siRNA对K562和K562/ADM细胞耐药和凋亡的调节

目的 研究联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,对白血病细胞株K562和耐药的K562/ADM细胞药物敏感性和凋亡的影响.方法 体外化学合成以多药耐药相关蛋白(MRP)和bcl-2为靶标的siRNA,分别或联合用脂质体转染人阿霉素处理的K562和K562/ADM以单纯化疗处理组和未处理组为对照.转染后24、48、72 h,MTT法检测各组细胞生长抑制率,计算IC50值.转染24 h后RT-PCR检测各组细胞相应靶基因mRNA表达水平,48 h后流式细胞仪检测细胞MRP和bcl-2蛋白表达率和细胞凋亡率.结果 K562/ADM细胞ADM的IC50为12.81 μg/ml,ADM MRP-siRNA组降为3.74 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为6.82 μg/ml ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA组降至2.51 μg/ml;K562细胞ADM的IC50为6.75 μg/dml,ADM MRP-siRNA组降为3.22 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为3.56 μg/ml,ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA降至1.84 μg/ml,有统计学意义(P<0.01).转染以MRP和bcl-2为靶标的siRNA后,细胞相应靶基因的mRNA及蛋白的表达明显减低,细胞凋亡率显著升高,联合转染两种siRNA,细胞的IC50进一步下降,细胞凋亡率进一步升高,与分别转染组相比有统计学差异(P<0.05);结论联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率.     

PTEN基因逆转白血病多因素多药耐药机制探讨

目的 研究分析野生型PTEN基因对多柔比星(阿霉素,ADM)耐药人红白血病细胞系K562/ADM多药耐药(MDR)逆转的作用机制.方法 将携带野生型PTEN基因的腺病毒载体(Ad-PTEN-GFP)或空载体(Ad-GFP)感染ADM耐药的K562/ADM细胞,流式细胞术检测感染效率,在感染3d内联合应用不同浓度的ADM、阿糖胞苷(Ara-C)或三氧化二砷(As2O3),通过MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,根据IC50计算药物逆转倍数,观察PTEN基因对上述化疗药物MDR逆转作用.同时采用荧光定量PCR检测PTEN、NF-kB、MDR1、MDR相关蛋白(MRP)及凋亡相关基因Bcl-2、BcbxL及Bax水平变化,蛋白质印迹检测PTEN、Akt、p-Akt、P65水平变化.结果 以感染复数为200感染第3天后,Ad-PTEN-GFP感染与化疗药物联合作用组K562/ADM细胞增殖抑制率、凋亡率均高于Ad-GFP与化疗药物联合作用组(P＜0.05),PTEN感染能增加K562/ADM对ADM、Ara-C、As2O3的敏感性,逆转倍数分别为3.80、2.65、2.64.与Ad-GFP组相比,Ad-PTEN-GFP感染K562/ADM细胞3d后p-Akt与P65蛋白表达下调,NF-kB、MDR1、Bcl-2、Bcl-xL mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调.结论 野生型PTEN基因可能通过抑制Akt信号转导通路进一步调控下游信号分子,通过下调NF-kB、MDR1、Bcl-2及上调Bax等多种信号分子逆转K562/ADM细胞的多药耐药.     

ABCA3在急性髓系白血病中的表达及其临床意义

目的 检测三磷酸腺苷结合盒转运体A3（ABCA3）基因在急性髓系白血病（AML）细胞中的表达,探讨ABCA3在AML耐药方面的作用及临床意义。 方法 ①应用半定量RT PCR检测33例初治、13例复发/难治成人AML患者及10例正常对照者骨髓单个核细胞ABCA3 mRNA的表达水平,并分析其在不同组间的表达规律;②将初治AML患者按化疗效果分为完全缓解组和未完全缓解组,比较两组间ABCA3的表达水平;③分析ABCA3与AML患者初诊白细胞数、免疫表型、FAB分型等临床特征之间的相关性。结果 ABCA3的表达水平：初治及复发/难治AML组均明显高于正常对照组（P均＜0.01）;复发/难治AML组高于初治组（P＜0.05）;完全缓解组低于未完全缓解组（P＜0.05）;慢性粒细胞白血病急变患者高于其他AML亚型（除M3外,P均＜0.05）。ABCA3的表达水平与AML患者初诊白细胞数、骨髓原始细胞百分数、免疫表型、性别及年龄无明显相关性。结论 ABCA3与AML患者的多药耐药及治疗、预后密切相关。     

