ε对CCLP-1细胞迁移和侵袭能力的影响.结果 Q-PCR实验表明5μg/ml rCs 14-3-3ε刺激CCLP-1细胞72 h后及10 μg/ml rCs14-3-3ε刺激CCLP-1细胞24、48、72 h后,vimentin mRNA水平显著上调;Western blot实验显示,10 μg/ml rCs14-3-3ε刺激CCLP1细胞48、72 h后,vimentin蛋白水平显著上调.划痕实验表明,rCs 14-3-3ε(10 μg/ml)能够促进细胞的迁移能力,处理后的细胞迁移率增大(P＜0.01);Transwell小室检测显示,rCs 14-3-3ε(10 μg/ml)处理组中穿膜细胞数为对照组的1.78倍,显著增加(P＜0.05).结论 rCs 14-3-3ε可以通过上调vimentin蛋白的表达,从而促进肝内胆管癌细胞株CCLP-1的侵袭和迁移能力.     

华支睾吸虫溶血磷脂酶对肝星状细胞体外作用的研究

目的探讨华支睾吸虫溶血磷脂酶(Cs LysoPLA)对肝星状细胞的作用。方法实验分为4组:PBS对照组为PBS孵育肝星状细胞系LX-2细胞24 h;Cs LysoPLA单独刺激组为Cs LysoPLA(10μg/mL)单独孵育LX-2细胞24 h;联合刺激组为不同浓度Cs LysoPLA(1、5、10μg/mL)孵育LX-2细胞2 h后,IL-13(20 ng/mL)孵育24 h;IL-13单独刺激组为IL-13(20 ng/mL)单独孵育LX-2细胞24 h;逆转录荧光定量PCR(qRT-PCR)检测星状细胞活化指标分子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及纤维化相关分子胶原蛋白Ⅰ型(Collagen-Ⅰ)、胶原蛋白Ⅲ型(Collagen-Ⅲ)以及促纤维化分子转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA水平。Western Blotting检测不同浓度Cs LysoPLA(1、5、10μg/mL)联合IL-13(20 ng/mL)刺激时LX-2细胞α-SMA蛋白表达量。结果 Cs LysoPLA(10μg/mL)可直接抑制LX-2细胞α-SMA、Collagen-Ⅲ的转录,与PBS对照组相比差异有统计学意义(P=0.014 2、0.002 7);并且Cs LysoPLA(10μg/mL)可刺激LX-2细胞TGF-β1、PDGF基因转录升高,与PBS对照组相比差异有统计学意义(P=0.009 1、0.003 4);Cs LysoPLA(10μg/mL)可以下调IL-13引起的α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、TGF-β1的mRNA水平的升高,与单独IL-13刺激组相比差异有统计学意义(P=0.003 0、0.011 9、0.043 0、0.025 6);Western Bloting结果显示,不同浓度Cs LysoPLA(1、5、10μg/mL)均可以下调IL-13引起的星状细胞活化分子α-SMA的表达,与单独IL-13刺激组相比差异有统计学意义(P=0.008 0、0.000 5、0.000 2)。结论 Cs LysoPLA(10μg/mL)在高浓度下既可以直接抑制LX-2细胞纤维化,又可以抑制IL-13引起的LX-2细胞纤维化,可能在华支睾吸虫严重感染所致纤维化过程中发挥了抑制纤维化的作用。     

华支睾吸虫染色体组型的初步研究

本文以华支睾吸虫的精原细胞和卵原细胞为材料,分析了该虫的染色体组型。结果表明其染色体数目,2n=14,n=7。核型的组成是:大型染色体4个,小型染色体10个,可配成7对。根据染色体的大小、形态和着丝粒的位置可分成两组:第一组第1号染色体为大型亚中部或中部着丝粒染色体,第2号染色体为大型亚中部着丝粒染色体;第二组第3～7号染色体为五对小型亚端部着丝粒染色体。     

