含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6构建

目的 构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰质粒载体pDsRed2-SilencerU6,便于利用荧光显微镜、FACS等实验技术开展RNA干扰研究.方法 质粒pDsRed2-N1 中DsRed2蛋白的编码基因BbsⅠ酶切位点无意突变后,破坏pDsRed2-N1多克隆位点,PCR扩增CMV启动子、DsRed2蛋白基因片段并将其克隆至RNA干扰载体pSilencerU6,得到pDsRed2-SilencerU6质粒,利用脂质体转染技术将其转染HEK293T细胞,荧光显微镜、FACS检测转染效率.结果 DsRed2蛋白编码基因序列BbsⅠ点突变正确,成功构建pDsRed2-SilencerU6载体,其在HEK293T细胞中可显著表达红色荧光蛋白,利用脂质体转染技术,转染效率达70.61%.结论 成功构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6并在哺乳动物细胞中表达,为今后开展RNA干扰研究提供了基础.     

pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体的构建及vigilin重组慢病毒包装

目的 构建pCS-CG-DsRed2-vigilin慢病毒重组载体,以及包装pCS-CG-DsRed2-vigilin重组慢病毒.方法 用NheⅠ、NotⅠ将目的片段红色荧光蛋白基因DsRed2从pDsRed2-N1中切下,连入pcDNA3.1（-）上,再用Kpn1从pcDNA3.1（-）-DsRed2中切下DsRed2片段插入pCS-CG-vigilin中.用相应的内切酶鉴定,阳性克隆送测序鉴定.采用三质粒系统包装慢病毒并分别感染HEK293T和HepG2细胞.结果 电泳显示,构建的pCS-CG-DsRed2-vigilin用KpnⅠ和SacⅡ分别单酶切切下800bp和600bp的插入片段,阳性克隆质粒测序结果与pDsRed2-N1中DsRed2序列一致;HEK293T和HepG2细胞感染后均能观察到较强的红色荧光.结论 带有红色荧光基因的pCS-CG-DsRed2-vigilin重组载体构建成功;成功包装出带红色荧光标签的vigilin重组慢病毒,且该病毒具有较高的感染效率.     

脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞的效率研究

目的:脂质体介导重组起搏基因pIRES2-EGFP-HCN2转染HEK293细胞,观察转染效率,探讨其构建生物起搏器的可行性。方法:对含hHCN2cDNA的PTR载体进行转化和扩增,将所得hHCN2基因定向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,双酶切来鉴定克隆的正确性。将重组质粒用脂质体转染HEK293,荧光显微镜观察EGFP的表达并计算转染效率。结果:构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2。荧光显微镜下可见转染后的HEK293呈绿色荧光,其转染效率可达90%以上。结论:成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并用脂质体转染的方法导入HEK293细胞,为生物起搏的研究奠定实验基础。     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

Ebp1-绿色荧光蛋白融合基因的构建及在HEK293T细胞中的表达

[目的]构建绿色荧光蛋白融合表达Ebp 1基因载体,并检测其在HEK 293 T细胞中的表达.[方法]采用PCR扩增Ebp 1基因,利用其片断和质粒pEGFPC 1的EcoRⅠ及XhoⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,通过脂质体介导将其转染到HEK 293 T细胞中,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白融合基因的表达情况.[结果]成功地构建融合表达载体pEGFPC 1-Ebp 1,将其转染到HEK 293 T细胞后可观察到其中有EGFP表达.     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的:构建IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内IP10的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建含IP10启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-IP10;用脂质体瞬时转染HEK293 细胞,观察IP10启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低,经LPS 刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于IP10基因表达信号调控机制的研究.     

携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。方法：利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒。以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒。经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中的表达。结果：PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3400、110和720 bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4300 bp。测序分析,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与 GenBank 公布的基因序列完全一致。重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP。流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。结论：成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染。     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

白血病细胞株KG1中Mxi1突变基因真核表达载体的构建

目的构建Max结合蛋白1(Max interacting protein 1,Mxi1)基因的野生型和突变型真核表达载体,观察表达载体转染真核细胞后蛋白表达的情况。方法将正常人和白血病细胞株KG1细胞的Mxi1野生型/突变型基因cDNA插入到红色荧光蛋白质粒pDs-red2-N1中,构建为pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体;采用脂质体方法将质粒转染Cos-7细胞;荧光显微镜观察Cos-7细胞红色荧光蛋白表达情况。流式细胞仪方法检测红色荧光蛋白中Mix1的基因表达率,以此计算转染效率。转染后48h提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测Mxi1基因表达。结果成功构建了一种pDs-red2-N1/Mxi1(野生型/突变型)真核表达载体。荧光显微镜下观察转染后Cos-7细胞可见红色荧光蛋白的表达;流式细胞仪检测野生型和突变型的转染效率以转染后前3d较高,并可持续至第6d。质粒转染Cos-7细胞后均出现阳性Mxi1基因转录产物。RT-PCR方法可以检测到Mxi1基因在Cos-7细胞中的表达。结论 Mxi1的真核表达载体构建成功,通过脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达。     

