多重PCR技术检测沙门菌两种四环素耐药基因

应用两对特异性引物同时检测四环素耐药基因tetB和tetC通过对35株沙门菌分离株的四环素耐药性检测，表明所有沙门菌分离株均含tetC基因，与药敏试验结果阳性符合率65．7％，8株同时含有tetB基因，与药敏试验结果阳性符合率100％，tetB基因和tetC基因双阳性的菌株与药敏试验结果阳性符合率也为100％。取其中部分菌株扩增出tetB和tetC基因片段进行序列分析，5株菌的tetB基因扩增产物序列完全相同，与质粒pRT11相应序列同源性达99．7％；14株菌的tetC基因扩增产物与质粒pBR322中的相应序列同源性为100％。证实沙门菌耐药基因普遍存在，且同时含有tetB和tetC基因的菌株表现耐药。多重PCR技术同时检测两种四环素耐药基因，适合大量样本的检测，对开展沙门菌四环素多种耐药基因的分子流行病学监测提供了有效途径。     

猪源致病性沙门氏菌四环素耐药基因tetC的PCR扩增及序列分析

本研究对16株猪致病性沙门氏菌的四环素耐药性进行了检测，结果表明，沙门氏菌对四环素类抗生素产生了广泛的耐药性，耐药率达100％。对四环素耐药基因tetC进行PCR扩增，结果在12株沙门氏菌的质粒上扩增出特异性产物，与药敏试验结果阳性符合率75％，具有较高的检出率；序列分析结果表明tetC的核苷酸同源率较高，达97．7％～98．7％，建立tetC基因的PCR检测技术，为沙门氏菌对四环素耐药性的分子流行病学监测提供了有效的途径。     

阴道加德纳菌四环素耐药基因tetM的体外扩增及其产物的序列测定

利用聚合酶工反应（ＰＣＲ）对５株耐四环素阴道加德纳菌（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ（ＭＩＣ〉１６ｍｇ／Ｌ）的耐药基因ｔｅｔＭ进行体外扩增。核苷酸序列测定证实，１株耐四环素阴道加德纳功的ｔｅｔＭ核苷酸序列与另４株ｔｅｔＭ的序列不同，两者的同源性为９８．４％，同时又和Ｔｎ１５４５、Ｔｎ９１６部分同源。说明在阴道加德纳菌中ｔｅｔＭ基因存在多态性，其获得方式，来源途径均不相同。     

山东泰安地区致病性猪沙门菌氨基糖苷类耐药基因aph(3'')-Ⅱa的PCR扩增与序列分析

目的 研究沙门菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性并分析其耐药基因aph(3')-Ⅱa的序列.方法 对19株致病性猪沙门菌的氨基糖苷类抗生素耐药性进行检测;对其质粒上的aph(3')-Ⅱa基因进行PCR扩增.选取其中任意一株(WWS171)的PCR阳性产物进行耐药基因aph(3')-Ⅱa的序列分析.结果 沙门菌对氨基糖苷类抗生素产生了广泛的耐药性,耐药率达100%;耐药基因aph(3')-Ⅱa经PCR扩增后在13株沙门菌的质粒上出现582bp的特异性产物,与药敏试验结果的阳性符合率为68.4%,具有较高的检出率;与GenBank上发表的AF078924.1、AF188331.1、AY333434.1、AY598820.1、DQ842000.1的耐药基因aph(3')-Ⅱa的序列完全相同.结论 aph(3')-Ⅱa的PCR检测对氨基糖苷类抗生素耐药性具有较高的特异性.aph(3')-Ⅱa基因是决定本试验中Il缶床分离株氨基糖苷类抗生素耐药的主要基因,为氨基糖苷类抗生素耐药性的分子流行病学监测提供了依据.     

