BIOMED-2标准化基因重排检测在非霍奇金淋巴瘤诊断中的意义

目的:利用BIOMED-2标准化免疫球蛋白(Ig)/T细胞受体(TCR)基因重排检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者骨髓Ig或TCR基因重排,探讨Ig/TCR基因重排在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用意义。方法:从骨髓及石蜡包埋组织(FFPE)标本中提取基因组DNA,采用BIOMED-2系统引物,进行多重PCR扩增并利用PCR片段分析法进行Ig/TCR基因重排的克隆性分析。结果:在235例T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)中,TCRγ和TCRx单克隆重排阳性率分别为57.9%和50.2%,TCRγ和TCRβ的联合检出率为71.9%。在583例B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)IgH和IgK单克隆重排阳性率分别为70.7%和69.3%,IgH和IgK的联合检出率为81.6%。套细胞淋巴瘤与滤泡淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤IgH(84.8%对34.0%(P0.001);84.8%对9.2%(P=0.025)和IgK(75.8%vs 50.9%,P0.001;75.8%vs 16.1%(P0.001)重排阳性率差异具有统计学意义。Ig基因重排阳性BNHL患者中,65例(13.7%)患者存在TCR重排阳性。TCR重排阳性T-NHL患者中,未见Ig基因重排阳性。30例弥漫大B细胞淋巴瘤患者FFPE标本有25例(83.3%)检出Ig基因重排,与骨髓标本重排检出率相比较,差异具有统计学意义(P0.001)。结论:利用BIOMED-2标准化Ig/TCR基因重排检测对于淋巴瘤的诊断有辅助性作用,并且利用序列分析法可提高重排检测的敏感性和特异性,对于淋巴瘤的早期诊断有很高的价值。     

BIOMED-2标准化免疫球蛋白基因重排技术在石蜡包埋弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的应用

目的探讨石蜡包埋组织标本应用BIOMED-2标准化免疫球蛋白(IG)基因重排技术检测弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的可行性。方法从45例石蜡包埋组织标本中提取DNA,采用BIOMED-2系统引物进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增,并应用PCR片段分析法进行IG基因重排的克隆性分析。结果将DNA由原浓度100~500 ng/μL稀释至50~100 ng/μL后,DNA扩增最大片段(300~400 bp)含量由10.0%提高到90.0%;45例DLBCL石蜡切片标本提取DNA进行免疫球蛋白重链基因(IGH)和免疫球蛋白kappa基因(IGK)克隆性分析,IGH+IGK阳性率达到84.4%;15例反应性淋巴组织增生标本进行IG/T淋巴细胞抗原受体(TCR)克隆性分析,未见克隆性重排。结论稀释DNA是唯一可以既提高DNA扩增最大片段又能提高克隆性检出率的方法。在DLBCL的诊断和淋巴组织增生性疾病的鉴别诊断中,BIOMED-2标准化体系检测IGH基因克隆性重排是一种快速、可靠的方法,具有重要的临床应用价值。     

BIOMED-2标准化的IG/TCR基因重排克隆性分析系统及其应用研究

目的 探讨BIOMED-2标准化的IG/TCR基因重排克隆性分析系统在疑难淋巴组织增牛性病变中的应用.方法 对67例难以从形态上区分良、恶性的淋巴组织增生性病变,采用BIOMED-2系统引物,提取标本中的DNA,进行抗原受体分子PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳,进行IG/TCR基因重排的克隆性分析.结果 67例淋巴组织增生性病变中,33例进行了IG和TCR克隆性分析,19例进行了IG和15例进行了TCR克隆性分析.共有25例检测到克隆性重排,从而确诊为淋巴瘤,其中IG克隆性重排有15例为B细胞性淋巴瘤;TCR克隆性重排有8例为T细胞件淋巴瘤;同时存在IG和TCR克隆性苇排2例,为复合性T细胞和B细胞性淋巴瘤;其余42例旱多克隆性,为淋巴组织反应性增生.结论 BIOMED-2系统是一种全面优化设计的IG/TCR基因重排克隆性分析系统,是疑难淋巴组织增牛性病变中鉴别淋巴瘤与反应性增生的客观性手段.     