华支睾吸虫感染小鼠肝组织细胞因子动态变化的初步观察

目的观察小鼠感染华支睾吸虫囊蚴后肝脏病理学特征及IFN-γ、IL-4、IL-12表达情况,探讨IFN-γ、IL-4、IL-12在免疫调控中的作用及意义。方法分别在感染后的不同时段剖杀小鼠,取其肝脏,采用石蜡切片,H—E染色,光镜观察肝脏病理变化情况;采用SABC免疫组织化学染色法测定IFN-γ、IL-4、IL-12在华支睾吸虫感染小鼠肝脏组织中表达水平的动态变化。结果H—E染色：感染后1天,小鼠肝脏无明显变化。感染后4天,小鼠肝脏轻度肿胀,肝脏汇管区表现为轻度炎症反应。随着病程的发展病理改变趋于严重。免疫组织化学结果：Th1细胞凶子IL-12和IFN-γ的表达呈现大致相同的趋势,在感染后1周开始上升,在4周达高峰,随后下降,至第12周仍高于正常组水平（P〈0．05）。而IL-4的表达水平则自感染后第1周开始持续上升,-直持续至感染后第12周实验观察结束,且随感染时问延长而明显升高。结论免疫组织化学检测结果提示细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-4的阳性表达主要在汇管区、肝小叶坏死区的淋巴细胞和巨噬细胞的胞质,肝细胞未见阳性表达。华支睾吸虫感染的免疫应答发生了由Th1免疫应答向Th2免疫应答转变的趋势;华支睾吸虫病前期Th1细胞免疫应答占优势,后期Th2细胞免疫应答占优势。     

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的　构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。　方法　提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。　结果　未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。　结论　已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD NA表达文库     

华支睾吸虫分泌排泄蛋白对肝癌细胞系HepG2细胞增殖、迁移和上皮间质转化的影响

目的探讨华支睾吸虫分泌排泄蛋白(CsESP)对肝癌细胞株HepG2增殖、迁移和上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用CCK-8实验测定不同浓度的CsESP对肝癌细胞HepG2的活力、细胞增殖能力和细胞毒性作用的影响;细胞划痕实验检测在不同浓度(1、10、20、50、100和200μg/mL)CsESP的作用下(设PBS对照组),HepG2细胞迁移的变化;荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测HepG2细胞的癌变相关因子(MMP2和p300)以及EMT基因如E-钙黏蛋白E(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-连环蛋白(α-catenin)mRNA的表达水平。结果 CCK-8实验结果显示,在CsESP浓度为10和20μg/mL时,细胞增殖明显,当CsESP浓度超过20μg/mL时,细胞活力降低。细胞划痕实验结果显示,在不同浓度CsESP的作用下,在0、24、48、72 h 4个时间点分别采集照片,并对其相对迁移面积进行统计分析,发现24和48 h 2个时间点,10和20μg/mL组的迁移能力明显高于PBS组和高浓度(50μg/mL)组,差异有统计学意义(P0.05)。RT-qPCR检测出癌变基因MMP2以及N-cadherin、Vimentin、α-catenin的mRNA水平高于PBS组,差异有统计学意义(P0.05),而癌变因子p300和E-cadherin水平并无明显变化。结论在CsESP的最适作用浓度下,CsESP可促进癌细胞增殖、癌变、迁移和上皮间质转化。     

miR-185对肝癌细胞生长增殖及侵袭迁移的影响

目的 探讨miR-185对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721生长增殖、侵袭迁移能力的影响.方法 构建miR-185过表达载体、合成miR-185反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO),经脂质体转染肝癌细胞HepG2和SMMC-7721.利用CCK-8和Transwell小室实验检测细胞的增殖、侵袭和迁移能力;生物信息学数据库预测结合基因芯片结果确定miR-185的候选靶基因NRl D1;利用实时荧光定量PCR技术和Western blot检测miR-185对细胞中NRlD1基因表达水平的影响;荧光报告载体实验验证miR-185对靶基因的调控作用.结果 miR-185在人肝癌细胞中的mRNA表达水平显著低于正常肝细胞(P＜0.01);过表达miR-185使人肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力降低,下调肝癌细胞中NRl D1基因的mRNA和蛋白的表达水平(P＜0.01);荧光报告载体实验证明miR-185可以通过作用于NRlDl mRNA的3’端非翻译区(untranslated region,UTR)下调其表达水平(P＜0.05).结论 miR-185能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭迁移能力,NRlD1是miR-185的直接靶基因.     