山东泰安地区致病性猪沙门菌氨基糖苷类耐药基因aph（3′）-Ⅱa的PCR扩增与序列分析

目的研究沙门菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性并分析其耐药基因aph(3′)-Ⅱa的序列。方法对19株致病性猪沙门菌的氨基糖苷类抗生素耐药性进行检测;对其质粒上的aph(3′)-Ⅱa基因进行PCR扩增,选取其中任意一株(WWS171)的PCR阳性产物进行耐药基因aph(3′)-Ⅱa的序列分析。结果沙门菌对氨基糖苷类抗生素产生了广泛的耐药性,耐药率达100%;耐药基因aph(3′)-Ⅱa经PCR扩增后在13株沙门菌的质粒上出现582bp的特异性产物,与药敏试验结果的阳性符合率为68.4%,具有较高的检出率;与GenBank上发表的AF078924.1、AF188331.1、AY333434.1、AY598820.1、DQ842000.1的耐药基因aph(3′)-Ⅱa的序列完全相同。结论aph(3′)-Ⅱa的PCR检测对氨基糖苷类抗生素耐药性具有较高的特异性,aph(3′)-Ⅱa基因是决定本试验中临床分离株氨基糖苷类抗生素耐药的主要基因,为氨基糖苷类抗生素耐药性的分子流行病学监测提供了依据。     

伤寒沙门菌主动外排多重耐药基因acrB与表达水平研究

目的调查临床分离伤寒沙门菌对常用抗生素的耐药情况与多重耐药主动外排基因acrB的检测、序列分析及其表达水平。方法根据NCCLS推荐的琼脂二倍稀释法测定7种抗生素对伤寒沙门菌的抗菌活性，以基因库序列为参考设计引物PCR扩增acrB、测序并用RT—PCR方法检测其表达水平。结果32株伤寒沙门菌对氧氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟、哌拉西林、氯霉素、四环素、庆大霉素的耐药率分别为0、0、0、28．13％、43．75％、40．63％和12．5％，其中多重耐药菌10株。所有细菌均检测到多重耐药外排基因acrB．测序显示与参考沙门菌序列（No．AL627267）比较，有2处碱基变异。与大肠埃希菌（No．ECU00734）比较，碱基同源性为85．51％（61／421），提示其碱基序列同源性极高。对不同种类抗生素耐药及不耐药部分伤寒沙门菌共16株进行一步法RT—PCR检测acrB表达水平，结果所测伤寒沙门菌均检测到多重耐药外排基因acrB的表达，多重耐药株主动外排的表达较其它菌株明显增强。结论伤寒沙门菌对喹诺酮类、第三代头孢菌素类耐药率低，对哌拉西林、氯霉素、四环素耐药率相对较高，且有多重耐药。伤寒沙门菌中均存在acrAB主动外排系统，acrB与大肠埃希菌同源性高，对不同结构抗生素耐药的种类越多，表达水平越高。主动外排机制可能是伤寒沙门菌多重耐药的主要原因之一。     

婴幼儿腹泻沙门菌分型与耐药机制分析

目的对我国武汉地区0~3岁临床婴幼儿腹泻沙门菌进行了分离、鉴定、耐药性和分子分型分析。方法超广谱头孢菌素和氟喹诺酮类抗生素是临床上用于治疗侵袭性沙门菌感染的重要抗生素,对这些抗生素的耐药性传播已引起了广泛的重视,本研究从3746例儿科临床门诊病人粪便样本中共检出221(5.9%)株沙门菌,分别属于29个血清型,抗生素的耐药谱在不同血清型间存在明显差异。环丙沙星耐药株多为鼠伤寒沙门菌,且均对4种以上非喹诺酮类抗生素耐药,22株环丙沙星耐药鼠伤寒沙门菌中19株位于同一个脉冲场群中。在18株沙门菌中检出质粒介导的喹诺酮耐药机制aac-(6’)-Ib-cr,其中4株菌中还携带qnr基因。在7株菌中检出质粒介导的超广谱-内酰胺酶类CTX-M-14编码基因,其中2株菌对环丙沙星的敏感性下降。结果与结论氟喹诺酮类抗生素不适于在当地用于侵袭性鼠伤寒沙门菌感染治疗,同时应对头孢曲松耐药-氟喹诺酮敏感性下降的菌株进行积极的主动监测。     

