视网膜母细胞瘤组织直接免疫制备抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体及其抗原特性的实验研究

目的 研究新鲜视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb)细胞制备的抗人Rb单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb)的抗原特性。方法 利用手术中获得的新鲜Rb组织细胞制备成细胞悬液,并将其注射入3呈BALB－C小鼠腹腔中,免疫小鼠。取其脾淋巴细胞与SP2／0骨瘤细胞融合,以抗原的性质进行检测,观察McAb相应抗原蛋白在Rb组织中的表达。结果 经反复单细胞克隆化操作及抗体特异性筛选,共获得3株能持续,稳定分泌抗人Rb McAb的杂交瘤细胞系。其中3C6株杂交瘤细胞在体外经≥2年反复冻存,传代培养,仍能稳定分泌特异性强,效价高的抗体,为IgG1亚类。免疫荧光及免疫组化检测结果显示,McAb3C6相应抗原蛋白在Rb组织中呈强阳性表达,而在其他肿瘤及正常组织中无表达。免疫印迹法检测表明,McAb3C6相应抗原蛋白相分子质量约25000。结论 采用新鲜的实体瘤细胞制备的抗人Rb McAb 3C6在Rb组织中呈高度特异性表达,与其他肿瘤及正常眼组织无交叉反应,其所针对的抗原蛋白相对分子质量约为25000,提示可能有新的基因参与Rb肿瘤的发生。     

视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb44放射敏感性研究

对人视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb₄₄放射敏感性研究，发现经3Gyγ射线照射后，细胞生长明显受抑制。集落形成法与MTT法都显示该细胞系有较好的放射敏感性。乏氧可使该细胞系放射抗性增加，亚致死性损伤修复能力减弱，氧增比（OER）为2.77~3.01。 （中华眼底病杂志，1994，10：217-219）     

视网膜母细胞瘤的S—抗原免疫活性研究

应用牛视网膜可溶性抗原的一株单克隆抗体－ＡｇＣ６对１０例中国人视网膜母细胞瘤进行了免疫组织化学研究。Ｓ－抗原的免疫活性以不同的形式存在于此１０例肿瘤标本中。有３例嵌顿于肿瘤的“正常“视网膜光感受器成分中，显示Ｓ－抗原免疫活性。７５％的花环样、Ｅ－Ｗ玫瑰花环及５０％病例的散在肿瘤细胞呈阳性染色。我们认为Ｓ－抗原在视网膜母细胞瘤中的表达程度可以作为检测该肿瘤分化程度的依据之一，成为其另一肿瘤标记。     

视网膜母细胞瘤抗原致敏的树突状细胞疫苗抗SO-RB50细胞系的实验研究

目的　研究视网膜母细胞瘤 (RB)抗原致敏的树突状细胞 (DC)疫苗体外特异性对RB细胞系SO RB50 杀伤作用 ,为进一步研究RB的治疗提供新的思路。方法　以RB细胞的蛋白抗原体外冲击致敏健康人 (正常对照组 )及RB患者 (患者组 )来源的成熟DC ,并将其与自体T细胞混合培养 ,诱导出抗SO RB50 的特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) ,以Burkitt淋巴瘤Raji细胞作为对照靶细胞 ,采用噻唑蓝 (MTT)分别比较CTL对SO RB50 和Raji细胞的杀伤率及正常对照组与RB患者组来源特异性杀伤率的组间差异性。结果　对SO RB50 与Raji 2种靶细胞 ,正常对照组和RB患者组的CTL细胞毒作用均随着效靶比的增加而增加 ,对SO RB50 细胞的杀伤作用各效靶比均强于相应效靶比的Raji细胞(P <0 .0 1) ;各效靶比正常对照组CTL对SO RB50 细胞的特异性杀伤作用均显著强于RB患者组CTL(P <0 .0 1) ;而各效靶比正常对照组与RB患者组CTL对Raji细胞的非特异性杀伤作用则相近 ,两者比较 ,差异无显著意义 (P >0 .0 5 )。结论　应用RB抗原负载DC可诱导出针对SO RB50 细胞抗原特异性的CTL ,这种方法对RB的治疗可能具有潜在的临床应用价值。     

