我国两株登革2型病毒分离株结构蛋白C,PrM（M）,E和非结构…

对我国两株登革２型病毒分离株的结构蛋白Ｃ，ＰｒＭ（Ｍ），Ｅ和非结构蛋白ＮＳ１基因的核苷酸及相应的氨基酸序列进行分析，并与国外登革２型毒株的核苷酸序列同源性、碱基组成、糖基化位点、半胱氨酸残基、蛋白裂解位点和疏水剖面图等进行了比较分析。结果发现Ｄ２－４３和Ｄ２－０４株Ｃ－ＮＳ１基因的读码框架基本相同，均由３３８１个核苷酸组成，编码氨基酸总数为１１２７，糖基化位点和保守的半胱氨酸残基的数目和位置均相同     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的特征

对我国1987年流行的登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明登革2型病毒43株包膜E蛋白基因核苷酸序列含1485个核苷酸，编码495个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与其它的登革2型病毒株进行了比较，发现核苷酸序列与我国1985年分离的登革2型病毒04株，新几内亚C株（NGC），牙买加株1409（JAM）和马来西亚当地流行株M1（登革出血热）、血2（登革休克综合征）、M3（登革热）同源性分别是95.8%、94.6%、97.5%、925%、92.7%和939%，氨基酸序列的同源性分别是94.3%、94.3%、96.0%、93.7%、93.7%和91.5%，推断出的氨基酸序列显示出12个保守的半胱氨酸残基和两个潜在的糖基化位点，分别位于Asn-67和Asn-153位。     

我国登革2型病毒04株包膜蛋白基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列

本文报告我国登革2型04株包膜蛋白基因的核苷酸及氨基酸序列,并与登革1、3、4型及其它2型毒株如几内亚C株(NGC)、牙买加株1409(JAM)、候选疫苗株S1以及马来西亚当地流行株M1(登革出血热)、M2(登革休克综合征)。 M3(登革热)进行比较。结果表明D_2-04株E蛋白基因的核苷酸序列与NGC,JAM和S1的同源性分别为95.0％、97.4％和90.0％;与M1、M2、M3的同源性分别为93.3％、92.1％和94.3％;与其它登革血清型的同源性大约为65％。登革2型04株蛋白的氨基酸序列与NGC、JAM、S1、M1、M2、M3的类似性分别为96.8％、97.2％、91.4％、95％、95.6％和94.3％。与其它登革血清型氨基酸类似性大约为62％～68％;与其它黄病毒的类似性范围为43％～47％。推断的氨基酸序列显示出7个保守的半胱氨酸残基及两个潜在的糖基化位点,分别位于Asn-67和Asn-153位。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建我国登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ 的信号肽序列、完整的ＰｒＭ 蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％ Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。采用蛋白印迹和间接免疫荧光法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：构建的ＰｒＭ－Ｅ基因全长２ ０１９个核苷酸,序列分析证明其核苷酸序列是正确的。ＰｒＭ－Ｅ基因在ＢＨＫ－２１ 细胞中获得高效表达,表达蛋白可与Ｄ２－４３ 多克隆抗体起特异反应,且表达蛋白主要位于细胞浆中。     

我国登革2型病毒43株PrM—E基因的构建及其在哺乳动 …

目的：构建我国登革２型病毒４３株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法;采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术的构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ的信号肽序列,完整的ＰｒＭ蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％,Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。     

赖型钩体弱毒株外膜蛋白基因的序列分析

目的：探讨赖型钩体弱毒株外膜蛋白基因的特点及其与强毒株的差别。方法：对问号钩体赖型56601株的外膜蛋白基因进行PCR扩增得到外膜蛋白基因进行了全基因序列测定，并与我国特有的强毒株017株进行Omp11基因核苷酸序列、推导的氨酸序列以及亲水性和疏水性和二级结构的比较。结果：赖型钩体56601株和017株Omp11基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为99％。结论：赖型钩体56601株和017株Ompll基因核苷酸在较小判别，可能与毒力强弱有关。另外，两株钩体Ompll基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性很高，从分子水平上说明了同型弱毒疫苗可对强毒株产生完全的免疫保护。     

我国三株登革2型病毒基因组全序列的测定及系统发生树分析

目的：测定我国３株登革２型病毒（ｄｅｎｇｕｅ２ｖｉｒｕｓ,ＤＥＮ２）流行株的全序列并确定其基因型。方法：运用ＲＴ－ＰＣＲ和５′,３′ＲＡＣＥ法测定我国３株登革 全序列,采用邻结法绘制系统发生树。：ＤＥＮ２－０４、４３、４４株的核苷酸及氨基酸差异分布于整个序列之中,ＤＥＮ２－０４与ＤＥＮ２－４３、４４共有２１个氨基酸位点的差异引起极性或电荷变化。ＤＥＮ２－０４株与ＪＡＭ株、越南分离株和泰国分离株同为     