实时荧光定量PCR检测沙门菌flor基因和sul2基因方法的建立

目的 建立一种flor基因和sul2基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,为检测沙门菌的耐药性以及耐药基因分子流行病学调查奠定基础.方法 以氟苯尼考、复方磺胺甲噁唑抗性的沙门菌菌株为材料,根据GenBank中登陆的沙门菌flor和sul2基因序列,设计并合成引物,建立基于SYBR Green Ⅰ染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其溶解曲线进行分析.结果 以pMD 18-T为载体构建的标准品的Ct值与样品的浓度的对数在一定范围内呈现良好的线性关系,两基因的检测域值较小,flor基因可以检测到102 copies/μL的样品,sul2基因可以检测到103 copies/μL的样品,经耐药性与基因表达量相关分析,耐药性较高的菌株其flor基因、sul2基因表达量也较高.结论 建立的检测沙门菌中flor因和sul2基因的荧光定量PCR方法具有很好的灵敏性、特异性和重复性,可以广泛用于临床中lor和sul2两种基因的检测以及沙门菌耐药分子流行病学的调查.     

伤寒沙门菌PFGE基因分型研究

目的了解1979-2005年间河南省分离的伤寒沙门菌菌株的脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因型,探讨河南省伤寒沙门菌的分布、流行及变异情况。方法伤寒沙门菌单个菌落增菌后定量,制备琼脂糖菌体包埋胶块,蛋白酶K等消化处理,限制性内切酶XbaΙ酶切,制备琼脂糖凝胶,脉冲场凝胶电泳获取菌株指纹图谱,图谱条带进行分子量标化,用统计软件进行聚类分析。结果以80%相似度为标准,235株伤寒沙门菌被分成69个不同的PFGE基因型。各地区间和不同年份间基因型既有交叉,又存在差异,2005年有新的基因型出现。结论PFGE基因分型技术在确定菌株之间的分子流行病学关系方面是一种有效、稳定的方法。河南省伤寒沙门菌PFGE基因型别呈现多样性,地区间存在差异。     

Taqman荧光定量PCR法在药品沙门菌快速检测中的应用

目的：建立药品中沙门菌的荧光定量PCR快速检测方法。方法：根据沙门菌的特异基因序列合成引物和探针,提取沙门菌DNA进行检测。结果：该方法特异性好,灵敏度达到160cfu·ml-1,人工污染的药品检出率为100％．结论：荧光定量PCR法可用于药品沙门菌的快速检测。     

Robustness of digital PCR and real-time PCR against inhibitors in transgene detection for gene doping control in equestrian sports

Gene doping is a threat to fair competition in sports, both human and equestrian. One method of gene doping is to administer exogenous genetic materials, called transgenes, into the bodies of postnatal humans and horses. Polymerase chain reaction (PCR)-based transgene detection methods such as digital PCR and real-time PCR have been developed for gene doping testing in humans and horses. However, the significance of PCR inhibitors in gene doping testing has not been well evaluated. In this study, we evaluated the effects of PCR inhibitors on transgene detection using digital PCR and real-time PCR against gene doping. Digital PCR amplification was significantly inhibited by high concentrations of proteinase K (more than 0.1 μg/μl), ethylenediaminetetraacetic acid (more than 5 nmol/μl), and heparin (more than 0.05 unit/μl) but not by ethanol or genomic DNA. In addition, phenol affected droplet formation in the digital PCR amplification process. Real-time PCR amplification was inhibited by high concentrations of phenol (more than 1% v/v), proteinase K (more than 0.001 μg/μl), ethylenediaminetetraacetic acid (more than 1 nmol/μl), heparin (more than 0.005 unit/μl), and genomic DNA (more than 51.9 ng/μl) but not by ethanol. Although both PCR systems were inhibited by nearly the same substances, digital PCR was more robust than real-time PCR against the inhibitors. We believe that our findings are important for the development of better methods for transgene detection and prevention of false negative results in gene doping testing.     