PCR扩增抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体轻链可变区基因

目的：获得抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体轻链可变区基因。方法：从分泌抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,逆转录形成cDNA,用扩增小鼠K轻链可变区基因的引物,通过RT－PCR方法,扩增基因,1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：用轻链引物扩增获得340bp的基因片段。结论;从三株杂交瘤细胞中获得高纯度的总RNA;用RT－PCR方法从一株杂交瘤细胞成功克隆了抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体轻链可变区基因,为基因工程抗体研究奠定了良好基础。     

视网膜母细胞瘤的S－抗原免疫活性研究

应用牛视网膜可溶性抗原的一株单克隆抗体－ＡｇＣ＿６对１０例中国人视网膜母细胞瘤进行了免疫组织化学研究。Ｓ－抗原的免疫活性以不同的形式存在于此１０例肿瘤标本中。有３例嵌顿于肿瘤的“正常”视网膜光感受器成分中，显示Ｓ－抗原免疫活性，７５％的花环样、Ｅ－Ｗ玫瑰花环及５０％病例的散在肿瘤细胞呈阳性染色。我们认为Ｓ－折原在视网膜母细胞瘤中的表达程度可以作为检测该肿瘤分化程度的依据之一，成为其另一肿瘤标记。     

视网膜母细胞瘤增殖细胞核抗原表达的研究

目的 :探讨增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen ,PCNA)在视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma ,Rb)中的表达及其与Rb病理类型和侵犯视神经情况的关系。方法 :用免疫组化技术检测PCNA在 3 7例Rb组织标本中的表达 ,并应用多功能真彩色病理图像分析系统 (CMIAS系列 )来分析PCNA染色的阳性细胞个数 ,采用积分光密度值定量分析其增殖指数 ,并将各指标进行SPSS统计软件相关性分析。结果 :本组 3 7例Rb标本中PCNA的阳性表达为 97 3 0 % ,而在 2例正常视网膜组织内 (对照组 )的表达均为阴性。PCNA的表达水平与Rb不同的分化、增殖程度有显著的统计学差异 (P <0 0 1) ,Rb侵犯视神经情况越严重、分化程度越差 ,PCNA的表达越强。结论 :Rb中PCNA的高表达可作为判断Rb恶性及其程度的新型标记物。PCNA与Rb分化类型、视神经侵犯情况密切相关 ,为PCNA表达水平反映Rb分化程度和增殖能力提供理论依据     

抗人视网膜母细胞瘤单克隆抗体轻链可变区基因克隆、测序

肿瘤免疫导向治疗中与抗癌药物、放射性核素偶连的载体单克隆抗体 (monoclonal antibody ,Mc Ab)的异源性问题是束缚肿瘤免疫导向治疗临床应用的主要障碍 ,异源 Mc Ab的人源化改造是肿瘤免疫导向治疗研究的重点和难点[1 ] 。目前 ,抗视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma,RB) Mc Ab基因人源化研究尚未见报道 ,现将我们这方面的部分研究结果报道如下。1　材料和方法分泌小鼠抗人 RB Mc Ab的杂交瘤细胞株 3C6由本病理室制备 ,Mc Ab亚型为 Ig G2 a。实验中所需要的酶类及测序载体p GEM - T Easy等为美国 Promega公司产品。 TRIZOL试剂购…     

视网膜母细胞瘤CD44基因产物表达及临床意义

研究表明ＣＤ４４基因是与人类肿瘤转移密切相关的癌基因,与多种肿瘤组织的分化、浸润能力和患者预后等有显著相关［１－５］。我们采用流式细胞技术和免疫荧光技术,检测了ＣＤ４４基因产物在视网膜母细胞瘤（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ,ＲＢ）组织的表达情况并对其...     

