过表达D5 Stat5a促进前列腺癌细胞增殖及IGFBP-7基因启动子组蛋白甲基化

目的 探讨D5 Stat5a对人类前列腺癌细胞增殖的影响及其对胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP-7)表达的影响。方法 常规培养人前列腺癌细胞(DU145及PC3),并随机分为四组:对照组及三个实验组。对照组以不含外源基因的腺病毒感染,三个实验组细胞则以携带D5 Stat5a c DNA的腺病毒感染,其病毒感染增殖活性(MOI)依次为10、20及30。四组细胞均在培养液中加入催乳素(50 ng/m L)以启动细胞信号转导。运用MTS方法检测细胞增殖;实时定量PCR检测抑癌基因IGFBP-7及EZH2 m RNA水平;染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)检测IGFBP-7基因启动子区域组蛋白甲基化程度;蛋白质印迹法检测IGFBP-7蛋白表达。结果 携带D5 Stat5a c DNA的腺病毒感染能够呈剂量依赖式地促进前列腺癌细胞(DU145及PC3)增殖。如PC3细胞,对照组细胞的相对活细胞数为(1.362±0.018),三个实验组相对活细胞数分别为(1.453±0.022)(P>0.05)、(1.649±0.020)(P<0.05)及(1.829±0.027)(P<0.05)。实时定量PCR及蛋白印迹证明D5 Stat5a过表达明显下调IGFBP-7的表达。DU145及PC3对照组细胞IGFBP-7 m RNA相对值分别为(0.796±0.023)及(0.871±0.046),而感染携带D5 Stat5a c DNA的腺病毒(MOI 30)后,其IGFBP-7 m RNA相对值则分别下降到(0.148±0.019)(P<0.01)及(0.078±0.021)(P<0.01)。染色质免疫共沉淀分析(Ch IP-Assay)证实,D5 Stat5a导致IGFBP-7基因启动子区域组蛋白甲基化(H3K27Me3)水平显著上升。DU145细胞对照组与实验组,其沉淀DNA比例分别为(0.0176±0.0030)%及(0.0650±0.0099)%,两者差异有高度统计学意义(P<0.01)。此外,实时定量PCR检测表明,D5 Stat5a引起组蛋白甲基转移酶EZH2 m RNA大幅上升。DU145细胞对照组及D5 Stat5a感染组相对m RNA水平分别为(0.0033±0.0004)及(0.0160±0.0035),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 转录因子D5 Stat5a能够显著促进人类前列腺癌细胞的增殖,其主要的表观遗传学机制在于D5 Stat5a增加EZH2基因表达,导致抑癌基因IGFBP-7启动子区域组蛋白甲基化,使启动子活性降低,IGFBP-7表达下降,是导致前列腺癌细胞的异常增殖分子机制之一。     

慢性髓系白血病中let-7a-3甲基化态势及其临床意义

目的：探讨慢性髓系白血病（CM L ）患者中let‐7a‐3启动子的甲基化态势及其临床意义。方法建立实时定量甲基化特异性PCR （RQ‐MSP）分别检测25例对照者及52例CML患者骨髓单个核细胞中let‐7a‐3启动子未甲基化水平。结果52例CM L患者未甲基化let‐7a‐3启动子（59．6％）为阳性,而对照组仅1例（4％）阳性,两组比较差异有统计学意义（ P＜0．01）。ROC曲线分析表明,let‐7a‐3启动子未甲基化作为辅助诊断CM L有较好的特异性。未甲基化let‐7a‐3启动子水平与BCR／ABL融合基因转录水平呈显著正相关（ r＝0．641,P＝0．001）,但与患者的白细胞、血小板计数及血红蛋白水平无明显相关性（ P＞0．05）。在慢性期和加速期let‐7a‐3未甲基化水平显著高于急变期。结论 let‐7a‐3基因低甲基化水平随疾病进展而降低。     

p21Waf1／Cip1甲基化调控细胞衰老

目的：探讨 p21Waf1／Cip1启动子甲基化改变对细胞衰老进程的影响。方法采用克隆、测序的方法定量检测p21Waf1／Cip1启动子在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）衰老过程中的甲基化改变;RT‐PCR和Western blot检测p21Waf1／Cip1的表达;采用5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷去甲基化处理2BS细胞,通过M T T和β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果 p21Waf1／Cip1启动子在年轻2BS中,CpG甲基化的发生率为1．25％;在中年细胞中为27．27％;在衰老2BS细胞中为0．64％;p21Waf1／Cip1的表达在细胞衰老过程中呈波动性变化,先增加,后降低,到细胞开始衰老时,表达又显著增加;中年2BS细胞经5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷处理后,p21Waf1／Cip1表达增加,细胞增殖速率较正常中年细胞显著降低,同时细胞β‐半乳糖苷酶染色阳性率增加。结论 p21Waf1／Cip1去甲基化加速细胞衰老。     