RNA 干扰沉默同源异型基因A5 逆转K562/ADM 细胞耐药性的研究

目的 研究RNA 干扰（RNAi）技术沉默同源异型基因A5（HOXA 5）对白血病耐阿霉素细胞株K562/ADM 细胞耐药性的影响并探讨其机制。方法 Western blot 检测各组细胞中HOXA5、p38 和p-p38 的蛋白表达，qRT-PCR 检测HOXA5、p38 的mRNA 表达；CCK8 检测各组细胞对阿霉素的敏感性变化；流式细胞术（FCM）检测各组细胞的凋亡及周期变化。结果 K562/ADM 细胞中HOXA 5 基因的 表达高于K562 细胞，且其耐药性是K562 细胞的4.94 倍。转染后实验组K562/ADM 细胞中HOXA 5 基因的表达受抑制，而实验组细胞的IC50 较对照组降低2.55 倍。同时，实验组细胞中p38 的mRNA 及p-p38的蛋白表达高于对照组。与对照组比较，实验组的细胞周期G0/G1 期增高，S 期降低。经ADM（2.5μg/ml）诱导后，实验组细胞凋亡率高于对照组。结论 RNAi 沉默HOXA5 能在一定程度上逆转白血病耐药，其机制可能与p38MAPK 信号转导通路的激活有关。     

多药耐药相关蛋白-2在白血病耐药细胞株K562/A02的表达

目的:研究多药耐药相关蛋白-2（MRP-2）与白血病细胞耐药的关系,并探讨其在白血病多药耐药中的意义。方法：应用RT-PCR方法检测白血病细胞株K562与耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA的差异表达,然后将MRP-2反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染至耐药细胞株K562/A02,采用MTT法、流式细胞术及RT-PCR法检测转染后细胞内阿霉素的荧光强度、耐药指数及MRP-2 mRNA的表达情况。结果：耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA表达水平明显高于白血病细胞株K562（P<0.05）。MRP-2反义寡核苷酸片段转染后耐药细胞株K562/A02细胞内的阿霉素浓度升高,耐药指数较未转染细胞明显降低（P<0.05）;转染后耐药细胞株K562/A02细胞MRP-2 mRNA表达水平较未转染细胞下降了67.5%,两者比较差异具有显著性（P<0.05）。结论：MRP-2的高表达导致白血病耐药细胞内化疗药物浓度降低,可能是其导致白血病多药耐药的机制之一。     

急性髓性白血病LRP、Pg-p和MRP表达与多药耐药分型及临床研究

目的研究肺耐药相关蛋白(LRP)、P糖蛋白(Pg-p)和多药耐药相关蛋白(MRP)表达与急性髓性白血病(AML)患者多药耐药(MDR)的关系及其临床意义。方法将129例AML患者分为初治组和复发难治组，用免疫组化法检测患者骨髓或外周血单个核细胞中LRP、Pg-p和MRP表达。根据上述三种蛋白的表达情况将LRP或Pg-p或MRP单一表达阳性者定为：“单纯型”；将LRP或Pg-p或MRP两项以上阳性者定为：“混合型”，观察这种分型与临床疗效的关系。同时用MTT技术观察了白血病细胞对柔红霉素(DNR)的敏感性。结果在AML初治组中耐药蛋白表达阴性者的完全缓解(CR)率75．6％，而耐药蛋白表达阳性者CR率20．8％(“单纯型”21．1％，“混合型”20％)；在AML复发及难治组中，耐药蛋白表达为“混合型”者CR率15．4％，耐药蛋白表达为“单纯型”者CR率29．6％，“混合型”CR率低于“单纯型”。结论LRP、Pg-p和MRP均与耐药有关，这种“混合型”和“单纯型”耐药分类法，可以作为指导临床治疗和判断疗效的分类法。     