小干扰RNA技术下调视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中Survivin基因表达的研究

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术沉默视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50中凋亡抑制因子Survivin的表达,观察其干扰效果及对细胞的影响.方法 实验研究.体外化学法合成针对人Survivin基因的特异性小干扰RNA(siRNA)和对Survivin基因无沉默效果的阴性对照siRNA,利用转染试剂分别将siRNA转入SO-Rb50细胞株,通过半定量RT-PCR和Western blot检测其对SO-Rb50细胞中Survivin基因和蛋白表达的抑制作用,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度siRNA对细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率和细胞周期改变,荧光显微镜下观察细胞凋亡形态.对多组间数据比较采用单因素方差分析,处理组与对照组比较采用Dunnett-t检验.结果 Survivin特异性siRNA转染细胞24 h后Survivin mRNA和蛋白表达水平明显下调,对照组中其表达则无明显改变.MTT法结果显示Survivin特异性siRNA浓度为35、70、100 nmol/L时均对SO-Rb50细胞增殖具有抑制作用(P＜0.05),且具有剂茸依赖性.流式细胞仪检测发现Survivin特异性siRNA组出现凋亡亚二倍体峰,细胞被阻滞于G0/G1期,较对照组增加了8.11%,G2/M期细胞比例减少了5.75%,S期细胞仅减少了2.26%.荧光显微镜下可见部分细胞出现染色质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡形态学变化.结论 针对Survivin的RNA干扰技术可有效地下调SO-Rb50细胞中Survivin基因表达,进而抑制SO-Rb50细胞增殖和诱导其凋亡,为视网膜母细胞瘤的基因治疗提供了重要的途径.     

抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体治疗实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎的研究

目的 观察抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体（TNF-α MCAb）对于实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）的治疗作用。方法 合成光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）R16多肽片段，联合免疫佐剂诱导EAU动物模型。按照注射次数不同将大鼠分为2组，分别于IRBP R16免疫后的第6天和第4、6、8天自大鼠尾静脉注入TNF-α MCAb，裂隙灯显微镜观察其眼部临床表现，同时设未治疗组大鼠作为对照。于IRBP R16免疫后第13天测量迟发型超敏反应（DTH），并于第14天处死大鼠，取眼球行组织病理检查。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体注射后14 d 时大鼠血清中Th1类细胞因子γ-干扰素（IFN-γ）、Th2类细胞因子白细胞介素-4（IL-4）水平以及房水中IFN-γ水平。测量引流淋巴结细胞的抗原特异性淋巴细胞增生反应。结果 TNF-αMCAb治疗组大鼠的眼部炎症较未治疗组明显减轻，病理分级下降；房水和血清中IFN-γ水平降低，血清中IL-4增高；DTH反应下降；引流淋巴结细胞对IRBP R16多肽刺激的增生反应下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与单次注射相比，3次注射的治疗效果更显著（P＜0.05）。结论 TNF-αMCAb能够有效减轻EAU大鼠眼部的炎症反应和特异性细胞免疫反应，改变Th1/Th2细胞因子平衡；多次应用作用更显著。     

单克隆抗体在治疗视神经脊髓炎谱系疾病中的临床应用进展

视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)是一类主要累及视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,由于其严重的致盲性和致残性,如何有效预防复发成为眼科医师考虑的重点。随着对NMOSD发病机制的深入了解和科技手段的进步,越来越多的单克隆抗体(mAb)不断进入临床试验研究,其中B细胞表面抗原CD20阻断剂利妥昔单抗已成为治疗NMOSD的一线药物,CD19阻断剂inebilizumab可降低NMOSD患者复发,减轻疾病致残;免疫治疗的基础上附加白细胞介素6受体阻断剂satralizumab、补体C5抑制剂eculizumab可降低复发;而纳他珠单抗、阿仑单抗等部分mAb可能对NMOSD的治疗无效。有关mAb治疗适应证的拓展及新药的上市仍需开展大规模、国际间的合作与更多的临床试验,同时其潜在的不良事件及费用问题不容忽视。     