应用荧光定量PCR检测食品中沙门菌

目的应用荧光定量PCR技术检测食品中沙门菌,为病原监测和快速诊断提供实验依据。方法选择沙门菌invA基因设计引物,应用SYBRGreen I染料建立荧光定量PCR法。分别对61株沙门菌、14株非沙门菌以及食品模拟标本、市售禽蛋制品进行检测,观察方法的特异性、敏感性和可行性。结果建立的荧光定量PCR法检测所有沙门菌均出现了特异的熔解曲线,扩增产物的熔点值79.6℃左右;目标菌DNA的扩增产物循环数（Ct值）为20,空白对照及非沙门菌的Ct值大于30,非沙门菌均未出现特异的熔解曲线。每反应最低检测的沙门菌数是31 CFU;对食品中人工污染的沙门菌的检测,最低检测量是1 CFU,检测时间为7～8 h,与培养法比较,阳性符合率100%;对市售的369份禽蛋制品进行检测,阳性结果 19份,而细菌培养法检测阳性结果为12份。结论基于SYBRGreen I染料建立的荧光定量PCR检测沙门菌是敏感、特异、省时、省力的方法,适用于沙门菌快速检测。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因全序列的克隆、鉴定与扩增

目的 克隆SEA基因作为后续基因治疗的目的基因。方法 以金黄色葡萄球茵基因组DNA(ATCC-13565)为模板,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因特异性引物为介导，采用普通PCR和降落PCR方法分别克隆SEA基因全序列，克隆入T载体后进行DNA测序。结果 2％琼脂糖凝脂电泳和DNA测序证实该基因克隆成功。结论 通过PCR方法，可以获得后续实验所需的SEA基因。     

PCR方法在水蛭素基因克隆方面的新应用

目的应用PCR方法获得水蛭素基因。方法在传统PCR方法的基础上进行了改进 ,根据已知天然水蛭素基因序列 ,设计了一对 12 3nt且 3′端具有 15nt互补序列的单链DNA ,通过低温复性使其互补结合后 ,进行延伸反应 ,得到微量双链水蛭素基因。再以该基因作为模板设计一对引物 ,进行常规PCR扩增反应。结果获得水蛭素基因。结论此法对于获得象水蛭素基因这类序列已知、片段不太长 ,且不易得到的基因提供了一种可行方法     

MSP扩增中3种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较

目的比较福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)中3种DNA提取方法,研究哪种方法更简便,更适合做DNA甲基化特异性PCR(MSP)。方法分别用二甲苯脱蜡法,改良TES水浴法和试剂盒法提取乳腺癌组织中的DNA,PCR扩增进行比较。结果二甲苯脱蜡法和试剂盒法提取的DNA电泳条带清晰可见,改良TES脱蜡法未见条带。结论二甲苯脱蜡法和试剂盒法提取的DNA均可用于做甲基化特异性PCR。     

猪基源的肝素粗品及混淆品的AS-PCR及ARMS分子检测

本文建立了一种简便、准确的鉴别猪基源的肝素粗品及其混淆品的DNA分子鉴定方法。在对家猪、野猪及其他7种动物(均用于加工猪肝素粗品的混淆品)的mtDNA D-loop区进行序列分析的基础上，设计了专门用于鉴别猪基源肝素钠的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物，对家猪、野猪及其他7种动物来源的肝素、肌肉或血液共49个样品的基源进行了分子检测。结果表明：AS-PCR及ARMS方法均可用于猪基源肝素粗品的快速鉴别。AS-PCR鉴别时的复性温度为54～56 ℃，ARMS引物鉴别时的复性温度更宽，为52～58 ℃。在用两种引物对肝素样品进行鉴别时，仅猪来源的肝素DNA模板能扩增得到约170 bp的扩增条带，而其他动物来源的肝素DNA模板在同样条件下无扩增产物。