免疫球蛋白基因重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤诊断中的意义

摘要：目的?探讨骨髓及外周血免疫球蛋白(Ig)基因重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)诊断中的临床意义。方法?采用多重聚合酶链反应(mPCR)技术并根据BIOMED-2引物系统对103例B-NHL患者及20例反应性淋巴组织增生患者骨髓及外周血标本基因组DNA进行扩增，对PCR产物进行IgH、IgK基因重排的克隆性分析。结果?103例B-NHL患者中IgH和IgK单克隆重排阳性率分别为41.7%和50.5%，IgH和IgK联合检出率为64.1%。59例慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小B细胞淋巴瘤(SLL)患者中共检出Ig基因单克隆重排49例(83.1%)；除CLL/SLL以外的其他44例B-NHL患者中有17例(38.6%)检出Ig基因单克隆重排，而在20例反应性淋巴组织增生患者中均未检出。70例B-NHL患者外周血标本Ig基因重排检出率与骨髓标本之间的差异无统计学意义(45.7% vs 54.3%，χ2=1.03，P=0.31)；26例CLL/SLL患者外周血Ig基因重排率与骨髓标本之间的差异无统计学意义(69.2% vs 80.8%，χ2=0.92，P=0.34)；44例非CLL/SLL患者外周血Ig基因重排率与骨髓标本之间的差异亦无统计学意义(31.8% vs 38.6%，χ2=0.45，P=0.50)。结论?Ig基因重排可用于B-NHL的临床诊断，外周血与骨髓Ig基因重排检测具有同等的诊断价值。     

非霍奇金淋巴瘤患者免疫球蛋白及T细胞受体基因重排研究

目的 研究非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者骨髓或外周血免疫球蛋白(Ig)/T细胞受体(TCR)基因单克隆重排特点及其临床意义.方法 以BIOMED-2引物系统及多重PCR方法对139例NHL患者骨髓或外周血标本进行Ig及TCR基因重排检测.结果 在B系NHL(B-NHL)中,82例慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中有70例(85.4％)检出Ig基因单克隆重排,其中IgH、IgK、IgL单克隆重排阳性率分别为46.3％(38例)、62.2％(51例)和1.2％(1例).其他类型的B-NHL患者有39.4％(33例中有13例)检出Ig基因单克隆重排,其中IgH和IgK单克隆重排阳性率分别为33.3％(11例)和39.4％(13例),未检测到IgL基因单克隆重排.T系NHL(T-NHL)患者中有50.0％(24例中有12例)检出TCR基因单克隆重排,其中TCRB和TCRG单克隆重排阳性率分别为8.3％(2例)和45.8％(11例),TCRB和TCRG双重基因重排阳性率为4.2％(1例),未检测到TCRD单克隆重排.11例早期(Ann Arbor Ⅰ、Ⅱ期)与46例晚期(Ⅲ、Ⅳ期)患者的Ig/TCR基因单克隆重排阳性率分别为36.4％和45.6％;10例惰性患者和47例侵袭性患者的Ig/TCR基因单克隆重排阳性率分别为40.0％和44.7％,差异均无统计学意义(P值均＞0.05).除外CLL的57例NHL患者骨髓涂片检测骨髓侵犯阳性率为12.3％,明显低于骨髓基因重排检测阳性率(43.9％),两者差异有统计学意义(P＜0.05).敏感性试验表明多重PCR检测恶性克隆的敏感性为3.12％～6.25％.结论 NHL的临床分期和恶性程度不同,其Ig/TCR基因单克隆重排阳性率有差异,但未能证实其相关性.联合应用BIOMED-2多重引物可提高PCR检测骨髓和(或)外周血Ig/TCR基因单克隆重排的敏感性.多重PCR对NHL患者骨髓侵犯检测的敏感性优于骨髓涂片检查,有助于早期发现骨髓侵犯及预防复发.     

抗原受体基因重排克隆性检测在淋巴瘤诊断中的应用

本研究旨在探讨抗原受体基因重排克隆性检测在淋巴瘤诊断中的意义。收集分析了31例淋巴瘤组织,石蜡包埋切片,HE染色后观察形态,免疫组织化学分析免疫表型。采用BIOMED-2标准化试剂盒检测抗原受体基因重排克隆性。结果表明,31例病例中形态学及免疫组织化学分析疑似T细胞淋巴瘤12例,T细胞反应性增生1例,B细胞淋巴瘤16例,B细胞反应性增生2例。基因重排克隆性检测免疫球蛋白(Ig)阳性率94.44%(17/18),T细胞抗原受体(TCR)阳性率92.31%(12/13),2例阴性。最终12例确诊为T细胞淋巴瘤,B细胞淋巴瘤17例,反应性增生2例,阳性检出率为93%。结论:抗原受体重排基因克隆性分析是诊断淋巴瘤的一种有效辅助手段。     