血脂水平与华支睾吸虫致病性的初步研究

目的比较高血脂小鼠和正常血脂小鼠感染华支睾吸虫后的肝脏病理变化及炎症因子水平,以研究血脂水平对华支睾吸虫致病性的影响。方法通过向BALB/c小鼠投食高脂饲料建立高血脂小鼠模型,用相同囊蚴数感染高血脂小鼠和正常血脂小鼠,比较感染1个月后小鼠相关病理指标。通过Masson染色(Masson′s trichrome staining)判断肝胆纤维化程度,使用免疫组化和实时荧光定量PCR(qPCR)检测肝脏α-平滑肌蛋白(α-SMA)定位情况和转录水平,用流式细胞术检测小鼠脾细胞在刀豆素(ConA)刺激48 h培养上清中细胞因子表达水平。结果与正常血脂感染组小鼠相比,高血脂感染组小鼠出现较显著的肝胆管扩张、肝实质及汇管区出现大量的胶原纤维增生、小胆管增生等病变。高血脂感染组α-SMA转录水平升高,并在肝脏组织汇管区及增生的纤维间隔内表达。高脂感染组脾细胞培养上清中白介素6(IL-6)和IL-10表达水平比正常血脂小鼠高(P0.05),高脂感染组IFN-γ水平比高脂未感染组低(P0.05)。结论高血脂可能使华支睾吸虫感染所致的肝脏胶原纤维增生、胆管扩张更明显,血脂水平高低还可影响华支睾吸虫感染后宿主的免疫应答。     

重组人Hespintor对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用

目的 完善重组Hespintor蛋白(rHespintor)的纯化方法,提高蛋白提取效率,并探讨其对肝母细胞瘤HepG2细胞增殖及侵袭作用的影响.方法 在重组蛋白提取中增加包涵体洗涤过程,更改蛋白纯化缓冲体系,并利用Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BAPNA)为作用底物,测定纯化的rHespintor对胰蛋白酶水解抑制活性.以空白组为对照组,通过MTT实验、细胞划痕愈合实验、肿瘤细胞侵袭实验分别检测rHespintor对肝母细胞瘤HepG2细胞生长的影响及作用效果.结果 对包涵体蛋白进行尿素梯度洗涤后可有效去除目的蛋白中绝大多数杂蛋白,一步纯化后,目的蛋白rHespintor具有较高胰蛋白酶水解抑制活性,且抑制效果呈剂量依赖关系.rHespintor作用于肝母细胞瘤HepG2细胞后,细胞增殖受到抑制,迁移能力减弱,侵袭的细胞数量显著减少.结论 rHespintor在体外可明显抑制肝母细胞瘤HepG2细胞的增殖及侵袭作用.     

恒河猴感染华支睾吸虫的初步观察

用恒河猴感染华支睾吸虫获得成功。两只恒河猴获虫率分别为9.9％及31.59％。所得虫体都已发育成熟。感染后30天所得虫体平均长5.15mm,宽1.005mm。感染后48天所得虫体平均长8.0625mm,宽1.34mm。两猴粪便中都发现成熟虫卵。说明恒河猴可作为华支睾吸虫的终宿主。‘ 猴华支睾吸虫病早期表现主要特点有三:嗜酸性粒细胞增多症(感染后30天);慢性炎症时(感染后48天)病灶区内浆细胞显著增多;肝内胆管上皮细胞腺瘤样增生,其分泌功能亢进,经奥辛蓝染色,上皮细胞核上区呈深蓝色,提示富含酸性粘多糖。     