精子蛋白32/OY-TES-1在视网膜母细胞瘤中的表达

　　目的　观察精子蛋白（SP）32/OY-TES-1在视网膜母细胞瘤(RB)组织中的表达。方法　病理科收检并经病理学检查确诊的30例RB患儿的石蜡标本纳入研究。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测15例RB组织、12例非肿瘤病变视网膜组织及22例眼部正常组织中SP32/OY-TES-1 mRNA的表达;免疫组织化学技术对30例RB组织和24例正常视网膜组织中SP32/OY-TES-1蛋白的表达进行检测,对比分析SP32/OY-TES-1 mRNA和蛋白表达与RB患儿年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度和临床分期的相互关系。结果　RB组织、非肿瘤病变视网膜组织、眼部正常组织SP32/OY-TES-1 mRNA的表达率分别为86.7%、16.7%和36.4%。不同性别（χ²=0.744）、年龄≤2岁和＞2岁（χ²=1.178）、临床分期（χ²=1.188）、肿瘤大小（χ²=0.216）、肿瘤分型（χ²=1.885）之间SP32/OY-TES-1基因阳性表达率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。SP32/OY-TES-1蛋白在RB中的表达率为73.3%,在正常视网膜组织中则不表达。不同性别（χ²=1.000）、年龄≤2岁和＞2岁（χχ²=0.403）、不同肿瘤大小（χ²=2.274）、不同肿瘤分型（χ²=0.138）之间SP32/OY-TES-1蛋白阳性表达率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;不同临床分期（χ²=6.193）、视神经是否浸润（χ²=4.535）之间SP32/OY-TES-1蛋白阳性表达率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　SP32/OY-TES-1高表达于RB组织中;SP32/OY-TES-1蛋白在RB组织中的表达率与视神经浸润和临床分期存在密切的关系。      

抗血管内皮生长因子bevacizumab兔眼玻璃体腔重复注射的安全性研究

目的　观察抗血管内皮生长因子bevacizumab（商品名Avastin）兔眼玻璃体腔重复注射的眼内安全性。方法 14只青紫兰兔分为3组,其中12只兔的右眼设为实验组,左眼设为实验对照组,2只兔为正常对照组。实验组右眼予以25 mg/ml的bevacizumab玻璃体腔注射,实验组根据不同注射剂量分为2.5、5.0 mg 2个剂量组,左眼分别注射等剂量0.9%生理盐水作为实验对照。玻璃体腔共注射3次,每次间隔2周。每次注射前、注射后2 d,第3次注射后1、4周采用裂隙灯显微镜、+90 D前置镜、B型超声、超生生物显微镜（UBM）、光相干断层扫描（OCT）进行临床指标观察,视网膜电图（ERG）和闪光视觉诱发电位（F-VEP）进行视网膜功能检测。第3次注射完毕后1、4周分别摘取眼球进行病理组织学观察和凋亡细胞检测。结果　所有实验眼和实验对照眼均未见明显炎症反应,各组眼底未见明显异常,玻璃体无混浊、出血。B型超声、UBM和OCT检查均未见明显改变。注射前后不同剂量实验组与实验对照组、正常对照组眼压、前房闪辉计数比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。不同剂量实验组与注射前、实验对照组、正常对照组最大反应ERG a、b波比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。注射前后,F-VEP N₁波潜伏期和P1波振幅各组差异均无统计学意义(P＞0.05)。光学显微镜观察发现,不同剂量实验组第3次注射后1 周玻璃体腔可见少量炎症细胞,注射后第4周未见炎症细胞;实验对照组和正常对照组注射前后视网膜组织形态未见明显改变。5.0  mg实验组第3次注射后1周电子显微镜下可见炎症细胞,个别视细胞细胞核呈空泡样改变,其余未见明显异常。凋亡细胞计数显示,第3次注射后1周,5.0 mg实验组与2.5、5.0 mg实验对照组（Z=0.227）和正常对照组（Z=1.341）组间凋亡细胞数量比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）,第3次注射后4周,各组差异无统计学意义（χ2=4.826,P>0.05）。结论　5.0 mg bevacizumab在兔眼玻璃体腔多次注射视网膜有一定轻微毒性反应。     

