恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ抗原基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白的活性鉴定研究

目的恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）是疟原虫红内期生活史过程中从感染红细胞分泌至血浆中的水溶性抗原,是重要的诊断用抗原。本文通过实现恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在大肠杆菌中的表达,为研制用于疟疾诊断的抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体奠定基础。方法将含有ＨＲＰⅡ抗原基因的重组表达质粒ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ用钙法转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,重组子经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢａｍＨＩ与ＢｇｌⅡ双酶切鉴定。重组子ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）在２８℃条件下,用１ｍＭＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析表达产物。结果成功构建ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ重组质粒,在低温条件下经ＩＰＴＧ诱导,ＨＲＰⅡ呈可溶性、非融合性表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明表达产物的分子量约３３ｋＤａ,薄层扫描显示表达蛋白占菌体总蛋白的２０．７６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹表明,表达产物能被抗ＨＲＰⅡ人工合成九肽单克隆抗体特异识别。结论恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在原核表达系统ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得成功表达,为基因工程大规模制备生产ＨＲＰⅡ抗原奠定基础     

恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ基因片段的体外扩？…

目的 构建恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株红细胞结合抗原（ＥＢＡ－１７５）和富组氨酸蛋白Ⅱ（ＨＲＰ－Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）对恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株的ＥＢＡ－１７５和ＨＲＰ－Ⅱ基因进行体外扩增，用ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨＩ和ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ分别消化扩增产物，定向克隆ｐｃＤＮＡ３载体，转化至感受态大肠杆菌ＴＧ１，经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经ＰＣＲ和     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2的原核表达、纯化及表达产物的鉴定

目的 为将恶性疟原虫的富组氨酸蛋白２（ＨＲＰ２）应用于疟疾诊断和疫苗研究,本文原核表达、纯化及鉴定了恶性疟原虫的ＨＲＰ２。方法 将ＨＲＰ２基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２;诱导ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２转化的ＢＬ２１菌,纯化表达产物并免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠;以免疫色谱法鉴定表达产物,以免疫小鼠血清对受染红细胞（ＩＲＢＣ）进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 成功构建了ｐＧＥ     

恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ全编码区基因的真核克隆及表达

目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＨＲＰⅡ全编码区基因,经ＨｉｎｄⅢ和Ｂａｍ ＨＩ双酶切后定向克隆入带ＣＭＶ启动子的真核高效表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＨＲＰⅡ／ｐｃＤＮＡ３重组载体;用脂质体法将重组载体转染ＨｅｐＧ２肝癌细胞,经Ｇ４１８加压筛选后,收集阳性克隆细胞培养上清,表达产物进     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

恶性疟原虫FCC—1／HN株pcDNA3—EBA175／HRPII重组质粒直？…

为观察恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ重组质粒肌肉途径接种后在宿主体内的表达。ＢＡＬＢ／ｃ小鼠分为３组,１组（实验组）经后腿股四头肌注射重组粒ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ１００μＧ;２组（实验对照组）注射空白质粒ｐｃＤＮＡ３１００μＧ,３组（正常对照组）注射ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００μｌ。每隔２０ｄ加强注射,于第１次接种后２０ｄ和第２次接种后１０ｄ取小鼠双侧     

抗恶性疟原虫重组HRP—Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

采用恶性疟原虫组富组氯酸蛋白Ⅱ（ＨＲＰ－ＩＩ）融合表达蛋免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取脾细胞与ＳＰ２／１０细胞融合,经３次ＥＬＩＳＡ筛选,共获得６株分泌抗恶性疟原虫 组ＨＲＰ－ＩＩ单克隆抗体的杂交瘤细胞株（１Ｂ１１、１Ｄ１０、２Ｅ７、３Ａ３、３Ｆ９、４Ｇ５）,用有限稀释法进行克隆,亚克隆及扩大培养,并用杂交瘤细胞经腹腔接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备腹水,６株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）经琼脂双扩散鉴     

D IPST ICK法快速诊断恶性疟的现场应用

疟疾控制策略的实施和抗药性恶性疟的扩散，迫切需要一种适应临床和现场应用的快速、简易、敏感性及特异性均高的诊断方法。最近国外研究用Ｄｉｐｓｔｉｃｋ技术检测疟原虫特定的富组蛋白Ⅱ（ＨＲＰⅡ），ＨＲＰⅡ为恶性疟原虫感染后的一种特异物质，通过免疫学方法制备出对ＨＲＰⅡ抗原的特异抗体，再应用该抗体检测ＨＲＰⅡ抗原。为评估Ｄｉｐｓｔｉｃｋ法在检测恶性疟抗原中的实用价值，我们应用该法的快速诊断试剂盒对流行区抗药性恶性疟现症疟疾患者进行现场检测，并与经典的镜检法进行了平行比较。材料与方法１　检测对象　疟…     

恶性疟原虫疫苗研究Ⅹ.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因在大肠杆菌中的表达及其产物的初步鉴定

目的克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原,为疟疾疫苗研究奠定基础。方法将恶性疟原虫MSP1中类表皮生长因子1（EGF—1）基因与人工化学合成的抗原复合基因PfCMR串接,插入高效非融合型蛋白表达载体PBV220,转化大肠杆菌DH5a．转化菌经42℃热诱导表达,表达产物用Westernblot和Dot—ELISA分析。结果构建成功重组质粒PBV220／PfCMR—EGF─1,经热诱导后表达出合外源基因产物的非融合蛋白质,分子量为16．5kDa,表达产物与恶性疟原虫抗原免疫鼠血清产生特异免疫反应。工程菌连续传代,未见重组质粒丢失,表达效率无明显改变。结论用表达载体pBV220表达出的恶性疟原虫重组复合抗原具有一定的免疫活性。该重组质粒可在宿主菌DH5a内长期稳定存在。     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

恶性疟原虫FCC—1/HN株EBA—175和HRP─Ⅱ基因片段的体外扩增与克隆

目的构建恶性疟原虫FCC—1／HN株红细胞结合抗原（EBA—175）和富组氨酸蛋白Ⅱ（HRP─Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法通过聚合酶链反应（PCR）对恶性疟原虫FCC—1／HN株的EBA─175和HRP─Ⅱ基因进行体外扩增,用HindⅢ／BamHI和BamHI／EcoRI分别消化扩增产物,定向克隆pcDNA3载体,转化至感受态大肠杆菌TG1,经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定。结果从恶性疟原虫FCC—1／HN株基因组DNA中扩增出EBA—175和HRP─Ⅱ两基因片段并定向插入PCDNA3载体构建重组质粒。结论所获重组克隆含有编码恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ的基因片断。     

化学合成恶性疟原虫杂合45肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

为了使化学合成的人恶性疟原虫杂合４５肽抗原基因在大肠杆菌中表达，我们将ＨＰＦＡＧ与表达载体ｐＷＲ４５０．１质粒重组连接，转化大肠杆力，获得一批转化子。这些转化子经质粒ＤＮＡ斑点杂交试验，蛋白质ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＤＮＡ酶解分析，表明化学合砀ＨＰＦＡＧ与表达载体质粒发生了重组，且有６个重组子在大肠杆菌中与β－半乳糖苷酶呈融合蛋白形式表达。     

化学合成恶性疟原虫杂合45肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

为了使化学合成的人恶性疟原虫杂合45肽抗原基因(HPFAG)在大肠杆菌中表达,我们将HPFAG与表达载体pWR450.1质粒重组连接,转化大肠杆菌,获得一批转化子。这些转化子经质粒DNA斑点杂交试验,蛋白质SDS—PAGE和DNA酶解分析,表明化学合成的HPFAG与表达载体质粒发生了重组,且有6个重组子在大肠杆菌中与p—半乳糖苷酶呈融合蛋白形式表达。     

人工合成恶性疟原虫复合基因在大肠杆菌中的表达及产物的初步鉴定

将人工合成与构建的恶性疟原虫保护性抗原复合基因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０９，工程菌经ＩＰＴＧ诱导后表达出含外源基因产物与β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白，分子量分别为６５ｋＤａ和７７ｋＤａ。免疫印迹分析显示表达产物可与兔抗恶性疟原虫ＲＥＳＡ多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示融合蛋白中含有恶性疟原虫抗原位点。     

表达恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1片段的减毒鼠伤寒杆菌的构建

目的 检测恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１基因在减毒鼠伤寒直蓖Ｘ４０６４株中的表达。方法 将７个克隆有恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１基因片段的表达质粒ｐＱＥＭ用氯化钙法转化到修饰系统正常、限制系统缺陷的鼠伤寒杆菌ＬＢ５０００中,再通过专一性噬菌体Ｐ２２转导入腺苷酸环化酶基因、环腺苷酸受体基因双重突变的减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４株中,用质粒酶切、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定构建的重组菌株 组菌株的表达。结果 成     

人工合成恶性疟原虫复合基因在大肠杆菌中的表达及…

将人工合成与构建的恶性疟原虫保护性抗原复合原因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０９，工程菌经ＩＰＴＧ诱导后表达出含外源基因产物与β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白，分子量分别为６５ｋＤａ和ｋＤａ。免疫印迹分显示表达产物可与兔抗恶性疟原虫ＲＥＳＡ多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示融保蛋白中含有恶性疟原虫抗原位点。     

恶性疟原虫重组复合抗原的分离纯化及免疫活性鉴定

高效表达恶性疟原虫保护性抗原重组复合蛋白的工程菌ｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９，在发酵罐中发酵后收集菌体，经超声波破菌，硫酸铵分级沉淀，分子筛和离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８０％以上。纯化后的融会蛋白具有β－半乳糖苷酶的活力，用等电聚焦技术测定纯化蛋白的等电点分别为８．４和８．２５。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体以及疟区病人血清发生特异性免疫反应；重组蛋白免疫家兔后制备的抗血清可特异性地识别恶性疟原虫海南株和云南株的红内期抗原，说明我们纯化的融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复合抗原。     

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒ＤＮＡ直接免疫接种诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫ＤＮＡ疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＰＣＲ法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ、Ｔ淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用ＰＣＲ法从上述组织中均检测到ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达１２５６０，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８直接免疫接种，能特异性地剌激ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ基因片段在HeLa细？…

目的 在ＨｅＬａ细胞中表达恶性疟原性红细胞结合蛋白ＥＢＡ－１７５和富组氨酸蛋白ＨＲ－Ⅱ,进一步研究其生物学功能和免疫学特性。针ＥＢＡ－１７５和ＨＲＰ－Ⅱ部分基因串接插入ＰＣＤＮＡ３真核表达载体,获得重组表达质粒ＰＣＤＮＡ３／ＥＢＡ１７５－ＨＲＰⅡ。采用磷酸钙－ＤＮＡ共沉淀法将重组质粒转染ＨｅＬａ细胞进行体外表达,对表达产物进行ＳＤＳＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ鉴定。结果 表     

旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分析及重组质粒的构建

目的：获取旋毛虫ＥＳ抗原的结构基因，对其鉴定和克隆，并研制旋毛虫基因重组抗原。方法：先用反转录ＰＣＲ技术获取目的基因，经序列测定和酶切分析后，再用重组ＤＮＡ技术分别将目的基因与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及表达载体ｐＢＶ２２０连接，评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的特异性。结果：获得了编码ＥＳ抗原特异性蛋白成分的两个结构基因（０．７ｋｂ和０．９５ｋｂ），其序列与文献报道的稍有差异。共构建３个重组质粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的重组蛋白，均能被猪旋毛虫病阳性血清所识别，但非融合蛋白的特异性强于融合蛋白。在相同条件下，融合蛋白的表达量高于非融合蛋白，而表达蛋白的分子量大小与表达水平呈负相关性。结论：在大肠杆菌中表达的３种重组蛋白是研制旋毛虫基因重组抗原的良好候选抗原蛋白。