白血病耐药细胞中多药耐药基因MDR1与核转录因子κB的关系

目的:研究核转录因子κB与多药耐药基因MDR1在白血病化疗耐药中的作用,阐明核转录因子κB(NF-κB)与白血病多药耐药的关系及相关分子机制。方法：白血病细胞K562和阿霉素(ADM)诱导的耐药细胞K562/ADM分别应用ADM（0、0.25、0.50、1.00和2.00 μg·L^-1）或丝裂霉素(MIT)（0、2、4、8和16 mg·L^-1）　作用48 h,通过MTT法检测细胞生存率,计算细胞耐药指数;RT-PCR方法检测MDR1和IκB mRNA表达;Western blotting方法检测P-gp和P65的蛋白表达。结果：ADM和MIT分别作用后,与空白对照组比较,白血病细胞K562细胞生存率下降(P<0.01),呈剂量依赖性;ADM和MIT对耐药细胞K562/ADM生存率作用不明显;在mRNA水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的MDR1 mRNA高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00　 μg·L^-1>或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562细胞和K562/ADM细胞,IκBα mRNA表达均下降(P<0.01),并呈剂量依赖性;在蛋白水平上,与K562细胞比较,K562/ADM细胞的P-gp蛋白高表达(P<0.01)。与空白对照组比较,ADM 0.50和1.00 μg·L^-1或MIT 4和8 mg·L^-1分别作用K562/ADM细胞,P-gp蛋白表达量升高(P<0.01),同时P65蛋白表达量升高,且呈药物剂量依赖性(P<0.01)。结论：MDR1基因及P-gp蛋白的高表达很可能是白血病细胞K562多药耐药性形成的关键机制,而NF-κB的激活可能参与了多药耐药的调控。     

槲皮素对白血病细胞中膜转运蛋白的调节作用

目的 探讨槲皮素对白血病细胞中膜转运蛋白的调节作用。方法 通过四唑蓝(MTT)体外药敏法证明槲皮素对柔红霉素的增敏作用，作用于K562／ADM和HL-60／ADM耐药株及相应敏感株K562／S和HL-60／S，采用RT-PCR和流式细胞术检测多药耐药基因(Mdr1)和多药耐药相关基因1(MRP1)及其膜蛋白产物P-170糖蛋白(P-gP)和MRP1蛋白的表达情况。结果 终浓度为20～40umol／L的槲皮素在体外能明显提高柔红霉素对K562／ADM和HL-60／ADM耐药株的敏感性，并能下调Mdr1和MRP1基因及其膜蛋白产物P-gP和MRP1蛋白的表达，从而逆转多药耐药，且有效浓度范围的药物对细胞本身无毒性作用。结论 槲皮素有可能成为蒽环类药物治疗白血病中有效且低毒的化疗增敏剂。     

survivin mRNA表达水平与高三尖杉酯碱诱导恶性血液病细胞凋亡的相关性研究

目的：研究survivin mRNA在细胞株MUTZ-1、K562、Jurkat、RPMI、HL60的表达水平与高三尖杉酯碱（HHT）诱导的凋亡率的关系。方法：应用流式细胞仪技术，研究HHT诱导人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1、人急性红白血病细胞株K562、人淋巴瘤细胞株Jurkat和人骨髓瘤细胞株RPMI，以及人急性粒细胞白血病细胞株HL60细胞凋亡。用半定量逆转录酶-多聚酶链式反应，检测上述细胞株及HHT作用MUTZ-1细胞后凋亡蛋白抑制因子survivin、XIAP的表达。结呆：细胞株MUTZ-1、K562、Jurkat、RPMI、HL60均表迭survivin、XIAP mRNA，HHT能诱导各细胞株凋亡，HHT诱导的凋亡率与细胞株survivin mRNA表达呈负相关。结论：survivin在细胞中的表达水平可能直接影响细胞对化疗药物的敏感性，可作为预测细胞耐药的指标之一，同时也可能将成为肿瘤治疗的新靶向。     

选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398下调K562/ADM细胞MDR1/P-gp表达

目的 探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对白血病多药耐药K562/ADM细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法 以细胞K562/ADM为NS-398作用的靶细胞,MTT法检测细胞增殖活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因(MDRl)mRNA的表达;流式细胞仪(FCM)测定P-gp蛋白表达水平.结果 NS-398显著抑制K562/ADM细胞增殖,呈时间、剂量正相关效应;下调K562/ADM细胞MDRl基因表达并抑制P-gp合成,呈明显的剂量依赖关系.结论 COX-2抑制剂NS-398可在一定时间和剂量范围抑制白血病多药耐药K562/ADM细胞MDRl/P-gp表达,并能抑制K562/ADM多药耐药细胞增值.     

cAMP—依赖性蛋白激酶的提纯及活性测定

用ＤＥＡＥ－纤维素层析和羟基磷灰石层析方法,从牛心中提取了ｃＡＭＰ－依赖性蛋白激酶。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定分子量为３８ｋＤａ,并测定了其活性,为ｃＡＭＰ代谢途径的研究打下了基础。     