我国登革2型病毒株E蛋白B抗原区基因的表达与鉴定

目的和方法：通过对登革２型病毒Ｅ蛋白Ｂ区基因片段的表达,研究Ｂ区蛋白的抗原性。首先采用ＰＣＲ方法扩增了编码Ｂ区蛋白的基因片段,并将其插入到ｐＭａｌ－Ｃ２原核载体进行融合表达。采用蛋白质印迹法和ＥＬＩＳＡ法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：在构建的重组质粒Ｂ１６５－ｐＭａｌ中,Ｅ蛋白Ｂ区与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因以融合形式高效表达。该融合蛋白可与登革１￣４型病毒的鼠腹水抗体起特异反     

丙型肝炎病毒河北定州株C33c基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

采用反转录ＰＣＲ方法从河北定州地区献血员血清中克隆了丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）的Ｃ３３ｃ抗原基因，序列分析结果表明，该株的Ｃ３３ｃ基因和中国泰安株的同源性为９１．０％，氨基酸序列同源性为９２．２％；与ＨＣＶ河北株的同源性分别为９１．３％和９６．２％；和日本ＪＫ１株的同源性分别为９１．６％和９４．８％。克隆的基因在大肠杆菌中得到表达和纯化，并可用作抗ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂的抗原组分     

我国两株森林脑炎病毒的生物学性质及E蛋白基因核苷酸序列的比较

目的：比较我国1953年从患者脑组织分离的森张株和2001年从患者血清中分离的MDJ01株森林脑炎病毒(TBE)的生物学特性及E蛋白基因核苷酸序列的变化，分析TBE病毒E蛋白基因的变化与功能的关系，从分子水平上探讨我国TBE的传播、流行规律及致病机制。方法：两株病毒同时接种乳鼠和，BHK／21细胞，观察两株病毒对乳鼠和BHK／2l细胞的致病性；从两株病毒感染的BHK／2l细胞中提取病毒的RNA，对E蛋白基因进行RT-PCIR扩增，扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接，分别进行克隆测序。结果：森张株对乳鼠和BHK／21的致病性均比MDJ01株明显；两株病毒E蛋白基因长为l488nt，编码496个氨基酸，核苷酸的变异为33个，导致了2个氨基酸的变化，第一个氨基酸的变异发生在113位(MDJ01株由Ⅰ变成Ⅴ)，第二个氨基酸的变异发生在163位(MDJ01由P变成A)，两株病毒核苷酸序列的同源性为97．8％，推测的氨基酸序列的同源性为99．6％。与国外远东株比较，森张株核苷酸序列的同源性稍高于MDJ01株，与欧洲株、西伯利亚株的同源性基本一致。结论：新分离株MDJ01对细胞和乳鼠的致病性稍低于1953年分离的森张株，E蛋白基因的核苷酸序列分析表明两株病毒同属于远东亚型，推测MDJ01株可能是由森张株在自然界长期演变而来。     

我国登革1型病毒广州株基因组全序列测定与分析

目的：对引起1980年广州登革热流行的登革1型病毒（GZ／80）株的基因组全序列进行测定,为进一步了解病毒基因组结构与功能的关系。从分子 水平探讨登革病毒的传播和流行规律及致病机制提供依据。方法：用广登革热流行期间从患者血清中分离的GZ／80株病毒感染乳腺,聚鼠脑制备病毒RNA。对基因组编码区分段进行RT－CR扩增,非编码区采用RACE法进行cDNA扩增。然后将特异产物纯化后与pGEM-Teasy载体连接,分别进行克隆测序。结果：GZ／80株基因组全长10735ng,5′和3′非编码区长度分别为94nt和465nt基因组单一的读码框架长度为10176ng,编码3392个氨基酸,与登革1型病毒16007株、WestPac74株、新加坡S275／90株和FGA／89株核苷酸序列的同源性分别为94％,93％,95％和91％;推测的氨基酸序列的同源性分别为98．0％,97．9％和97．1％。结论：GZ／80株基因组大小及结构与已知的登革1型病毒其他地区分离株一致。系统发生树分析显示,GZ／80株属于第Ⅱ基因型,与台湾87株、88株和泰国80株为同一基因型。提示广州登革热流行的病原可能来自我国。     

登革2型病毒中国分离株感染性全长cDNA克隆的构建与鉴定

目的：构建登革2型病毒中国分离株（DEN2-43）的感染性全长cDNA克隆.方法：根据我室测定的DEN2-43株病毒全基因组序列,利用长链RT-PCR及融合PCR技术扩增此病毒基因组全长cDNA分子,并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆.将此克隆体外转录后,通过电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒.结果与结论：构建的DEN2-43基因组全长cDNA克隆具有感染性,所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及小鼠乳鼠神经毒力,且可稳定传代.该感染性克隆的构建为深入探讨登革病毒的致病机制及研制新型登革疫苗奠定了基础.     

1999年福建省暴发不明热病毒病原的分离与鉴定

目的：对１９９９年８月福建省福州市暴发的不明热的病毒病原进行分离与鉴定。方法：首先采用传代蚊细胞的微量培养方法进行病毒分离,并通过脑内接种途径观察对乳小鼠的致病性。然后经间接免疫荧光法和ＲＴ－ＰＣＲ技术对毒株进行型别鉴定。结果：患者恢复期血清标本中存在登革２型病毒特异抗体。从急性期血清标本中分离出１１株病毒,在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并驿乳小鼠致病。其基因组为登 革２型病毒特异的ＲＮＡ分子     

基孔肯雅病毒WJ0601株基因组全序列测定及分析

目的对保存的基孔肯雅病毒WJ0601株基因组序列进行测定,并阐明该病毒与已报道毒株序列的关系。方法对基孔肯雅病毒基因组编码区分14段进行RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列。结果与结论基孔肯雅病毒WJ0601株基因组核苷酸共11826nt,编码3722个氨基酸,其中5′端的2/3基因组编码4种非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4;3′端的1/3基因组编码5种结构蛋白C、E3、E2、6K和E1蛋白。结构基因和非结构基因之间有68nt的连接区为非翻译区。病毒基因组5′端和3′端分别有76nt、526nt的非编码区。序列同源性分析结果表明,此株病毒与S27-African株的同源性最高,两者核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为99.8%,同属于（ESCA）基因型。     

西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列测定及分析

目的：对保存的西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列进行测定，了解其与已报道毒株的序列差异及系统进化关系。方法：对Chin-01株病毒基因组编码区分区段进行RT-PCR扩增，分别将扩增产物直接进行测序，采用DNAstar软件将测序片段拼接获得全长编码区序列。结果与结论：Chin-01株基因组编码区全长10302nt，为单一读码框架，编码3434个氨基酸。其中结构蛋白基因为2373nt，依次编码4种结构蛋白(C，PrM，M和E)；非结构蛋白基因全长7926nt，依次编码7种非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。序列同源性分析表明，Chin-01株与埃及Eg101株高度同源，两者氨基酸序列仅有0．3％的差异。该株西尼罗病毒基因组编码区序列已输入GenBank数据库。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白基因进化的新探讨

目的 探讨甲型H1N1流感病毒基质蛋白(M)基因的进化规律及M2蛋白的氨基酸替代情况.方法 从NCBI数据库下载甲型H1N1病毒M基因179条进行预分析,最终选取50条采用MEGA 4.0软件对其进行比对,采用NJ法构建进化树,同时采用MEGA 4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对.结果 不同地区新型甲型H1NI流感病毒M基因同源性高,达99.6%～100.0%,但与历史上流行的H1N1和H3N2流感病毒M基因差异较大,仅与1999-2002年间香港地区流行的H3N2亚型猪流感病毒同源性较近,为96.7%~97.7%.2009年流行的新型甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H1N1人流感病毒相比,在第11、13、14、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来流行的H1N1禽流感病毒相比,在第13、14、16、31、43、55、77、89位氨基酸位点发生了变异;与H1N1猪流感病毒相比,在第13、14、19、43、55位氨基酸位点发生了变异.2009年流行的甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H3N2人流感病毒相比,在第11、13、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来在欧亚大陆流行的猪流感病毒相比,所比较的19个位点均有部分毒株发生变异;而与1999-2002年间在香港流行的H3N2猪流感病毒相比,仅在第13、14、21、43位氨基酸位点发生变异.结论 此次新型甲型H1N1流感病毒M基因可能由香港地区流行的H3N2猪流感病毒重组而来.M2蛋白胞外编码区氨基酸位点发生变异,提示在疫苗研制方面应注意由此带来的影响.跨膜区的突变可能是导致此次新型甲型H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药性的原因,第43位氨基酸位点可能为引起此次耐药的主要位点.