Grb2在MCF-7 乳腺癌细胞中的核定位研究

目的　构建Grb2的红色荧光蛋白融合表达质粒pDsRed1 C/Grb2 ,并观察Grb2在MCF 7乳腺癌细胞的核定位情况。方法　用PCR方法扩增Grb2cDNA ,与红色荧光蛋白表达质粒pDsRed1 C重组构建融合蛋白表达质粒pDsRed1 C/Grb2 ,酶切、测序鉴定后 ,瞬时转染MCF 7乳腺癌细胞株 ,用荧光显微镜观察Grb2的核定位情况。结果　pDsRed1 C/Grb2质粒有正确的阅读框 ,融合表达蛋白DsRed1 C/Grb2可定位于MCF 7乳腺癌细胞核内。结论　成功构建了Grb2的红色荧光蛋白融合表达质粒pDsRed1 C/Grb2 ,在MCF 7乳腺癌细胞株中 ,Grb2除存在于胞浆外 ,也可定位于细胞核内 ,可能与其参与核内基因的转录调控有关。     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

免疫检查点TIGIT慢病毒表达载体的构建和稳定表达TIGIT细胞系的建立

目的：构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白（TIGITGFP）慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。方法：将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,凝胶回收后连接构建重组质粒pLenti-TIGIT-GFP。将测序正确的重组质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞作为实验组,转染TIGIT质粒的HEK293T细胞作为对照组,转染48 h后荧光显微镜下观察细胞膜上GFP表达情况。将实验组细胞继续培养,采用嘌呤霉素筛选2周后,挑取单克隆扩大培养,荧光显微镜观察细胞膜上GFP表达情况,Western blotting法检测在转染的人胚胎肾HEK293T细胞中TIGIT-GFP蛋白表达情况。结果：酶切鉴定,TIGIT基因成功插入pLenti-GFP表达载体,DNA测序未检测到突变发生。实验组细胞膜上检测到GFP表达。Western blotting法检测,实验组细胞裂解液中检测到TIGIT-GFP特异性条带。结论：成功构建pLenti-TIG...     

鼠VEGF红色荧光慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建含鼠血管内皮细胞生长因子(mVEGF)红色荧光慢病毒载体,鉴定其在293T细胞中的表达.方法 构建含mVEGF和红色荧光蛋白(DsRed)基因双顺反子重组慢病毒质粒;采用脂染法将慢病毒系统三质粒共转染293T细胞,转染后24 h和48 h荧光显微镜下观察DsRed表达,收集48 h 和72 h病毒上清并感染靶细胞239T,荧光显微镜下观察DsRed表达情况,并行Western blot分析培养上清和胞浆内mVEGF表达.结果 成功构建慢病毒表达质粒pTK208-mVEGF-IRES-DsRed,重组慢病毒滴度达5×106 PFU/ mL,并获得蛋白DsRed和mVEGF的表达.结论 含mVEGF红色荧光慢病毒质粒成功介导mVEGF蛋白的表达,该载体有望为研究VEGF的病理生理学机制及基因靶向治疗提供有效的工具.     

人MT2A基因在哺乳动物细胞株中的定位与表达

目的 用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人金属硫蛋白2A(MT2A)真核表达载体,用其转染HEK 293T,COS-7细胞观察MT2A在增殖细胞内的表达和定位.方法 设计带FLAG-tag的引物,以人MT2A全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增MT2A全长序列,然后插入pCDNA 3.1中构建pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;脂质体法转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察MT2A表达的蛋白在细胞内定位.结果 正确构建了pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;其在HEK 293T细胞中能有效地表达;免疫荧光实验表明在COS-7细胞中,MT2A主要分布在细胞质内.结论 该研究结果为了解MT2A 在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础.     

pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

目的 构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系.方法 将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质体PolyFect介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-MK2融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-MK2的表达及细胞内定位情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-MK2主要分布在核内.结论 成功构建pNTAP-MK2真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对MK2定位产生明显影响.     

EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位. 方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed 1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a( )-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed 1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed 1、CIDE-3 克隆人真核表达载体pShuttle-CMV中.酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染人293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系.结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3构建成功.荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系. 结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShutde-CMV-DsRed 1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系.     

Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选

目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法.方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果.结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差;在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好.结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段.     

POAG致病基因MYOC突变型载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:构建Pro370Leu突变型Myocilin(MYOC)基因真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达以探讨突变蛋白表达特点.方法:以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板,用PCR介导的定点突变技术,得到Pro370Leu突变型MYOC基因(mutant MYOC,mMYOC),并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2-N1上,得到pDsRed2-N1-mMYOC重组表达质粒,再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后用脂质体包埋转染法转染COS-7细胞,进行荧光显微镜观察.采用WestemBlot分析蛋白分泌情况并检测突变蛋白对细胞凋亡的影响.结果:经酶切和DNA序列测定,第370密码子CCG转变为CTG,荧光显微镜观察显示mMYOC蛋白只定位在细胞质中,经Western Blot分析表明mMYOC蛋白只存在细胞裂解液中,经流式细胞仪检测突变型转染组凋亡细胞百分比较高为6.63%.结论:Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒构建成功,Pro370Leu突变型MYOC基因表达的蛋白呈分泌障碍状态,并具有促进细胞凋亡的趋势.     

短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

为观察构建的AKT2基因特异性短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用，并探讨其促进细胞凋亡的机制。运用基因工程技术，设计合成针对AKT2mRNA的特异性shRNA，构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体（Lipofectamine^TM 2000）包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞，荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达，