抗血管内皮生长因子单克隆抗体bevacizumab抑制大鼠脉络膜新生血管

目的　观察玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体bevacizumab（商品名Avastin）抑制激光诱导的实验性脉络膜新生血管（CNV）的效果及特点。方法　12只雄性棕色挪威（BN）大鼠平均分为bevacizumab组和对照组,每组6只。每一只大鼠随机选取1只眼为实验眼,采用半导体激光围绕其视盘激光光凝8点后,bevacizumab组和对照组玻璃体腔立即分别给予2.00 μl bevacizumab和乳酸林格注射液。激光光凝后7、14、21 d两组行荧光素眼底血管造影（FFA）和吲哚青绿血管造影（ICGA）动态观察CNV的形态及渗漏情况。激光光凝后21 d摘除实验眼作石蜡切片行苏木精-伊红染色,比较两组CNV的高度,同时行VEGF免疫组织化学染色,观察CNV斑块中VEGF的表达情况。结果　激光光凝后7 d,ICGA检查结果显示,bevacizumab组和对照组均有CNV生成。FFA检查结果显示,bevacizumab组的渗漏强度始终比对照组弱,但bevacizumab组渗漏强度随时间推移逐渐增强。bevacizumab组CNV平均厚度比对照组低。免疫组织化学检查结果显示,bevacizumab组VEGF表达阴性。结论　激光光凝后立即玻璃体腔注射2.00 μl bevacizumab可以降低CNV厚度并抑制其渗漏,但不能阻止CNV的生成,抑制CNV渗漏的效果不能长时间保持。     

关注抗血管内皮生长因子药物治疗眼部新生血管疾病的潜在风险

抗血管内皮生长因子（VEGF）药物为眼部新生血管疾病的治疗开辟了新的途径,其有效性和安全性也已经为大量研究工作所证实。但在临床实践中,长期、大剂量的应用抗VEGF药物同时也会带来一些新的问题和并发症,甚至会影响正常眼组织血管生成过程和视网膜的血液供应。因此,必须重视过度抗VEGF治疗眼部新生血管疾病带来的问题和潜在风险。     

角膜内皮抗原及其抗体的提纯

目的；提纯角膜内皮抗原（corneal enodothelial antigen,CEN-Ag）及抗角膜内皮抗原抗体（anti-corneal endothelial atibody,ACEN-Ab），为角膜移植排斥反尖的理论研究提供基础。方法：用猪角膜内皮做抗原，上皮做对照。经离子交换层及2B4．14．1单克隆抗体亲和层析制得纯化的CEN－Ag和角膜上皮抗原（corneal epithelial antigen,KCEP-Ag），用提纯的CEN－Ag和CEP－Ag分别免疫家兔，取血清经亲和层析得到ACEN－Ab和抗角膜上皮抗原抗体（anti-corneal epithelial antibod,ACEP-Ab）。结果：经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析，抗原分子质量分别为43kD和53kD，相应的免疫球蛋白是IgG2和IgG3。结论：CEN－Ag和ACEN－Ab可以被提纯并从理论上证明，不同的角膜抗原和抗体穿透房水屏蔽的能力有所不同和角膜排斥反应的临床分型是正确的。     

贝伐单抗和雷珠单抗治疗渗出型老年性黄斑变性有效性meta分析

目的 系统评价贝伐单抗和雷珠单抗治疗渗出型老年性黄斑变性（AMD）的有效性。方法 计算机检索荷兰医学文摘数据库Embase、美国临床医学期刊全文数据库Ovid、美国国立医学图书馆医学数据库Pubmed、中国知网、万方数据库、维普中文期刊数据库。收集国内外公开发表的关于贝伐单抗和雷珠单抗治疗渗出型AMD的随机对照试验。检索时限截止至2013年11月。按照纳入与排除标准筛选文献、提取资料和进行质量评价。用RevMan 5.2.6软件进行统计分析。比较贝伐单抗和雷珠单抗治疗前与治疗后3、6、12个月渗出型AMD患者的视力和黄斑中心凹厚度。结果 最终纳入5个研究,共1954例渗出型AMD患者。其中,贝伐单抗治疗组967例,雷珠单抗治疗组987例。Meta分析结果显示,贝伐单抗治疗组与雷珠单抗治疗组视力提高值比较,差异无统计学意义［3个月：加权均数差（WMD）=0.32,95%可信区间（CI）为-0.84~1.49,P=0.59;6个月：WMD=0.47,95%CI为-0.67~1.62,P=0.42;12个月：WMD=0.84,95% CI为-0.23~1.90,P=0.12］;贝伐单抗治疗组与雷珠单抗治疗组黄斑中心凹厚度降低值比较,差异无统计学意义（3个月：WMD=6.21,95%CI为-6.23~18.65,P=0.33;6个月：WMD=4.06,95% CI为-6.16~14.27,P=0.44;12个月：WMD=-5.39,95%CI为-14.41~3.63,P=0.24）。结论 贝伐单抗与雷珠单抗治疗渗出型AMD具有相似的治疗效果。