多重PCR检测基因抗原受体重排在儿童急性淋巴细胞白血病诊断中的应用

目的 建立多重PCR方法检测免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）基因重排,探讨在儿童急性淋巴细胞白血病诊断和鉴别中的作用.方法 参照BIOMED-2协作组制定的Ig和（或）TCR检测方法,对儿童ALL患儿114 例,分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRG和TCRB基因重排.结果 在105例B系儿童ALL患者中,克隆重排的检出率分别为IgH 73%、IgK34%、TCRG 44%和TCRB 35%,所有B-ALL患者Ig基因重排检出率可达85%;在11例T系ALL患者中,克隆重排的检出率分别为TCRB 82%和TCRG 73%,T-ALL 患者TCR基因重排检出率可达100%.结论 BIOMED-2引物系统可以检测出绝大多数儿童ALL患者的Ig/TCR基因重排,是一种有效的检测工具,值得在临床中推广使用.     

多重PCR法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病患者克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因重排

目的 应用多莺PCR方法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的克隆性免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因重排,为实时定量RT-PCR(RQ-PCR)法监测ALL患者体内的微量残留病(MRD)奠定基础.方法 参照BIOMED-2协作组制定的Ig和(或)TCR检测方法,设计96条不同的PCR引物,分成14个混合管,通过多重PCR,分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRB、TCRG、TCRD克隆性基因重排.结果 在22例成人B系ALL患者中,Ig克隆性重排检出率为96%,其中IgH为86%,IgK为14%.在18例成人T系ALL患者中,TCR克隆性重排检出率为100%,其中TCRB为83%,TCRG为78%,TCRD为39%.两个及两个以上克隆性标志物的检出率在B和T系ALL中分别为91%(22例中20例)和89%(18例中16例).结论 BIOMED-2协作组设计的14管多重PCR引物和方法,几乎可检测到淋巴细胞白血病患者体内所有占优势的克隆性T、B细胞增殖群体,方法简便、可靠、覆盖面广,适用于成人ALL患者基因重排检测和MRD监测.     

云南地区NK/T细胞淋巴瘤中Ig/TCR基因重排、EB病毒及免疫表型的检测

目的对云南地区NK/T细胞淋巴瘤的Ig/TCR基因重排、免疫表型以及EB病毒感染情况进行检测,为鉴别诊断NK/T细胞淋巴瘤提供依据。方法收集云南地区50例NK/T细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织标本,免疫组化法检测LCA、CD79α、CD20、CD56、CD3、CD45RO、CD8、TIA-1、CD5抗体的表达;原位杂交法检测EB病毒编码的小分子RNA(EBER1/EBER2); BIOMED-2引物系统PCR扩增检测Ig/TCR基因的重排情况。结果 50例NK/T细胞淋巴瘤LCA、CD3、CD45RO、TIA-1、CD56、CD8和CD5阳性率分别为100%、76%、96%、98%、84%、28%和82%,CD79α和CD20均(-);原位杂交EBER阳性率为84%;基因重排检测Ig均为(-),TCR单克隆重排阳性率为16%。结论云南地区NK/T细胞淋巴瘤中存在少部分T细胞的单克隆性增生(16%);NK/T细胞淋巴瘤中大部分病例CD56为(+);EBER在鼻型NK/T细胞淋巴瘤的肿瘤细胞中呈高表达,提示可能为NK细胞来源。部分TCR基因单克隆重排阳性病例应为鼻NK样T细胞淋巴瘤。通过组织形态学、基因重排、免疫表型、EB病毒检测联合可以为NK/T细胞淋巴瘤的诊断提供可靠的依据。     

Ig基因重排检测在B细胞性淋巴瘤诊断中的应用

目的探讨Ig基因重排检测在B细胞性淋巴瘤中的诊断价值。方法选取B细胞性淋巴瘤30例、淋巴组织反应性增生30例,提取DNA,应用BIOMED-2引物系统中的47条引物进行PCR扩增,核酸分子异源双链凝胶电泳分析Ig基因重排结果。结果 30例B细胞性淋巴瘤中检测出Ig克隆性重排,包括IGH(A+B)克隆性重排23例,IGK克隆性重排23例,IGL克隆性重排5例,IGH(A+B)+IGK克隆性重排30例,IGHA+IGK克隆性重排29例;在30例淋巴组织反应性增生中未检测到Ig克隆性重排。结论 Ig基因重排是诊断B细胞性淋巴瘤的有用工具。     

Detection of T-cell receptor gene rearrangement in children with Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis using the BIOMED-2 multiplex polymerase chain reaction combined with GeneScan analysis

BackgroundHemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) is a serious immune disorder. Epstein–Barr virus (EBV) is the most common trigger of secondary HLH. T-cell receptor (TCR) gene rearrangement is detectable in half of patients with EBV-associated HLH using Southern blotting and conventional polymerase chain reaction (PCR) analyses. However, its clinical significance is unclear. The impact of TCR gene clonality on the outcome of patients with EBV-HLH should be evaluated using more sensitive methods. In this study, we used BIOMED-2 multiplex PCR and GeneScan analysis to evaluate TCR gene rearrangement in childhood EBV-HLH.MethodsSix children with EBV-HLH were enrolled in this study. EBV load in blood was quantified by real-time PCR. TCR gene rearrangement was analyzed by BIOMED-2 multiplex PCR.ResultsAll 6 patients showed monoclonal peaks in TCRβ and/or TCRγ at diagnosis. Serial monitoring of one patient disclosed a change in the rearrangement pattern of the TCR genes in response to immunochemotherapy.ConclusionThese findings suggest that BIOMED-2 multiplex PCR, a highly sensitive method for detecting T-cell clonality, is useful for predicting the therapeutic response in childhood EBV-HLH.     

BIOMED-2方法检测恶性淋巴瘤骨髓侵犯的基因重排研究

本研究探讨BIOMED-2方法检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者骨髓中免疫球蛋白(IG)和T细胞受体(TCR)基因克隆性重排的可行性,并初步评价其临床价值。采用BIOMED-2系统检测73例NHL(B-NHL 55例,T-NHL 18例)患者骨髓中IGH、IGK、IGL基因和TCRβ、TCRγ、TCRδ基因的克隆性重排,与骨髓穿刺细胞形态学进行比较,评价其与病理特征、临床分期等的相关性。结果表明:73例NHL中31例检测出IG或TCR基因重排,阳性率42.5%,高于骨髓穿刺细胞形态学阳性率24.7%(18/73),差异具有统计学意义(p<0.05);其中B-NHL阳性率为40.0%(22/55),T-NHL阳性率为50.0%(9/18),两者差异无统计学意义(p>0.05)。PCR检测阳性率和AnnArbor分期相关,Ⅲ/Ⅳ期患者阳性率高于Ⅰ/Ⅱ期,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:BIOMED-2检测IG和TCR基因重排是判断淋巴瘤骨髓浸润的有效方法,比骨髓细胞形态学更为敏感,有助于临床分期、预后判断和治疗选择。PCR检测阳性率和Ann Arbor分期相关,与淋巴瘤恶性程度、年龄、治疗状态、有无B组症状及是否累及脾脏无关。     

BIOMED-2 multiplex immunoglobulin/T-cell receptor polymerase chain reaction protocols can reliably replace Southern blot analysis in routine clonality diagnostics

To establish the most sensitive and efficient strategy of clonality diagnostics via immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangement studies in suspected lymphoproliferative disorders, we evaluated 300 samples (from 218 patients) submitted consecutively for routine diagnostics. All samples were studied using the BIOMED-2 multiplex polymerase chain reaction (PCR) protocol. In 176 samples, Southern blot (SB) data were also available, and the two types of molecular results were compared. Results of PCR and SB analysis of both T-cell receptor and immunoglobulin loci were concordant in 85% of samples. For discordant results, PCR results were more consistent with the final diagnosis in 73% of samples. No false-negative results were obtained by PCR analysis. In contrast, SB analysis failed to detect clonality in a relatively high number of samples, mainly in cases of low tumor burden. We conclude that the novel BIOMED-2 multiplex PCR strategy is of great value in diagnosing patients with suspected B- and T-cell proliferations. Because of its higher speed, efficiency, and sensitivity, it can reliably replace SB analysis in clonality diagnostics in a routine laboratory setting. Just as with SB results, PCR results should always be interpreted in the context of clinical, immunophenotypical, and histopathological data.     

Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements as markers of lineage and clonality in malignant lymphoma

In the process of lymphocyte differentiation, genes encoding variable regions of immunoglobulin and T-cell receptor undergo rearrangement. Such gene rearrangements represent markers of lineage and clonality of lymphocytes, allowing molecular diagnosis of human lymphoid neoplasms. Gene rearrangements are analyzed by Southern hybridization, using DNA probes specific for immunoglobulin heavy chain (IgH) and T-cell receptor beta (TCR beta) chain. This approach can detect monoclonal lymphoid populations that constitute 1-5% of total cells in tissues, and can be used successfully to distinguish lymphoid neoplasms from polyclonal lymphoid proliferations and to determine the lymphocytic lineage of neoplasms; i.e., rearrangement of IgH genes without TCR beta gene rearrangement strongly supports B-lineage, while rearrangement of TCR beta without IgH gene rearrangement implies T-lineage.     

SET-NUP214融合基因阳性儿童白血病/淋巴瘤Ig/TR基因重排模式及其临床特征

为分析3例少见SET-NUP214融合基因阳性儿童免疫球蛋白和T细胞受体基因（Ig/TR）重排模式及其临床特征,采用逆转录巢式聚合酶链反应（RT-nested PCR）检测SET-NUP214融合基因表达;采用欧洲BIOMED-2协作组设计的多重PCR体系,分析Ig/TR重排模式,并根据连接区序列设计特异性引物监测微小残留病（MRD）。结果表明,在mRNA水平3例患儿融合基因的融合位点位SET基因的第7外显子和NUP214基因的第18外显子之间。3例患儿分别诊断为混合表型急性白血病（MPAL,患儿1）、急性T淋巴细胞白血病（T-ALL,患儿2）和Ⅳ期T淋巴母细胞淋巴瘤（T-LBL,患儿3）。患儿1治疗反应极差,在造血干细胞移植后6个月复发;患儿2在诱导缓解治疗结束时（第33天）MRD〉10^-2,提示预后较差,在巩固治疗期死于中毒性表皮坏死溶解症导致的严重感染;患儿3在第15天时即获得血液学完全缓解（CR）,第33天时MRD转阴,CR已30个月。3例患儿均检出TR基因克隆性重排,患儿1和患儿3检出TRD、TRG、TRB基因重排;患儿2只有TRD、TRB基因重排,还检出IgH以及IgKKde重排。3例患儿共检出6个TRB基因重排,均为不完全重排;TRD、TRG基因重排中,85.7%（6/7）为完全重排,14.3%（1/7）为不完全重排。结论：SET-NUP214^＋白血病/淋巴瘤细胞发生恶性转化的阶段可能在TRG、TRD基因重排之后、TRB基因重排开始不久。患儿1、患儿2的肿瘤细胞的不成熟程度较高,可能与预后或治疗反应差存在一定相关性。     

The frequency of immunoglobulin heavy chain gene and T-cell receptor gamma-chain gene rearrangements and Epstein-Barr virus in ALK+ and ALK- anaplastic large cell lymphoma and other peripheral T-cell lymphomas

We previously identified a relatively high frequency of B-cell proliferations along with simultaneous T-cell receptor gamma-chain gene (TRG) and immunoglobulin heavy chain gene (IGH) rearrangements in a series of angioimmunoblastic T-cell lymphoma and peripheral T-cell lymphoma, unspecified. Here, we report on a series of 74 peripheral T-cell lymphoma (PTCL) cases composed entirely of specific PTCL subtypes, including 28 cases of ALK+ anaplastic large-cell lymphoma (ALCL), 35 cases of ALK- ALCL, and 11 cases that represent other specific PTCL subtypes. We performed IGH and TRG gene rearrangement studies and in situ hybridization for Epstein-Barr virus (EBV) to determine the frequency of IGH clonality and to investigate the relationship between EBV, clonality, and associated B-cell proliferations. Using BIOMED-2 PCR assays, we detected TRG clones in 64 of 74 (86%) cases and IGH clones in 6 of 74 (8%) cases, with all IGH-positive cases exhibiting a concurrent TRG clone. Despite the detection of occasional IGH clones, there was no correlation between IGH clonality and EBV, and B-cell proliferations were not identified in any of the cases. These findings suggest that other factors contribute to IGH clonality and demonstrate that, in the absence of an associated B-cell proliferation, IGH clonality occurs infrequently (8%) in specific PTCL subtypes.