雷帕霉素联合阿霉素对肝癌细胞BEL-7402增殖及迁移的影响及其作用机制

目的:探讨雷帕霉素(RAPA)与阿霉素(ADM)联合应用对肝癌细胞BEL-7402增殖和迁移的影响,阐明其作用机制.方法:选取处于对数生长期肝癌细胞株BEL7402随机分为空白对照组、乙醇溶媒组、RAPA组、ADM组以及联合用药组,采用MTT法检测各组细胞6 d内的增殖情况,采用RT-PCR方法检测cyclin D1和...     

IL-21诊断华支睾吸虫感染致肝纤维化价值的初步研究

目的 探讨白细胞介素21(IL-21)在华支睾吸虫感染致肝纤维化发生发展中的作用,初步研究IL-21诊断纤维化的意义。方法 收集2022年2月-2023年2月广州市番禺区中心医院符合肝纤维化诊断标准的中、重度肝纤维化未经治疗患者70例,并排除肝吸虫感染致肝纤维化患者为肝纤维化组;选取同期通过粪便常规检测肝吸虫卵阳性的但无肝纤维化患者70例为肝吸虫感染组;肝吸虫感染致中、重度肝纤维化（排除其他原因导致的肝纤维化）患者40例为肝吸虫感染致肝纤维化组;选取同期健康体检人群70人为正常对照组。检测各组IL-21和肝纤维化相关指标[透明质酸酶（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原（CⅣ）、Ⅲ型前胶原氨基端圆肽（PⅢNP）]水平,并分析其诊断效能,及IL-21与肝纤维化指标的相关性。结果 IL-21、HA、LN、CⅣ、PⅢNP在肝吸虫感染致肝纤维化组及肝纤维化组患者外周血中的含量均显著升高（P均<0.001）,但肝吸虫感染致肝纤维化组与肝纤维化组IL-21含量差异无统计学意义（P=0.787）。在单项检测诊断肝纤维化时,HA与CⅣ对诊断肝纤维化具有较高的诊断性能,而联合与单独实验指标诊断效能...     

METTL16对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制

目的 探究甲基转移酶样蛋白16(METTL16)对肝癌细胞(HCC)增殖、迁移和侵袭的影响及其潜在的作用机制。方法 在HepG2和HCC-LM3细胞中转染METTL16过表达载体及干扰载体,用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞,Western blot和实时定量PCR实验评估过表达以及干扰效果;采用CCK-8与Transwell实验检测METTL16对HCC增殖、迁移及侵袭的影响;采用流式细胞术检测METTL16对HCC细胞周期的影响;采用Western blot实验检测扰动METTL16后对肝癌细胞VEGFA-VEGFR2通路相关蛋白表达的影响;采用高通量基因表达数据库(GEO)分析METTL16在人肝癌组织与癌旁组织中的表达水平,通过Log-rank检验比较METTL16高表达和低表达肝癌患者生存期的差异。结果 Western blot和实时定量PCR实验显示,在HepG2和HCC-LM3细胞中,METTL16过表达细胞株和干扰细胞株构建成功。CCK-8、Transwell和流式细胞术结果显示,过表达METTL16后,增殖、迁移和侵袭的细胞数目减少,处于G₂/M期的细胞...     