5-氮-2'-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及ING1bmRNA表达的影响

目的　探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响。方法　应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-dc,以下简称Aza）及组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达。结果　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低。经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1bmRNA表达亦比对照组高。结论　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

siRNA沉默Livin基因对乳腺癌MCF-7细胞化学治疗增敏作用的研究

目的：观察小干扰RNA（siRNA）沉默Livin基因对人乳腺癌细胞MCF‐7细胞生物学影响及siRNA沉默MCF‐7细胞Livin基因对4种化学治疗药物的增敏作用。方法 Lipofectamine 2000脂质体转染法转染MCF‐7。分组：空白组（无转染）、脂质体组、反义组、错义组、联合组。MTT法测定氟尿嘧啶（5‐FU）、表柔比星（EPI）、多西紫杉醇（DXT）、吉西他滨（GEM）单药（单药组）对乳腺癌细胞MCF‐7增殖的抑制作用。免疫组织化学检测Livin蛋白在MCF‐7细胞中的表达及转染联合化学治疗药物对Livin蛋白的表达变化。实时荧光定量PCR（RT‐PCR）检测转染Livin siRNA后乳腺癌MCF‐7细胞的Livin基因表达变化。同时利用Annexin‐V检测乳腺癌细胞的凋亡及siRNA Livin联合5‐FU、EPI、DXT、GEM 诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 Livin在MCF‐7细胞中高表达,4种化学治疗药物对 Livin表达无明显影响,转染Livin基因48、72 h后联合4种药物后能明显下调Livin蛋白表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。5‐FU、EPI、DXT、GEM治疗乳腺癌MCF‐7细胞48、72 h均能明显的引起细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。转染Livin基因48 h联合4种药物后乳腺癌MCF‐7细胞的凋亡率明显高于单药处理的细胞,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论 siRNA沉默Livin基因能促进由化学治疗药物5‐FU、EPI、DXT、GEM引起的细胞凋亡,具有化学治疗增敏作用。     

BORIS通过表观修饰对人肝癌细胞SOCS3表达的调控

目的 探讨人肝癌细胞系中印记位点结合因子（BORIS）对细胞因子信号传导抑制因子-3（SOCS3）表达的调控方式。方法 通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测SOCS3 mRNA在肝癌细胞中的表达;Western blot检测敲低和过表达BORIS的肝癌细胞中SOCS3蛋白的表达;在敲低和过表达BORIS的肝癌细胞系中使用甲基化特异性PCR（MSP-PCR）,检测SOCS3基因启动子区域甲基化状态;通过UCSC数据库分析,找到SOCS3基因启动子区潜在的BORIS结合位点,使用染色质免疫共沉淀（ChIP）-实时定量PCR（ChIP-qPCR）探索内源性高表达BORIS细胞中BORIS在SOCS3启动子区的富集状况;通过ChIP-qPCR检测敲低和过表达BORIS对SOCS3启动子区组蛋白甲基化状态。结果 在肝癌细胞中SOCS3 mRNA表达较高,在敲低或过表达BORIS mRNA肝癌细胞中,SOCS3蛋白表达相应下调或上调,即在肝癌细胞中BORIS以正向调控的方式调控SOCS3蛋白质的表达;MSP-PCR实验显示在SMMC-7721和HepG2细胞SOCS3启动子为非甲基化,敲低BORIS不改变甲基化状态,Huh7细胞的SOCS3启动子区为甲基化状态,过表达BORIS后,SOCS3启动子区转变为非甲基化状态,但在HCCLM3中SOCS3启动子为非甲基化,过表达BORIS不影响甲基化状态;ChIP-qPCR表明在内源性高表达BORIS的细胞中,BORIS特异性结合在SOCS3启动子区;组蛋白甲基化检测结果表明,敲低BORIS减少了BORIS在SOCS3启动子区富集,同时减少该区域H3K4 me2,增加H3K27 me3,而在过表达BORIS的细胞中呈现相反的结果。 结论 BORIS作为一个表观遗传调控因子调控SOCS3基因启动子区的甲基化状态和组蛋白甲基化修饰,影响SOCS3的表达,进而参与肝癌发生发展的过程。     