大鼠脾脏20S蛋白酶体的分离纯化及电镜观察

目的　分离纯化正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并观察其形态特征。方法　采用分级盐析、离子交换层析及凝胶过滤方法 ,分离纯化了正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并进行透射电镜观察。结果　所制备的2 0S蛋白酶体纯度较高 ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 1条带 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示 8条带 ,分子量为 ( 19.8～ 31.7)× 10 3;电镜观察显示 ,脾脏 2 0S蛋白酶体呈现典型的圆筒状 ,具有同其它细胞 2 0S蛋白酶体一样的形态特征。结论　这为进一研究 2 0S蛋白酶体结构与功能的关系奠定了基础。     

PTEN、Survivin蛋白在卵巢子宫内膜异位囊肿表达的相关性及临床意义

目的:探讨卵巢子宫内膜异位囊肿及正常子宫内膜组织中抑癌基因PTEN蛋白和凋亡抑制基因Survivin蛋白表达及其意义。方法:利用免疫组织化学二步抗法检测妇科手术切除的卵巢子宫内膜异位囊肿20例和正常子宫内膜20例中PTEN蛋白、Survivin蛋白的表达。结果:PTEN、Survivin蛋白在卵巢子宫内膜异位囊肿中的表达无明显周期性(P>0.05)。卵巢子宫内膜异位症中PTEN蛋白和Survivin蛋白的表达分别与正常子宫内膜表达比较,差异有统计学意义(P<0.05);PTEN蛋白、Survivin蛋白表达在卵巢子宫内膜异位症无明显相关性(P>0.05)。结论:PTEN蛋白;Survivin可能促进了子宫内膜异位症的发生、发展,两者可能独立发挥作用。     

C反应蛋白和高敏C反应蛋白在新生儿败血症早期的改变及其临床意义

目的探讨C反应蛋白（CRP）和高敏C反应蛋白（hsCRP）在新生儿败血症早期的改变及临床意义。方法对本院在2009年8月至2011年1月收治的96例新生儿败血症患者（败血症组）以及其他疾病的93例新生儿患者（对照组）进行血清CRP和hsCRP的浓度测定,观察比较两组患者的CRP和hsCRP阳性率变化。结果败血症组和对照组之间的CRP阳性率分别为94.79%和8.60%,二者之间差异有统计学意义;败血症组和对照组之间的hsCRP阳性率分别为97.92%和5.38%,二者之间差异有统计学意义。结论 CRP和hsCRP在新生儿败血症早期有显著的改变并有助于新生儿败血症的临床早期诊断。     

Livin蛋白和Bcl-2蛋白在结直肠癌中的表达

目的探讨Livin蛋白和Bcl-2蛋白在结直肠癌中的表达及二者的相关性。方法采用免疫组织化学法检测60例结直肠癌组织、15例腺瘤性息肉和15例癌旁正常组织中Livin和Bcl-2蛋白的表达情况。结果 Livin蛋白在肠癌组织中的表达明显高于腺瘤性息肉及癌旁正常组织中的表达,Bcl-2蛋白在肠癌组织中和腺瘤性息肉中高于癌旁正常组织中的表达,但在肠癌组织中和腺瘤性息肉中表达无统计学意义。Livin蛋白表达与肿瘤分期有关,Bcl-2蛋白表达与肿瘤分化程度有关,在结直肠癌中,Livin蛋白表达与Bcl-2蛋白无相关性。结论 Livin蛋白、Bcl-2蛋白在结直肠癌组织中表达上调,参与结直肠癌发生发展。     

镉对培养心肌细胞~3H-亮氨酸掺入和细胞生长的作用

目的 本实验探讨了镉对培养心肌细胞～3H—亮氨酸掺入及细胞生长的作用.方法 实验用检测培养乳鼠心肌细胞体积和掺入同位素标记氨基酸量的方法,测定细胞的蛋白质合成和生长情况.结果 实验见到培养心肌细胞在1×10(-4)mmol/LCdCl_2的作用下,24h以后的～3H亮氨酸掺入量明显低于对照组,且虽时间延长～3H—亮氨酸掺入量逐渐减少;镉染毒12、24、48h,均未见到细胞数量的改变;在染毒48h后,细胞体积较对照组减小,由对照组的2053±189μm~3降低到染毒组的1847±176μm~3.结论 镉可抑制培养心肌细胞蛋白质合成和细胞个体的生长.     