华支睾吸虫钙调节蛋白的生物学特性及与肝纤维化的关系

目的对华支睾吸虫成虫（Clonorchis sinensis, Cs）钙调节蛋白（CaM）进行生物学及功能分析,以确定其在肝纤维化中的作
用。方法从Cs cDNA质粒文库中寻找CsCaM全长序列,以BLASTx搜索其同源序列并进行比对分析。以生物信息学进行同
源比对、理化性质分析及功能域预测。以分子生物学方法进行原核克隆,大肠杆菌表达,亲和层析纯化,并将纯化蛋白免疫大
鼠,产生多克隆抗体。ELISA检测CsCaM抗体滴度及产生曲线。免疫印迹实验分析CsCaM重组蛋白纯化及其抗体识别效果。
免疫组化分析其组织定位;腹腔注射法建立CsCaM致大鼠肝纤维化模型。结果重组、表达及纯化了CsCaM,其编码150 位
氨基酸,理论相对分子质量23 400。结构域预测其具有EF手位模序。pET-30a-CsCaM重组质粒其目的蛋白表达于宿主菌
BL21 E. coli上清,相对分子质量约23 400。总IgG抗体滴度于2~4 周达较高峰,效价大于1∶51 200。免疫组织化学定位显示
CsCaM在成虫睾丸表达丰富。CsCaM腹腔注射大鼠的肝脏均显示不同程度病变,HE染色可见炎症反应较严重,可见气球样
变、门管区炎及碎片状坏死;网状纤维染色显示小胆管周围胶原增生,有轻到中度纤维化。结论CsCaM促进大鼠肝脏炎症病变
及纤维化的作用,提示其可能参与了华支睾吸虫病致肝纤维化的作用。
     

氯化锂对肝癌细胞BEL-7402增殖、周期的影响及其作用机制

目的探讨氯化锂对人肝癌细胞BEL-7402增殖、周期的影响及其作用机制。方法应用MTT法及DNAPREP细胞周期法检测BEL-7402经氯化锂作用后的增殖及周期改变情况,Westernblot检测糖原合成激酶-3（GSK-3）、失活pGSK-3及其下游分子CyclinDl的表达情况。结果氯化锂可显著抑制BEL-7402的增殖,并呈时间、剂量依赖性（P〈005）;氯化锂可使BEL-7402的G0/G1期比例明显降低、GJM期比例显著升高（P〈0．05）;氯化锂作用后GSK-3、失活pGSK-3及CyclinDl蛋白的表达水平均明显升高（P〈0．05）。结论氯化锂可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能是通过抑制GSK一3活性并上调CyclinDl表达使肝癌细胞阻滞于G2/M期。     

Survivin siRNA对肝癌细胞BEL-7402的增殖与对Survivin基因及蛋白表达的作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)对BEL-7402细胞的生长抑制与生存素(Survivin)基因及蛋白表达的影响。方法:合成Survivin siRNA,以不同浓度转染BEL-7402细胞,MTT法测定细胞生长抑制率,RT-PCR、Western-Blot检测BEL-7402细胞Survivin mRNA及蛋白的表达差异。结果:BEL-7402细胞转染FAM荧光标记的siRNA后,细胞内有绿色荧光表达。分别以10、30、50nmol/LSurvivin siRNA转染细胞后,MTT测得的细胞生长抑制率分别为(38.80±1.71)%,(54.50±1.16)%,(66.79±1.10)%,RT-PCR测得的Survivin mRNA表达分别为0.42±0.02,0.28±0.01,0.12±0.01,Western-Blot测得Survivin蛋白表达分别为0.55±0.04,0.32±0.02,0.21±0.02,三项指标与空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。随着Survivin siRNA浓度的增加,细胞抑制率呈上升趋势,Survivin mRNA及Survivin蛋白的表达逐渐降低,呈浓度-效应关系。结论:Survivin siRNA能抑制BEL-7402细胞的增殖与Survivin基因和蛋白表达。     

左旋吡喹酮对体内华支睾吸虫作用的超微结构研究

采用抗血吸虫新药左旋吡喹酮治疗大鼠实验性华支睾吸虫病,对检获的华支睾吸虫成虫进行光镜和电子显微镜观察.发现本药对华支睾吸虫皮层的严重损害是其重要的杀虫方式之一.本研究结果为临床和现场应用左旋吡喹酮治疗华支睾吸虫病提供了依据.