人结肠癌细胞中组蛋白乙酰化对细胞周期调节基因表达的影响

目的 研究组蛋白乙酰化对Colo-320和SW1116人结肠癌细胞系p21^WAF1和p16^INKRA基因表达的影响。方法 培养人结肠癌细胞系SW1116和Colo-320,分别以去甲基化制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-dC)和／或组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素(TSA)及丁酸钠(NaBu)干预细胞。运用流式细胞术检测细胞周期变化;以定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法研究控制细胞周期的基因p21^WAF1和p16^INKRA的表达;染色质免疫沉淀技术分析基因相关染色质乙酰化组蛋白的水平。结果 TSA或NaBu使人结肠癌细胞阻滞于G1期,而5-aza-dC并不能改变细胞周期。正常情况下,SW1116和Colo-320细胞中均有较弱的p16^INKRA表达;两种结肠癌细胞系p21^WAF1表达缺如。5-aza-dC干预后,p16^INKRA表达增强,相反p21^WAF1仍无明显表达。当该两个细胞系经TSA或NaBu处理后,p21^WAF1转录水平明显上调,并诱导p21^WAF1基因相关染色质乙酰化组蛋白H3和H4的积聚。结论 两种人结肠癌细胞系中,HDAC抑制剂通过选择性增加p21^WAF1基因相关染色质乙酰化水平,上调p21^WAF1基因的转录,并相应地导致结肠癌细胞生长停滞;而p16^INKRA基因表达主要受甲基化调节。     

STATs蛋白家族在口腔黏膜下纤维化及其并存口腔扁平苔藓中的表达及意义

目的：比较口腔黏膜下纤维化（OSF）、OSF并存扁平苔癣（OLP）及正常口腔黏膜组织中STATs蛋白家族的表达差异,探讨STATs蛋白家族在OSF并存OLP发生、发展中的作用机制。方法收集临床OSF病例21例（OSF组）、OSF并存OLP13例（OSF并存OLP组）,以及 NBM 组织10例（对照组）,分离组织 RNA ,采用 RT‐PCR分析 STATs蛋白家族（Stat1、Stat2、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6）在OSF不同分期组织及OSF并存OLP组织中的表达差异。筛选表达差异较大的基因,进行免疫印迹杂交检测验证,并分析其磷酸化变化,探讨 STATs 蛋白家族在 OSF 并存 OLP 发生、发展中的作用机制。结果 Stat1、Stat3、Stat5a的表达量与OSF分型呈正相关,即在OSF组中晚期黏膜组织样本中的表达量明显高于对照组（ P＜0．05）,而Stat2、Stat4、Stat5b、Stat6在不同OSF分型中的表达量变化不显著（P＞0．05）。Stat1和p‐Stat1在OSF并存OLP组中的表达水平与对照组比较显著增加（P＜0．05）,Stat3和p‐Stat3（Ser727）在OSF并存OLP组中的表达水平与对照组比较明显上调（P＜0．05）。与对照组比较,Stat5a在OSF并存OLP组中显著上调,而p‐Stat5a在各组中变化不显著。结论 STATs蛋白家族成员Stat1、Stat3、Stat5a在OSF及其并存OLP中表达上调。     