重组人骨形成蛋白-7成熟肽的表达、纯化及活性的研究

目的:研究重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7m)羧基端140个氨基酸成熟肽的大肠杆菌表达、纯化及活性,为其实际应用打下基础.方法:将编码此成熟肽的cDNA亚克隆入含PL启动子的表达质粒pDH2中,构建表达质粒pDH2-B7m,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达;通过包涵体洗涤、离子交换层析纯化目的蛋白;用Western blot验证透析复性后表达蛋白的抗原性,用含荧光素酶报告基因专门用于检测BMP活性的细胞株C2C12-K4检测其活性.结果:成功构建了PL启动子控制的原核表达载体pDH2-B7m;42℃诱导5 h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白40.3%,表达产物以包涵体形式存在.包涵体经洗涤、离子交换层析纯化,目的蛋白纯度至少在96.0%以上.Western blot实验证实其抗原性,细胞株C2C12-K4反应的检测表明透析复性后的rhBMP-7m有较强的活性.结论:成功地在E.coli中表达了hBMP-7m重组蛋白并证明其有较强的生物活性.     

鼠肝缺血再灌注后多耐药相关蛋白和根蛋白的表达及定位

目的探讨鼠肝缺血再灌注后血浆胆红素升高发生的分子机制。方法实验分为假手术组（A组）,70％的鼠肝缺血35min再灌注组（B组）,研究时点为再灌注后的1h、6h、1d、3d、5doHE染色分析肝组织病理改变。计算胆汁生成率,常规生化方法检测胆汁、血浆中胆红素含量的变化。荧光定量PCR检测肝组织多耐药相关蛋白2（MAP2）以及肝细胞骨架连接蛋白根蛋白的表达。激光共聚焦方法分析MRP2、根蛋白在肝细胞毛细胆管膜上的定位。结果70％鼠肝缺血35min再灌注模型炎症反应轻,无肝细胞坏死的发生。与A组比较,B组再灌注后的1h～3d,胆汁生成率及胆汁中结合胆红素含量明显降低;再灌注后的1h～5d,血浆中胆红素含量显著增加。荧光定量聚合酶链反应（PCR）发现,再灌注后6h～5d,B组根蛋白表达下调,以再灌注后的6h～1d尤为明显,MRP2表达的明显下调仅发生在再灌注后的6h。激光共聚焦分析发现,再灌注后的6h～5d在根蛋白表达缺失处,B组MRP2在毛细胆管膜上的定位减少。结论根蛋白表达下调所致的MRP2在毛细胆管膜上的定位减少很可能是鼠肝缺血再灌注后血浆胆红素升高发生的分子机制。     

CD44V6、MMP-9、CATH-D蛋白在胃癌组织中的表达及其意义

目的 探讨CD44V6、MMP-9和CATH-D蛋白在胃癌中的表达及其意义。方法 应用免疫组织化学技术检测CD44V6、MMP—9和CATH—D蛋白在128例胃癌中的表达。结果 CD44V6、MMP—9、CATH—D蛋白的表达与生长方式、浸润深度和TNM分期均有关；CD44V6蛋白与远处转移、MMP—9蛋白与淋巴结转移和LAUREN分型、CATH—D蛋白与淋巴结转移等的差异也有统计学意义。结论 检测CD44V6、MMP-9和CATH—D蛋白在胃癌中的表达，有助于胃癌进展和预后的判断。     

Survivin蛋白和mRNA在胆管癌中的表达和意义

目的检测胆管癌和癌旁胆管组织中Survivin蛋白和mRNA的表达,探讨其在胆管癌发生发展中的作用。方法应用免疫组化SP法检测48例胆管癌和其中30例癌旁胆管组织中Survivin蛋白的表达,同时应用RT-PCR技术检测这些组织标本中Survivin mRNA的表达,并与临床病理资料进行相关性分析。结果48例胆管癌组织中,Survivin蛋白阳性表达率为79.2%(38/48),在癌旁胆管组织中Survivin蛋白阳性表达率6.7%(2/30),两者比较差异有显著性意义(P<0.05)。48例胆管癌组织中,有30例Survivin mRNA的表达高于配对正常组织,胆管癌组织中Survivin mR-NA的表达水平(2.18±1.21)明显高于正常对照组织(1.01±1.03)(P<0.05)。临床病理资料的相关性分析显示,胆管癌组织中Survivin蛋白和mRNA的表达分布与临床病理特征无相关性。结论Survivin基因转录和蛋白表达可能参与胆管癌的发生发展过程,检测Survivin表达可能有助于阐明胆管癌的发生机制。