全基因组扩增技术对DNA甲基化保真性的影响

目的： 采用焦磷酸测序技术对全基因组扩增后DNA甲基化保真性进行研究。方法：采用全基因组扩增试剂盒对L02、A549和HCT116细胞进行全基因组亚硫酸氢盐修饰后的DNA扩增,选择3个特异基因 (MGMT、GSTP1和P16)和反映基因组总甲基化水平的LINE1序列,利用焦磷酸测序技术检验扩增前后甲基化的保真性。结果：DNA平均扩增量为246倍,片段长度>1 000 bp,符合甲基化检测的基本要求。反映总甲基化水平的LINE1在扩增前后无明显变化;扩增后3个特异基因甲基化的变化幅度与扩增前基因甲基化水平相关。当基因的甲基化水平≥60%时,其扩增前后变化不大;当基因甲基化水平在≥20%~60%之间时,扩增前后的变化较大,且无一致的变化趋势;而当基因甲基化水平低于<20%时,扩增后基因甲基化水平下降显著。此外,焦磷酸测序结果表明全基因组扩增对各特异基因多个CpG甲基化位点的影响与对该基因平均甲基化水平的影响一致。结论：全基因组亚硫酸氢盐修饰后的DNA扩增适用于基因整体甲基化水平和甲基化率≥60%的特异基因的甲基化研究,但会影响低DNA甲基化率基因 (<60%)的DNA甲基化的保真性。     

高通量检测全基因组DNA甲基化方法的建立

目的:建立焦磷酸测序技术联合甲基化敏感性内切酶高通量定量分析全基因组DNA甲基化水平的方法(PME)。方法:以Lambda DNA为标准品,取>10倍浓度梯度DNA(125、250、500、1 000和2 000ng)进行双酶切后焦磷酸测序,检测甲基化程度,分析测序峰值与模板量相关性;以经甲基化酶(M.SssⅠ)处理的Lambda DNA为阳性对照品,与阴性对照品(未经甲基化酶处理的阴性Lamb-da DNA)混合(混合比例分别为0、25%、50%、75%和100%),进行甲基化程度相关性分析;以该实验方法对8例健康体检者和6例非小细胞肺癌(NSCLC)组织DNA进行分析。结果:测序峰值与模板量呈线性相关,在125～2 000ng,实验重复性良好;阳性对照品甲基化程度为100%,阴性对照品为0,甲基化水平呈线性相关,相关系数为0.999。健康人甲基化水平平均值为0.446 64,NSCLC患者为0.489 150,差异明显。结论:成功构建了焦磷酸测序技术联合甲基化敏感性内切酶分析全基因组DNA甲基化水平的方法。该方法适合于样本的高通量分析,为临床检测全基因组DNA甲基化状态、肿瘤早期诊断提供了新思路。     

采用比较基因组杂交方法分析原发性食管癌染色体异常

背景与目的:有研究表明原发性食管癌常有染色体的改变,包括染色体基因组异常扩增和缺失.比较基因组杂交技术可以显示这些染色体的异常变化.本实验采用比较基因组杂交技术研究和分析原发性食管癌染色体基因组的变化特点及其与预后的关系.方法:采用比较基因组杂交技术检测16例食管癌组织中染色体的异常改变,并分析染色体异常与预后的关系.研究的病例中7例食管癌术后2年内死亡(对照组),9例术后生存3年以上(生存组).结果:食管癌患者中多数染色体基因组发生改变,最常见的染色体基因组高扩增频率发生在1q/p,2q/p,3q,5q/p,8q/p,9q/p,11q/p,17和20q/p染色体区段上,在染色体1q/p,4p,9p,18q和xp中常见染色体基因缺失.染色体7q/p和19扩增频率和染色体4q/p和18q缺失频率,生存组与对照组间存在显著性差异.结论:食管癌患者染色体区段基因易发生异常扩增和缺失,生存组与对照组存在明显差异.     

宫颈癌组织中DNA聚合酶β基因突变研究

目的 :DNA聚合酶β(DNApolymeraseβ)是一种修复酶 ,在哺乳动物细胞中参与DNA的合成和修复的某些过程 ,其缺陷发现与一些肿瘤的发生有关。本研究从分子生物学基础上阐明宫颈癌的发生机理 ,了解有无DNA聚合酶β基因突变。 方法 :采用RT PCR法 (逆转录 DNA聚合酶链反应 )、PCR SS CP (聚合酶链 单链构象多态性分析 ) DNA序列分析法进行OPLB基因突变调查。结果 :宫颈癌组织中存在DNA聚合酶β基因突变。测序结果表明DNA聚合酶β基因的第 6 6 0位核苷酸由A变为G ,其氨基酸变异为第 182位氨基酸由精氨酸 (Arg)变为甘氨酸 (Gly)。结论 :宫颈癌中存在DNA聚合酶 β基因突变现象 ,可能与宫颈癌的发生发展相关     

骨肉瘤中RUNX2基因拷贝数扩增及其蛋白过表达的研究

  目的  通过微阵列-比较基因组杂交(aCGH)和免疫组织化学技术(IHC), 检测RUNX2基因在骨肉瘤组织中的拷贝数变化及蛋白表达情况, 探讨RUNX2基因在骨肉瘤的发生、发展和预后中的作用。  方法  应用aCGH检测10例新鲜骨肉瘤组织样本RUNX2的基因拷贝数变化; 同时, 运用免疫组织化学技术检测59例福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)骨肉瘤组织中RUNX2蛋白表达水平。  结果  10例骨肉瘤样本中发现3例(30%)RUNX2基因扩增; RUNX2蛋白在59例骨肉瘤组织中的阳性表达率为50.8%(30/59)。RUNX2蛋白的表达水平与患者的临床病理特征和生存率无相关性, 差异无统计学意义(P > 0.05)。Kaplan-Meire单因素生存分析显示pTNM分期、病理诊断、复发、转移和综合治疗对患者的无病生存率有显著影响, 性别、pTNM分期、新辅助化疗和疾病转移对患者的总生存率有显著影响, 均有统计学意义(P < 0.05), 但Cox模型多因素生存分析显示这些因素均不能作为生存率独立的预测因素。  结论  RUNX2基因扩增、蛋白过表达以及蛋白的表达与骨肉瘤患者的临床特征和预后无相关性提示RUNX2基因扩增及其蛋白的过度表达可能是骨肉瘤发病的早期事件。      

乙酸镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析

背景与目的：检测乙酸镍对基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。材料与方法：采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术来对经乙酸镍在诱导人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶变细胞中的基因组不稳定性进行分析。结果：本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带，条带数在1～6条之间。7条引物中第4、7两条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余五条引物均有差异，对于同一随机引物它们都具有特异的带型。结论：乙酸镍能诱发16HBE细胞基因组不稳定。     

食管鳞癌DNA含量及c-myc基因扩增与预后的关系

我们应用流式细胞分析术(ＦＣＭ)、图像细胞分析术(ＩＣＭ)的ＤＮＡ含量测定和ｃｍｙｃ基因ＰＣＲ扩增,对41例食管鳞癌石蜡标本进行了回顾性预后指标研究,现报告如下。一、材料与方法随机检测1979～1984年我院食管鳞癌行单一手术的标本41例。其中男性29例,女性12例。年龄35～72岁,平均518岁,术后生存5年以上者14例,占341%。应用ＦＣＭ和ＩＣＭ,按常规方法分别测定41例食管鳞癌细胞的ＤＮＡ含量。按文献报道方法,应用ＰＣＲ技术,检测41例标本的ｃｍｙｃ基因扩增。全部资料用χ2检验和ｔ检验。二、结果ＦＣＭ检测结果显示,二倍体肿瘤11例(268%…     

PHA对CIK细胞体外扩增影响的研究

目的:观察植物血凝素PHA对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkillercells,CIK)体外扩增的影响。方法:在外周血单个核细胞定向诱导CIK细胞时加或不加PHA,观察细胞增殖的变化,流式细胞仪检测细胞的免疫表型,MTT法测定细胞的杀伤活性。结果:PHA能明显提高CIK细胞的扩增倍数及体外杀伤活性,P=0.041。结论:为CIK细胞的过继性免疫治疗提供一种新方法。     

肺癌的全基因组关联研究进展

肺癌是世界范围内最常见的癌症,属于多基因疾病,即多个基因的变异共同参与发病.研究表明携带基因变异的个体比非携带者具有更高的患病风险性,故将这些基因称为"易感基因".     

iASPP对MCF-7细胞凋亡及基因组不稳定性影响的研究

目的:研究iASPP基因全长(iASPP-FL)及iASPP基因短型剪接体(iASPP-SV)对肿瘤细胞凋亡及基因组不稳定性的影响.方法:用iASPP-FL及iASPP-SV表达载体转染MCF-7细胞,筛选稳定表达目标蛋白的单克隆细胞株,分别进行137铯照射及依托泊苷处理,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,并通过碱性单个细胞凝胶电泳(彗星实验)及H2AX 蛋白表达水平变化分析细胞是否存在基因组不稳定性.结果:稳定表达iASPP-FL及iASPP-SV的MCF-7细胞株在受到200 μg/mL Vp-16处理后,相对于转染空载体组的早期凋亡率为(42.70±2.38)％,晚期凋亡率为(28.94±1.38)％,SV1和SV2细胞早期凋亡率分别下降为(24.40±1.12)％和(17.52±1.08)％,晚期凋亡率分别下降为(18.78±0.95)％和(19.58±1.04)％;但是H2AX蛋白水平升高分别达到转染空载体组的1.48、2.10倍.FL1和FL2细胞早期凋亡率分别为(14.22±0.68)％和(15.82±0.74)％,晚期凋亡率分别为(11.16±0.88)％和(9.88±0.56)％,均比转染空载体组的(31.22±1.64)％和(36.90±2.08)％明显下降;H2AX蛋白水平升高分别达到转染空载体组的2.09和1.99倍.4 Gy137铯照射后,SV1和FL1细胞早期凋亡率分别为(6.42±0.24)％和(7.05±0.24)％,细胞晚期凋亡率分别为(15.10±0.50)％和(15.14±0.58)％,均显著低于转染空载体组的早期凋亡率(16.56±0.81)％和晚期凋亡率(29.08±1.55)％.彗星实验也显示,在遭受DNA损伤后iASPP-FL及iASPP-SV细胞株比对照组存在更加明显的彗星拖尾现象.结论:iASPP基因可以抑制MCF-7细胞受到放射和药物作用后发生的凋亡,但是细胞DNA双链断裂损伤增加,细胞群体中保留DNA损伤的细胞比例增加,可能会导致基因组不稳定性持久存在并累积,导致恶性肿瘤的发生发展.     

线粒体基因组与肺癌的相关研究进展

肺癌的发生需要多因素、多基因参与，并经历多步骤、多阶段，在各个阶段中有不同癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活。既往的研究主要集中在细胞核遗传系统的部分基因与肺癌发生、发展的相关关系上，并在肺癌病因学和治疗学等方面取得了显著的成就。由于线粒体基因组的发现，近年来关于线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)与恶性肿瘤的关系研究得到了快速发展。本文就线粒体基因组与肺癌的相关研究进展作一概述。     

肺癌组织基因组DNA异常甲基化的检测与分析

背景与目的对肺癌组织基因组DNA异常甲基化进行筛选与分析,探索肺癌发病的表遗传致癌机制。材料与方法从肺癌和癌旁组织中分别提取基因组DNA,经Mse1(甲基化非敏感性酶)单独消化或Mse1和BstU1(甲基化敏感性酶)联合消化,消化产物用甲基化敏感性内切酶指纹法(PCR-basedtechnique-Methylation-sensitiveRestrictionFingerprinting,MSRF)进行分析,肺癌组织出现异常甲基化基因片段,进一步将异常甲基化DNA片段进行亚克隆和序列测定,再与基因文库中的基因进行类比分析,同时按年龄、性别及吸烟状况分组并分析其与肺癌DNA异常甲基化的关系。结果84.5%(49/58)的肺癌样本出现异常甲基化现象,但肺鳞癌(82.1%)与肺腺癌(88.5%)的异常甲基化率差异无统计学意义(χ2=0.073,P>0.05);在异常甲基化DNA片段中,高甲基化现象占83%,低甲基化为17%,发现2条重要的高甲基化基因片段,它们分别与抑癌基因WT-1(Wilm'stumorsuppressorgene)和细胞周期调控基因CCNC(humancyclinCgene)匹配;经统计学分析,吸烟、年龄和性别与肺癌DNA异常甲基化无关。结论基因组DNA的异常甲基化,特别是高甲基化现象,可能在肺癌发生发展中起重要作用,这可能是肺癌发病的表遗传机制。     

基因组的监视器：组蛋白H2AX

组蛋白H2A变体H2AX在离其肽链C端4个氨基酸处存在一个高度保守的丝氨酸残基（Ser139），DNA双链断裂（DSB）一经产生，该残基便能迅速被磷酸化，形成γH2AX。γH2AX识别抗体是探测DSB存在的金标准；H2AX在细胞周期关卡中起重要作用，H2AX/细胞不能正确停止在G2期并进入有丝分裂期；H2AX的丧失不影响V(D)J重排，但有效的类型转换重组需要H2AX；H2AX还在细胞分裂中起重要作用。总之，H2AX是基因组的监视器，DNA损伤一旦发生，H2AX的磷酸化即会被启动，然后招募更多的修复因子共同修复DNA损伤；H2AX在抑制基因组不稳定和癌症放疗疗效预测方面具有一定的作用。     

乳腺癌线粒体基因组控制区突变的研究

目的:通过测定乳腺癌线粒体基因组控制区突变的频率和分布,探讨其在肿瘤发生中的作用。方法:提取30例乳腺癌患者的癌及癌旁正常组织细胞总DNA,PCR扩增线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)基因组控制区D-loop区,单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)筛查突变标本,基因测序分析突变。结果:在30例乳腺癌组织中9例(30%)乳腺癌共发现14个新的突变位点,其中6例在多聚胞嘧啶区(D310区)的311~313位点出现了CC或CCC删除。结论:乳腺癌线粒体DNA显示了高频率的D-loop区的突变,D310区是点突变、插入/缺失突变的热点。D-loop区尤其是D310区的变化在肿瘤的形成中可能扮演了重要角色。     

贲门癌mdm2 基因扩增及蛋白表达的研究

 目的 检测贲门癌组织中mdm2基因扩增及蛋白表达，探讨其在贲门癌发生发展中的作用，分析其临床病理意义。方法 用dPCR技术检测贲门癌组织mdm2基因扩增；用免疫组织化学技术及流式细胞术检测mdm2蛋白表达水平。结果 该组标本中18．42％有mdm2基因扩增，64．86％有mdm2蛋白过表达，其mdm2表达FJ值（1．45±0．34）明显高于正常黏膜组织的FJ值（1．00±0．13，P〈0．05）。高中分化的贲门癌组织，mdm2基因扩增率及蛋白表达水平均较低分化者高（33．30％Vs5．00，80．00％VS47．06％，P〈0．05）。结合该组标本此前已检测的p53基因突变和蛋白表达结果发现，两种基因及蛋白表达异常在本组标本中的分布有不重叠趋势。结论 dm2基因扩增和过表达是贲门癌较常见的分子改变，并可能通过抑制野生型p53基因功能参与贲门癌形成；有mdm2扩增及表达的贲门癌组织分化程度较高，提示预后较好。     

胃癌,大肠癌中c—myc癌基因的扩增及临床意义

17例胃癌、22例大肠癌及癌旁组织经PCR扩增及电泳带激光扫描测定c－myc基因改变。其中，胃癌癌组织c－myc扩增29．14％，癌旁组织组织扩增30．77％；大肠癌癌组织c－myc扩增45．45％，癌旁组织为37．5％。c－myc扩增多发生在低分化癌中。提示肿瘤分化和c－myc基因扩增之间存在着一定的相关性。组织分化愈差，c－myc扩增比率愈高。因此，c－myc扩增情况可以作为判断预后又指导治疗的指标。     

全基因组关联分析在消化道肿瘤中的研究进展

正0引言全基因组关联分析(genome-wide associationstudy,GWAS)是一种对全基因组范围内的常见遗传变异——单核苷酸多态性(single nucleotide poly-morphism,SNP)和拷贝数变异(copy number vari-ation,CNV)进行总体关联分析的研究方法。它基于DNA是可遗传的且和临近的等位基因从上一代传递给下一代这一理论。国际人类基因组测序完     

食管癌的全基因组关联研究进展

摘 要：基因—环境和基因—基因交互作用在食管癌发生发展中起着重要作用。全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)已发现一些与食管癌相关的易感位点和区域,为食管癌的预防和诊治提供了新的思路和方向。文章对近几年来关于食管癌的GWAS进展进行综述,分析GWAS在食管癌研究中的优点和应用前景。     

人直肠及其癌组织DNA的RAPD多态性分析

目的：研究细胞癌变后DNA结构的改变与寻找与癌变有关的DNA片段，方法：采用AP－PCR方法扩增直肠癌及其癌旁和正常组织DNA，结果：引物E1（5′CGGCCCCTGT3′）对直肠癌，癌旁组织和正常直肠组织的DNA扩增产物的电泳图谱表现出多态性，而且分别得到直肠癌组织特异的DNA片段K851和正常直肠组织特异的DNA片段K1072，K776。结论：直肠细胞癌变后DNA结构在引物E1序列处发生了改变，DNA片段K851，K1072和K776可能与细胞癌变有关。     

稀土镧离子对大肠杆菌基因组DNA的影响

背景与目的: 通过研究硝酸镧溶液对大肠杆菌基因组DNA的作用,探讨稀土镧离子对原核生物的遗传毒性效应。 材料与方法: 用含硝酸镧分别为10、40、80、160、320 mg/L的LB培养基培养大肠杆菌,以不添加硝酸镧组作为对照,于培养10 h,15 h和20 h后分别采样提取总DNA,琼脂糖凝胶电泳; 并用含硝酸镧分别为50、200、400、800、1 600 mg/L的LB培养基培养大肠杆菌, 未添加硝酸镧组作为对照, 于培养30 h后分别采样提取总DNA,琼脂糖凝胶电泳。 结果: 高剂量镧离子组大肠杆菌基因组DNA出现降解或交联现象,电泳带型荧光减弱,不清晰或滞留于点样孔不能泳出。 结论: 镧离子对大肠杆菌基因组DNA可能具有降解或交联作用。