雷公藤甲素对乳腺癌细胞P53、P73基因甲基化的影响以及对细胞增殖的抑制作用

摘要 目的：研究雷公藤甲素（triptolide,TP）对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖的影响及其与P53、P73基因表达和甲基化状态的关系。方法：用不同浓度（10、20、40ng/ml）TP处理MCF-7细胞,采用MTT法检测TP对MCF-7细胞增殖的作用;RT-PCR检测MCF-7细胞甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表达;甲基特异性PCR检测TP对MCF-7细胞P53/P73基因甲基化的影响; 蛋白质印迹分析检测MCF-7细胞中P53/P73蛋白的表达。结果：TP剂量依赖性地抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05, P<0.01）,其半数抑制浓度（IC50）约为20ng/ml（P<0.01）,高浓度（40ng/ml）时抑制率达（70.13.52）%。TP可明显抑制MCF-7细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA（P<0.05,P<0.01）的表达。TP处理MCF-7细胞后P53启动子区的甲基化降低,TP(20ng/ml)处理后P53 mRNA的表达升高,而在高浓度(40ng/ml) TP作用下表达明显上调(P<0.0501);TP处理MCF-7细胞后P73基因启动子区的甲基化则明显降低,并呈剂量依赖性,且TP(20ng10ng/ml)处理后P73 mRNA的表达亦明显增强(P<0.0105) ,并呈剂量依赖性。蛋白质印迹分析检测TP(20ng/ml)处理MCF-7细胞后,P53、P73蛋白的表达均增强。结论：TP可通过抑制甲基转移酶活性、抑制P53特别是P73基因启动子区甲基化,促进P53/P73的表达,从而抑制MCF-7细胞的增殖。     

MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态与多药耐药的关系

目的：分析MCF-7/Adr及MCF-7细胞mdr-1基因启动子甲基化和组蛋白乙酰化状态,初步探讨乳腺癌多药耐药的表观遗传机制。 方法：用甲基化敏感PCR技术检测两个细胞系mdr-1基因启动子甲基化状态。实时定量PCR技术检测DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases,DNMTs) mRNA及组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs) mRNA的表达。光密度值法检测组蛋白H3和H4乙酰化水平。 结果：MCF-7细胞mdr-1基因启动子呈现高甲基化,MCF-7/Adr细胞mdr-1基因启动子呈现低甲基化。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞DNMT1,DNMT3a及DNMT3b mRNA表达显著下降(P＜0.05)。MCF-7/Adr细胞组蛋白H3和H4乙酰化水平较MCF-7细胞明显升高(P＜0.01)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/Adr细胞HDAC1,HDAC2,HDAC7及SIRT1 mRNA的表达显著下降(P＜0.01)。 结论：mdr-1基因启动子低甲基化、组蛋白H3和H4高乙酰化、DNMTs mRNA及HDACs mRNA低表达可能是介导MCF-7/Adr细胞MDR形成的重要表观遗传学因素。     

变异催乳素受体Delta S2促使p53基因组蛋白甲基化

Background Prolactin （PRL） is a pituitary polypeptide hormone characterized by multiple biological actions includingstimulation of growth in the prostate and formation of secretory alveoli and stimulation of milk protein gene expression inthe mammary gland. PRL exerts its effect by dimerizing its receptor （PRLR） on the plasma membrane and regulating geneexpression through the JAK-Stat signal pathway. We have previously described a natural variant of the PRLR in which the$2 subdomain of the extracellular domain is missing （Delta S2）. Delta S2 PRLRs are dimerized in the absence of PRL andhave constitutive activity in the promotion of breast cancer cell growth. Enhancer of zeste homolog 2 （EZH2）, as one of thehistone-modifying enzymes, is a key factor regulating gene expression by epigenetic modification. We hypothesized thatthese constitutive activated Delta S2 PRLRs played a pathogenic role in breast cancer in part through alterations in theexpression of EZH2 and the trimethylation of histone 3 on lysine 27 （H3K27Me3）.     

m iR-335通过靶向生存素对乳腺癌细胞增殖的调控作用

目的：探讨miR‐335通过靶向生存素对乳腺癌细胞增殖的调控作用。方法（1）选取乳腺癌组织及癌旁正常组织,分别采用RT‐PCR、Western blot检测组织中 miR‐335及生存素蛋白表达。（2）选取乳腺癌细胞系 MCF‐7,分别转染 miR‐335 mimic及mimic对照组,采用RT‐PCR、Western blot检测组织中miR‐335及生存素蛋白表达。（3）选取乳腺癌细胞系MCF‐7,分别将野生型survivin 3′‐UTR质粒（survivin‐wt）和突变型survivin 3′‐UTR质粒（survivin‐Mut）与miR‐335 mimic或模拟物阴性对照（NC）共转染至乳腺癌细胞系MCF‐7,双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性。（4）选取乳腺癌细胞系MCF‐7,分别转染mimic对照组、miR‐335 mimic及miR‐335 mimic＋survivin ,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞增殖活性。结果（1）与癌旁组织相比较,乳腺癌组织中miR‐335表达显著降低（P＜0．05）,同时生存素蛋白表达显著增高（P＜0．05）。（2）与转染mimic对照组相比较,转染miR‐335 mimic可使乳腺癌细胞MCF‐7中miR‐335表达上调（P＜0．05）,同时生存素蛋白表达表达下调（P＜0．05）。（3）与转染NC相比较,共转染miR‐335 mimic与survivin‐wt可使MCF‐7荧光素酶活性降低（P＜0．05）,而共转染miR‐335 mimic与survivin‐Mut则MCF‐7荧光素酶活性无显著性变化（P＞0．05）。（4）转染miR‐335mimic后,MCF‐7增殖活性较转染mimic对照组显著降低（P＜0．05）;而转染miR‐335 mimic＋survivin后,MCF‐7增殖活性较单纯转染miR‐335 mimic显著提高（P＜0．05）,但仍显著低于转染mimic对照组（P＜0．05）。结论在乳腺癌组织中miR‐335呈现低表达,生存素呈现高表达;而miR‐335可通过靶向生存素抑制乳腺癌细胞系MCF‐7增殖。     

