吡格列酮对尿毒症ApoE~(-/-)小鼠调节性和效应T细胞平衡的影响

目的:观察吡格列酮对体外培养的有或无斑块特异性抗原氧化低密度脂蛋白(ox LDL)刺激的尿毒症Apo E-/-小鼠调节性和效应T细胞(Treg/Teff)水平和功能相关因子的影响及可能机制。方法:通过两步外科手术法建立尿毒症Apo E-/-小鼠的动物模型,以不同浓度吡格列酮(2μmol/L和20μmol/L)及PPARγ拮抗剂GW9662(5μmol/L)对有或无ox LDL(2 mg/L)刺激的尿毒症模型鼠脾细胞作用12 h后,流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg及IFN-γ+CD4+Teff细胞水平,实时荧光定量PCR检测Foxp3及IFNγ的mRNA表达。结果:ox LDL体外诱导尿毒症Apo E-/-小鼠脾细胞Treg/Teff失衡。吡格列酮上调ox LDL抑制下的Treg及Foxp3的表达,此作用不能被GW9662拮抗;下调有或无ox LDL刺激下Teff及IFNγ的表达,此作用可被GW9662拮抗。结论:oxLDL体外诱导尿毒症模型鼠Treg/Teff失衡,吡格列酮通过PPARγ非依赖/依赖机制调整Treg/Teff失衡。     

小鼠CD4~+ CD25~+ Foxp3~+调节性T细胞体外扩增

目的:本研究旨在探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞体外扩增的方法。方法:采用磁珠分选小鼠CD4+T细胞,αCD3单克隆抗体包被24孔板,加入αCD28单克隆抗体、雷帕霉素、rhIL-2,培养3周后,流式细胞仪测定培养细胞中CD4+CD25+T细胞的含量,实时定量PCR检测CD4+CD25+T细胞Foxp3 mRNA的表达;单向混合淋巴细胞反应和增殖抑制试验测定扩增的CD4+CD25+T细胞的增殖及其抑制功能;ELISA检测培养上清中IL-10和TGF-β1的含量。结果:小鼠CD4+T细胞培养3周后,CD4+CD25+T细胞达(76.05±2.73)%,高于未加雷帕霉素组(52.17±1.36)%(P<0.001),磁珠分选的CD4+CD25+T细胞Foxp3 mRNA的表达是未加雷帕霉素组的5倍(P<0.001),增殖能力是未加雷帕霉素组的0.29倍(P<0.001),对CD4+T细胞增殖抑制能力是未加雷帕霉素组的3.6倍(P<0.001),培养上清中IL-10和TGF-β1分别是对照组的1.8倍和1.6倍(P<0.001)。结论:小鼠CD4+T细胞在含有1μg/ml的αCD28、rhIL-2 100 U/ml和终浓度为10 nmol/L雷帕霉素的培养体系中培养3周后能有效扩增CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。     

过氧化物酶体增殖物活化的受体γ特异配体罗格列酮对肝星状细胞生物学特性的影响

目的　研究过氧化物酶体增殖物活化的受体γ(PPARγ)特异配体罗格列酮对肝星状细胞(HSC)PPARγ 表达以及对HSC生物学特性的影响。　方法　设立空白对照组、3μmol L罗格列酮组、10μmol L罗格列酮组;分别 用RT PCR、Western印迹、免疫细胞化学方法检测PPARγ的表达;用Western印迹和免疫细胞化学方法检测α 平滑肌 肌动蛋白(α SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达;四甲基偶氮唑盐(methythiazolyltetrazolium,MTT)法检测细胞增殖;流式细胞 仪分析细胞凋亡。　结果　10μmol L罗格列酮组HSC的PPARγmRNA表达明显高于对照组(t=10.87,P<0.01), PPARγ蛋白表达也明显高于对照组(t=4.627,P<0.01);10μmol L罗格列酮组HSC的增殖活性显著低于对照组(t ≥5.542,P<0.01),其α SMA及Ⅰ型胶原表达明显低于对照组(t≥4.627,P<0.01),其凋亡发生率显著高于对照组 (χ2=16.682,P<0.01)。　结论　PPARγ特异配体罗格列酮通过增加PPARγ的表达,能够抑制激活的HSC表达α SMA及Ⅰ胶原,抑制激活的HSC增殖,诱导激活的HSC凋亡。     

结核病患者外周血中CD4~+ CD25~+调节性T细胞水平的检测

探讨CD4~+CD25~+调节性T细胞及其转录因子Foxp3在结核病发病机制中的作用。研究对象为肺结核患者22例(病例组)以及健康对照者23例(对照组)。采用FACS检测外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞的百分率,采用real-time PCR检测外周血单个核细胞Foxp3mRNA的表达以及CD4~+CD25~+调节性T细胞与CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、IFN-γ和IL-4的相关性。结核病患者外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞占CD4~+T细胞的百分率,病例组(3.38±1.23)%高于对照组(1.97±0.62)%,两组比较差异有统计学意义(P0.05)。血清单个核细胞Foxp3 mRNA相对表达水平为134.54±6.76,高于对照组(40.98±2.34,P0.05)。CD4~+CD25~+调节性T细胞与CD4~+T细胞、CD8~+T细胞以及与IFN-γ和IL-4的表达呈负相关。结核病CD4~+CD25~+调节性T细胞数量增加、特异性转录因子Foxp3 mRNA表达上升,由此引发的免疫抑制效应可能是结核病发生发展的重要原因之一。     

CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞在子宫内膜癌患者外周血中的表达及意义

探讨在子宫内膜癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的表达情况及意义。采用流式细胞术检测84例术前子宫内膜癌患者及40例子宫肌瘤患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+细胞比例及Foxp3平均荧光强度,采用qRT-PCR检测两组患者外周血中Foxp3的mRNA表达情况,同时采用ELISA检测外周血中TGF-β1和IL-17含量。与子宫肌瘤组比较,子宫内膜癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的比例虽略有升高但没有统计学意义(P=0.08),而CD4+CD25+细胞内Foxp3的平均荧光强度明显升高(P<0.001)。子宫内膜癌患者外周血中Foxp3的mRNA表达要明显多于子宫肌瘤组(P<0.001)。子宫内膜癌患者外周血中TGF-β1、IL-17的含量要多于子宫肌瘤组。子宫内膜癌患者外周血中的Foxp3+Treg细胞表达增多,这些细胞可能通过增加细胞因子TGF-β和IL-17的分泌从而调节机体对肿瘤细胞免疫反应的方向,最终促进子宫内膜癌的发生和发展。     

罗格列酮抑制体外大鼠肝星状细胞活化

目的探讨罗格列酮（PPARγ配体）对肝星状细胞（HSCs）作用的机制。方法将原代HSCs随机分为3组：对照组;TGF-β1（5μg/L）组;TGF-β1加10μmol/L罗格列酮组。加药后48h用RT-PCR法检测细胞Ⅰ型前胶原的表达。用Western blot方法检测细胞SMAD3、SMAD4、SMAD7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原的表达。免疫荧光化学标记,共聚焦显微镜下观察α-SMA的表达。用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖。结果TGF-β1明显促进HSCs的增殖,促进HSCs表达Ⅰ型胶原和α-SMA（P〈0.01）;罗格列酮显著降低TGF-β1的作用（P〈0.01）。各组细胞SMAD3、SMAD4、SMAD7的表达无明显差异。结论PPARγ配体可以抑制TGF-β1对HSCs的活化作用。     

免疫磁珠两步法分离小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞

体外分离CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)并进行初步鉴定.用磁性细胞分离器(MiniMACS)分离CD4+CD25+Treg细胞,流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞纯度和Foxp3蛋白表达,体外检测细胞因子.MACS分离的CD4+CD25+Treg细胞纯度大于90%,细胞存活率大于93%,并且特异性表达Foxp3蛋白,体外能抑制CD4+CD25-Treg分泌IFN-γ,同时CD4+CD25+Treg能分泌抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10.结果显示,通过MACS可分离高纯度、高活性的CD4+CD25+Treg细胞.     

抗原特异性T细胞活化后Foxp3、CTLA-4及细胞因子mRNA表达水平的动态分析

目的研究抗原特异性T细胞活化后,其所表达的Foxp3、CTLA-4和细胞因子的动态变化,为深入了解特异性免疫应答调控奠定基础。方法体外采用树突状细胞(DC)系D2SC/1作为抗原提呈细胞(APC)将OVA323-339直接提呈给OVA特异性TCR转基因小鼠DO11.10来源的CD4~+T细胞。采用CCK-8法测定细胞活化增殖情况,并应用Real time-PCR动态分析细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β,CTLA-4和Foxp3的mRNA表达水平。结果OVA特异性T细胞活化所需的最佳OVA剂量为2μmol/L,T细胞活化后IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-βmRNA表达水平最高峰值分别在8、4、2 h和8 h,Foxp3 mRNA在2 h时有一过性的表达峰,随后在24 h又有所升高,而CTLA-4 mRNA在静止时有较高水平的表达,但活化后迅速下调,其在24 h内无明显变化。结论初步了解了适应性免疫应答中Foxp3、CTLA-4和主要免疫调节相关的细胞因子表达趋势,为深入研究适应性免疫应答调控机制奠定初步基础。     

Graves病患者131I治疗前后CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞的变化

目的:通过对Graves病患者131I治疗前后外周血各淋巴细胞亚群和CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞含量以及相关基因Foxp3mRNA表达水平的测定,探讨131I治疗方法是否可以通过改变调节性T细胞的含量从而改善Graves病患者的免疫功能异常。方法:采集30例Graves病患者131I治疗前及治疗后1个月的外周血,流式细胞仪检测外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+淋巴细胞亚群及CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞的百分率,Real-TimePCR检测外周血单个核细胞Foxp3mRNA的表达水平。结果:和治疗前相比,Graves病患者131I治疗1个月后外周血CD3+CD4+T细胞和CD3-CD19+B细胞百分率都明显减少(P<0.05),CD3-CD16+CD56+NK细胞百分率明显增加(P<0.05),CD3-CD8+T细胞、CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞百分率和Foxp3mRNA的表达水平无明显变化。结论:131I不能通过增加调节性T细胞的含量而改善Graves病患者的免疫耐受障碍,但可以通过减少CD4+T和B淋巴细胞的含量和增加NK细胞的含量来控制过度的免疫应答。     

宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞及血清中IL-10、TGF-β的表达及其临床意义

目的 探讨宫颈癌患者外周血CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Treg)、T淋巴细胞亚群以及血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2细胞因子的表达及其临床意义.方法 选取32例宫颈癌患者和24位健康体检者为研究对象,采用流式细胞术检测受试者外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例、T淋巴细胞亚群细胞比例;采用ELISA方法检测血清中细胞因子IL-10、TGF-β1、TGF-β2的含量.结果 与健康对照组相比,宫颈癌组外周血中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值明显增高,差异有统计学意义(P＜0.01),T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4 +/CD8+、CD19+)比例差异无统计学意义(P＞0.05),血清IL-10含量明显增高,TGF-β2含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),TGF-β1的含量差异无统计学意义(P＞0.05);宫颈癌组手术后、化疗后CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例,血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2含量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),CD4+ CD25+ Foxp3+Treg与TGF-β1之间存在正相关(r=0.673,P＜0.01).结论宫颈癌患者CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值增高,且与TGF-B1含量呈正相关,可能在宫颈癌的肿瘤发生发展及肿瘤免疫逃逸中起着重要作用.     

肺癌患者调节性T细胞的变化及CpG ODN的干预作用

目的:观察肺癌患者外周血调节性T细胞的变化,并探讨CpG ODN的干预作用。方法:分离肺癌患者和健康志愿者(各30例)的外周血单个核细胞(PBMC),用流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞比例,Real-time PCR检测Foxp3基因的表达,ELISA法检测TGF-β和IFN-γ水平。将30例肺癌患者的PBMC随机分为实验组和安慰剂组,分别给予CpG ODN2006或安慰剂CpG ODN1612干预,比较干预前后上述指标的变化。结果:肺癌患者PBMC中的CD4+CD25+调节性T细胞比例、Foxp3基因的相对表达量、TGF-β水平均高于健康对照组,差异具有显著性,但不同病理分型和分期的肺癌患者亚组间比较无显著性差异。两组的IFN-γ水平比较无差异性。CpG ODN干预后CpG ODN2006治疗组的CD4+CD25+调节性T细胞比例、Foxp3基因的相对表达量及TGF-β水平出现了下降,差异有显著性,IFN-γ水平变化无显著性差异。而CpG ODN1612安慰剂组的上述指标在干预前后则无显著性改变。结论:肺癌患者外周血中的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例、TGF-β水平明显升高。CpG ODN2006干预可下调CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例及TGF-β水平。     

B7H1-Ig诱导Tr1细胞向CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞转化的研究

为探讨Ⅰ型调节性T细胞(Tr1)与CD4+CD25+Foxp3+Treg之间的转化和相互关系,以预包被而固相化的B7H1-Ig融合蛋白加抗CD3单抗刺激初始CD4+CD62L+T细胞,分析细胞因子及Foxp3表达水平的变化,检测细胞功能;在B7H1-Ig开始刺激时或诱导细胞分化结束后加入重组人TGF-β,观察其对细胞分化的影响。结果显示,B7H1-Ig激活的CD4+T细胞产生高水平IL-10、IFN-γ和IL-5,极低水平的IL-2和IL-4,不表达Foxp3,通过分泌抑制性细胞因子IL-10发挥免疫抑制功能,证实B7H1-Ig可诱导Tr1细胞的产生。同时发现TGF-β不影响B7H1-Ig刺激的初始CD4+T的分化,却可促进B7H1-Ig诱导的已分化Tr1细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg转化,提示在特定条件下,Tr1细胞可转化的CD4+CD25+Foxp3+Treg。研究结果为将来临床应用CD4+Treg治疗免疫失调性疾病奠定了基础。     

PI3K信号通路对哮喘小鼠调节性T细胞与Th17失衡的调控作用

目的: 探讨PI3K信号通路对哮喘小鼠T细胞中辅助性T细胞17(Th17)与CD4⁺CD 25⁺调节性T细胞(Treg)失衡的调控作用。方法: 尼龙毛柱法分选对照组和哮喘组BALB/c小鼠脾脏T细胞,进而在细胞水平分组:对照组(A组)分为2个亚组:空白对照组(A1),PI3K抑制剂LY294002对照组(A2);哮喘组(B组)继续分为4个亚组:哮喘组(B1),5 μmol/L PI3K抑制剂LY294002组(B2),10 μmol/L PI3K抑制剂LY294002组(B3),20 μmol/L PI3K抑制剂LY294002组(B4),共培养72 h,采用流式细胞仪检测CD4⁺CD 25⁺Treg的数量,酶联免疫吸附反应(ELISA)检测上清中白细胞介素(IL)-10和IL-17水平,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转录因子Foxp3和RORγt的mRNA水平。结果: (1)分选后获得的T细胞纯度为(74.12±3.08)%,细胞存活率为(92.82±3.21)%;(2)Treg的数量B1组较A1组显著降低(P<0.01);A2组显著高于A1组(P<0.05);B3和B4组较B1组显著增高(均P<0.01);(3)IL-17水平和RORγt mRNA表达B1组较A1组显著增高(P<0.01);A2组显著低于A1组(P<0.01,P<0.05);B2、B3、B4组均显著低于B1组(均P<0.01),呈剂量依赖性降低;而IL-10水平和Foxp3 mRNA表达B1组显著低于A1组(P<0.01); A2组显著高于A1组(P<0.01);B2、B3和B4组均显著高于B1组(P<0.01),且呈浓度依赖性增高;(4)RORγt/Foxp3 mRNA的比值B1组显著高于A1组(P<0.01);A2组显著低于A1组(P<0.01);B2、B3和B4组显著低于B1组(P<0.01),且呈浓度依赖性降低;RORγt/Foxp3 mRNA比值与IL-17水平呈正相关(r=0.89,P<0.01);RORγt/Foxp3 mRNA比值与IL-10呈负相关(r=-0.86,P<0.01)。结论: 哮喘小鼠存在Th17/Treg失衡,PI3K信号通过调控Treg/Th17失衡而参与哮喘发病过程。     

RSV毛细支气管炎患儿血液CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg与CD40/CD40L关系的研究

探讨CD40/CD40L信号通路对不同病原体毛细支气管炎(以下简称:毛支炎)患儿血液CD4~+CD25~+Foxp3~+ Treg的增殖分化及其分泌抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10的影响。取呼吸道合胞病毒(RSV)及非RSV感染毛支炎患儿血液并检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的百分率;并将血液中分离的单个核细胞(PBMC)接种于24孔板内,加入CD40L McAb进行阻断,作用72h后采用流式细胞仪检测培养板内CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的百分率,激光共聚焦检测CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞表面Foxp3的平均密度,酶联免疫吸附法检测培养上清中TGF-β1、IL-10的含量。RSV毛支炎患儿血液中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg百分率显著低于非RSV毛支炎患儿及正常对照组(P<0.05);RSV毛支炎患儿体外培养PBMC中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg百分率均显著低于非RSV毛支炎患儿、正常对照组和抗CD40L McAb组(P<0.05)。毛支炎患儿PBMC经过体外培养72h后,抗CD40L McAb组培养的细胞中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg表面Foxp3的平均密度显著高于RSV毛支炎患儿组(P<0.05)。PBMC培养上清中IL-10和TGF-β1的水平抗CD40L McAb组明显高于非RSV毛支炎组,非RSV毛支炎组明显高于RSV毛支炎组,差异有统计学意义(P<0.05)。RSV毛支炎患儿体内存在严重的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg数量不足;体外用抗CD40L McAb阻断CD40/CD40L通路可促进RSV毛支炎PBMC中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的增殖。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂罗米地辛对小鼠T细胞表型及功能的影响

目的:通过体外实验观察罗米地辛对效应T细胞和调节性T细胞的作用。方法:取CFSE标记的淋巴细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞作为反应细胞,实验组加入不同浓度梯度(1、3、5μmol/L)的罗米地辛及CD3/CD28单抗进行淋巴细胞培养,以仅加入CD3/CD28单抗作为阳性对照组,另设空白对照组。培养72 h后检测各组细胞的增殖情况。以淋巴细胞作为反应细胞,实验组、阳性对照组及空白对照组设定同上,72 h后检测各组中CD4+Foxp3+T细胞与CD4+T细胞的比例变化。同时采用ELISA检测培养液中相关细胞因子,如TNF-α、IL-10及TGF-β水平的变化。结果:罗米地辛剂量依赖性地抑制CD3/CD28单抗诱导的淋巴细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖(P0.05)。在CD3/CD28单抗存在的条件下,1μmol/L的罗米地辛不能诱导CD4+Foxp3+T细胞的比例上调(P0.05)。但提高罗米地辛的浓度至3μmol/L和5μmol/L后,CD4+Foxp3+T细胞的比例显著提高(P0.05)。随着罗米地辛浓度的增加,TNF-α和IL-10水平呈剂量依赖性降低,但各实验组明显高于空白对照组而低于阳性对照组(P0.05)。TGF-β在阳性对照组虽稍有升高,但与空白对照组相比无显著差异(P0.05)。而随着罗米地辛浓度的增加,TGF-β水平呈剂量依赖性升高,3实验组间及与空白对照组、阳性对照组间差异显著(P0.05)。结论:体外实验研究显示罗米地辛不仅能够有效抑制效应性T细胞的增殖,而且一定浓度的罗米地辛可上调调节性T细胞的比例,这可能与TGF-β升高有关,而与IL-10变化无关。     

CD4~+ CD25~+调节性T细胞及Foxp3基因在不同淋巴结转移状态的非小细胞肺癌患者中的表达差异

目的:比较CD4+CD25+调节性T细胞及Foxp3基因在不同淋巴结转移状态的非小细胞肺癌患者外周血及肿瘤微环境中的表达差异。方法:46例初诊、初治的非小细胞肺癌患者根据有无淋巴结转移分为两组,采用流式细胞仪检测两组患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的比例,Real-time PCR检测Foxp3基因的表达,免疫组化法检测肿瘤微环境中Foxp3的表达情况,ELISA法检测外周血及肿瘤组织匀浆中的TGF-β和IFN-γ水平。结果:Foxp3基因在转移淋巴结中的表达明显强于无转移的淋巴结,有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者肿瘤微环境中的Foxp3表达明显强于无淋巴结转移的非小细胞肺癌患者,前者肿瘤组织匀浆中的TGF-β水平也明显高于后者,差异均具有显著性。两组患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞比例、Foxp3基因的表达及TGF-β、IFN-γ水平比较无显著性差异。结论:有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者肿瘤微环境中存在Foxp3基因表达增强及TGF-β水平增高的现象,提示该类患者存在较为严重的局部肿瘤免疫抑制状态。     

CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与LSCC发病的相关研究

为研究调节性T细胞在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)、发展中的变化及其参与疾病进展的作用机制,收集2010～2011年上海市五官科医院收治的50例LSCC患者的肿瘤组织和外周血,应用流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞及趋化因子受体CCR6的表达变化,Real-time PCR法检测转录因子Foxp3以及细胞因子mRNA的表达量。结果发现:LSCC患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比较正常人显著增加,并与临床分期相关;CD4+CD25+CCR6+Treg Foxp3的表达,以及肿瘤组织Foxp3mRNA的表达皆明显高于对照组,且与临床分期、淋巴结转移相关。同时发现,LSCC患者外周血中TGF-β和IL-10mRNA的检出水平分别高于对照组,但IFN-γ、IL-2、IL-12mRNA的水平低于对照组。提示此类Foxp3+Treg属于一类诱导性T抑制细胞(Foxp3+iTreg),可通过产生IL-10和TGF-β抑制LSCC患者的细胞免疫功能。Foxp3的检测可能对判断LSCC的预后有一定价值。     

卵巢癌细胞培养上清诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞

目的研究卵巢癌细胞培养上清液是否能诱导外周血CD4^＋CD25^- T细胞转变为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。方法将外周血CD4^＋CD25^- T细胞分离后，对照组用CD3和CD28单抗活化，实验组在对照基础上加用卵巢癌细胞株SKOV3培养上清，72h后分离各组的CD25^＋和CD25^-T细胞，溴化脱氧尿嘧啶掺入标记法测定增殖能力及对静息的自体同源CD4^＋CD25^- T细胞的增殖抑制能力，流式细胞仪测定细胞糖皮质激素诱发型TNF受体（glucocorticoid-induced TNFR,GITR）与CTLA-4分子的表达，RT-PCR检测细胞卿mRNA的表达。结果与对照组相反，实验组的CD4^＋CD25^＋T细胞具有免疫抑制功能，自身增殖能力下降，GITR和CTLA-4分子的表达和CD4^＋CD25^＋调节性T细胞相似，并被诱导表达转录因子Foxp3 mRNA。结论卵巢癌细胞分泌的可溶性物质能诱导外周血CD4^＋CD25^-T细胞转化为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。     

Foxp3转染对哮喘小鼠脾淋巴细胞功能的影响

目的: 转染Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,探讨Foxp3表达对脾淋巴细胞功能的影响。方法: 卵白蛋白(OVA)致敏激发制作哮喘小鼠模型,收集培养脾脏淋巴细胞;使用电穿孔法转染真核表达载体pcDNA3.1(-)-Foxp3至脾脏淋巴细胞,并设转染空质粒组和对照组;RT-PCR和Western blotting检测Foxp3的表达;流式细胞术检测转染后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例;MTT法检测转染后的脾脏淋巴细胞增殖反应,ELISA检测脾淋巴细胞上清中白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果: 转染组Foxp3 mRNA 和蛋白的表达水平显著高于空质粒组和对照组;转染Foxp3后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例显著高于空质粒组和对照组;与空质粒组和对照组相比,转染pcDNA3.1(-)-Foxp3质粒明显抑制了脾淋巴细胞增殖;转染组细胞上清中IL-4和IFN-γ含量低于空质粒组和对照组。结论: 转染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,Foxp3得到有效表达。Foxp3的高表达能增加CD4⁺CD25⁺ T细胞的数量,抑制哮喘小鼠脾淋巴细胞的增殖以及Th1和Th2细胞因子的产生。     

Foxp3转染小鼠CD4+CD25-T细胞抑制NK细胞活性

目的： 通过逆转录病毒载体转染Foxp3基因到小鼠CD4+CD25-T细胞,以研究体外诱导获得的调节性T细胞对NK细胞免疫活性的调节作用及其机制。方法： 携带Foxp3基因的逆转录病毒转染初始CD4+CD25-T细胞,以获得持续性高表达Foxp3的CD4+ T细胞模型。CD4+Foxp3+ T细胞与NK细胞共培养后,用［51Cr］标记的YAC-1细胞检测NK细胞的杀伤毒性。在TGF-β阻断实验中,通过Transwell共培养实验以及向细胞共培养体系加入抗TGF-β抗体,并检测NK细胞杀伤毒性。结果：逆转录病毒转染初始CD4+CD25-T细胞,成功建立了表达Foxp3的CD4+T细胞模型,转染后1周Foxp3阳性表达的T细胞比例为38.0%。CD4+Foxp3+ T细胞在与NK细胞共培养的24 h和48 h后,对NK细胞的细胞毒性杀伤效应的抑制率分别为42.9%和22.7%。在CD4+Foxp3+ T细胞与NK细胞的共培养体系中加入抗TGF-β抗体后,其抑制率分别由原来的42.9%(24 h)、22.7%(48 h)变为3.2%(24 h)、2.1%(48 h)。在Transwell共培养实验中与NK细胞直接接触的Foxp3+CD4+T细胞可以诱导NK细胞免疫抑制,而没有直接接触的Foxp3+CD4+T细胞则不能抑制NK细胞的杀伤作用。结论：强制性表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞可以在体外发挥免疫抑制作用,可以抑制NK细胞的细胞毒性杀伤作用。转染 Foxp3的CD4+CD25-T细胞对NK细胞发挥作用依赖于细胞之间的直接接触,与转染后T细胞表面表达TGF-β有关。