RT-PCR分析工频磁场暴露后MCF-7细胞p53 mRNA的表达

目的：观察工频磁场暴露对MCF－7细胞p53mRNA表达的影响。方法：将人乳腺癌MCF－7细胞暴露或假暴露于60Hz,5mT工频场中4，8和24h，采用RT－CR方法定量分析照射后不同时间MCF－7细胞p53mRNA的表达水平。结果：工频磁场暴露4，8和24h，MCF－7细胞p53mRNA的表达水平保持不变，结论：工频磁场暴露对MCF－7细胞p53mRNA的表达没有影响。     

p16基因抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的体外和体内实验研究

目的 :探讨p16基因对乳腺癌的治疗作用 ,为乳腺癌 p16的基因治疗提供实验依据。 方法 :构建p16的逆转录病毒载体 pLMSN ,包装成病毒后 ,体外转导p16基因纯合性缺失的乳腺癌细胞株MCF 7,Westernblot证明该基因在转导后的MCF 7细胞中有表达 ,用活细胞计数、流式细胞仪、形态观察等方法来检测 p16表达在体外对MCF 7细胞生物学行为的影响。进行SCID鼠体内成瘤实验和逆转录病毒直接注射SCID鼠乳腺癌模型的治疗性实验来观察 p16对乳腺癌细胞的体内抑制作用。 结果 :外源性 p16在MCF 7细胞中表达后 ,体外细胞发生形态改变 ,生长明显慢于对照细胞 ,流式细胞计数显示G1期细胞增多 ,细胞在SCID鼠体内成瘤性下降 ,p16逆转录病毒直接注射有使SCID鼠乳腺肿瘤缩小的趋势。结论 :p16逆转录病毒对p16基因纯合性缺失的乳腺癌有一定治疗意义     

H3K27me3聚集MEG3 lncRNA启动子通过MDM2/p53途径诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡逃逸

目的 从组蛋白甲基化与长链非编码 RNA ( ln-cRNA)相互作用角度探讨多发性骨髓瘤( MM)细胞凋亡逃逸的具体机制.方法 MTT法检测细胞增殖活性;Annex-inV-FITC/PI双标流式细胞术检测下调组蛋白H3第27位赖氨酸上三甲基化H3K27me3 的表达是否可以诱导多发性骨髓瘤细胞株—RPMI8226 细胞凋亡; RT-PCR 法检测 RP-MI8226细胞中人母系表达基因( MEG3) lncRNA及鼠双微体基因 2 ( MDM2 )的 mRNA 表达; Western blot 检测 RP-MI8226 细胞中 Zeste 基因增强子同源物 2 ( EZH2 )、H3K27me3、MDM2 及 p53 蛋白表达; ChIP Real -time PCR检测RPMI8226细胞中 H3K27me3 的结合位点.结果 在RPMI8226 细胞中,下调 H3K27me3 可诱导细胞凋亡;H3K27me3可直接结合于 MEG3lncRNA 启动子; RPMI8226细胞中抑制了 H3K27me3 可上调 MEG3lncRNA 表达; RP-MI8226经MEG3lncRNA 小干扰 RNA ( MEG3lncRNA -siR-NA)干预下调MEG3lncRNA时,细胞内MDM2 mRNA水平明显升高,并诱导 MDM2 蛋白表达.给予 MDM2 拮抗剂后, Ub-p53 表达降低, p53 降解被抑制.结论 MM 中H3K27me3结合MEG3 lncRNA启动子,MEG3lncRNA启动子H3K27me3高表达导致MEG3 lncRNA表达缺失. MEG3 ln-cRNA表达缺失解除MDM2的抑制, MDM2与p53直接结合介导p53泛素化,促使p53降解,细胞凋亡逃逸.     

FLAG Pull-down技术筛选人乳腺癌细胞中NGAL相互作用蛋白

目的 构建含有NGAL基因的p3XFLAG-NGAL真核表达载体并对其进行鉴定,获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白.方法 提取MCF7细胞中总RNA,反转录为cDNA后采用聚合酶链反应扩增NGAL基因,上下游分别引入NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点,双酶切后将其插入p3XFLAG-CMV-14质粒中,构建p3XFLAG-NGAL重组质粒,并进行双酶切和测序鉴定.采用脂质体法转染该质粒至MCF7细胞中,经Western blot检测FLAG-NGAL融合蛋白的表达情况.再使用FLAG pull-down技术和蛋白质谱测定获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白.结果 经过NotⅠ和EcoRⅠ双酶切及DNA测序验证,本研究成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,免疫印迹法证实转染了p3XFLAG-NGAL载体的人乳腺癌细胞MCF7高表达FLAG-NGAL融合蛋白,并利用FLAG pull-down技术筛选出人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白,经蛋白质谱测定为角蛋白-1(Keratin 1,KRT1).结论 成功构建p3XFLAG-NGAL真核表达载体,并获取人乳腺癌细胞MCF7中NGAL相互作用蛋白KRT1,为下一步研究乳腺癌的发生、发展机制提供新的思路和靶点.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对乳腺癌MCF7细胞周期作用及分子机制探讨

目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对乳腺癌MCF7细胞周期的作用及机制.方法 用0.5、1.0、1.5;μmol/L MS-275作用于乳腺癌MCF7细胞24 h,用MTT 法观察不同浓度MS-275对乳腺癌MCF7细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测乳腺癌MCF7细胞生长及周期,Western-blotting法检测MS-275对乳腺癌MCF7细胞周期相关基因表达的影响.结果 1.0 μmol/L的MS-275对乳腺癌MCF7细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系,在1.0 μxmol/L浓度之上可明显诱导乳腺癌MCF7细胞周期阻滞,增强p21、p27基因的表达,降低CCNDl、Cdk4D基因的表达.结论 一定剂量MS-275抑制乳腺癌MCF7细胞的生长,细胞阻滞的发生与p21、p27基因表达的增加及CCND1、Cdk4D基因表达的减少相关.     

miR-376c-3p通过靶向谷氨酸受体相互作用蛋白1影响乳腺癌细胞的增殖和迁移

目的:探讨miR-376c-3p在乳腺癌中的表达水平、生物学功能及分子调控机制.方法:通过实时荧光定量PCR检测乳腺上皮MCF-10A细胞及乳腺癌细胞中miR-376c-3p表达水平;然后,用miR-376c-3p mimic转染乳腺癌MCF-7与MDA-MB-231细胞,用平板克隆实验、划痕实验以及Transwell...     

大黄素通过调节miR-582-3p影响MAP3K1活性抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡[1]

目的:探究大黄素通过microRNA (miR)-582-3p/MAP3K1对乳腺癌细胞增殖、凋亡的作用及分子机制。方法:检测大黄素及miR-582-3p异常表达对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。qRT-PCR检测miR-582-3p及MAP3K1的表达。MTT检测乳腺癌细胞增殖,流式细胞术和TUNEL实验检测细胞凋亡。western blot检测增殖标志蛋白Ki-67及凋亡标志蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3在癌细胞中的表达水平。结果:大黄素可以抑制乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231的增殖能力及促进凋亡。western blot结果显示大黄素会抑制细胞中Ki-67及Bcl-2的表达并促进Caspase-3 (cleaved)及Bax的表达。大黄素处理乳腺癌细胞后miR-582-3p的表达显著下调。过表达miR-582-3p会下调大黄素对乳腺癌细胞生物学活性的影响。大黄素还会通过miR-583-3p调节癌细胞中MAP3K1的表达。结论:大黄素通过调节miR-582-3p影响MAP3K1活性抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡。