应用多重RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法检测儿童白血病常见融合基因

本研究探讨基因芯片在儿童白血病8种常见融合基因检测中的应用。采用多重巢式RT-PCR结合寡核苷酸芯片方法对84例临床收集的白血病标本进行融合基因检测。结果表明：此芯片可以从患者骨髓样本RNA中准确检测到阳性参照序列以及与融合基因相对应的特异基因片段。84例白血病患者骨髓标本中,31例（36．90％）具有8种染色体结构畸变产生的融合基因。包括te1／am11、e2a／pbx1、bcr／ablp190、bcr／ablp210、m11／af4、am11／eto、pm1／rarα、cbfβ／myh11。芯片检测的敏感性及特异性和RT—PCR方法相当。结论：采用多重巢式RT—PCR结合寡聚核苷酸芯片方法,可快速并同时筛选出8种染色体结构畸变产生的融合基因,为儿童白血病危险分层、治疗选择、预后判断提供重要依据。此种方法应用于筛查初治白血病儿童融合基因表达时优缺点并存,具有一定临床实用价值。     

寡核苷酸芯片用于HLA-A基因分型的研究

目的 应用寡核苷酸芯片分型方法，对HLA-A基因进行分型研究。方法 采用不对称PCR方法，扩增HLA-A基因的第2，3外显子，荧光标记扩增产物，作为杂交模板。设计分型检测寡核苷酸探针，制备HLA-A基因分型检测芯片。采取差异选择法，筛选强杂交信号和高特异性的分型探针。探索了探针长度、探针位置等对杂交信号的影响。杂交结果经荧光扫描，并用分型软件分析判断阳性探针和HLA-A基因型。结果 30例临床样本芯片分型结果与PCR-SSP及DNA测序分型结果相符。结论 采用寡核苷酸芯片技术对HL-A基因分型是种好的方法，具有测速快、成本低、高通量的优点。     

实时定量RT-PCR检测K562/A02细胞株bcr-abl融合基因mRNA水平

本研究定量分析慢性髓系白血病耐阿霉素细胞株K562/A02细胞中bcr-abl融合基因的mRNA水平。收集对数生长期的K562/A02细胞,用TRIzoL提取RNA,用实时定量RT-PCR(RQ-RT-PCR)技术检测bcr-abl融合基因及内参基因abl mRNA表达水平。结果表明:RQ-RT-PCR技术分析103-107拷贝数的重复性良好,灵敏度达10-5;K562/A02细胞中bcr-abl融合基因为高表达,bcr-abl mRNA表达量大于100%。结论:实时定量PCR检测K562/A02细胞bcr/abl融合基因mRNA水平,敏感可靠,重复性好,有助于临床辅助监测慢性髓系白血病。     

中国实验血液学杂志1998年第6卷主题索引

AAML-Eto融合基因 融合基因检测在AML-M_2与AML-M_3鉴别诊断中的价值及其临 床意义,(2):158axl基因 axl基因在骨髓增生异常综合征患者外周血细胞的表达,(1):63氨基甾体 新型氨基甾体类对粒系白血病HL-60细胞系的增殖抑制和分化 诱导的作用,(4):287 Bbcl-2基因 慢性淋巴细胞白血病bcl-2基因表达与重排的研究,(1):45 RT-PCR检测bcl-2在急性髓细胞白血病的表达及其临床意义, (1):79 bcl-2基因和Fas基因与小儿急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的关 系及其临床意义,(2):129 反义bcl-2正义bcl-Xs逆转录病毒重组体的构建,(2):137bcl-Xs基因 反义bcl-2-正义bcl-Xs逆转录病毒重组体的构建,(2):137bcr-abl bcr-abl融合基因及其检测,(4):253BCR/ABL 融合蛋白     

siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制

为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用。制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA，转染K562细胞株，采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达。结果表明：siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强，0.2ug siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9％和26.6％，但72小时时恢复到原水平，同时转染siRNA后细胞生长受到抑制。结论：siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达。     

Ph染色体和bcr-abl融合基因的动态监测在慢性粒细胞白血病治疗中的临床意义

目的评价Ph染色体和bcr-abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断、治疗及微小残余病变监测中的临床意义。方法应用常规染色体显带技术、半定量反转录PCR(RT-PCR)技术和实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术对20例患者Ph染色体及bcr-abl融合基因进行动态监测,随诊3年。结果 20例慢性粒细胞白血病患者,19例患者Ph染色体阳性,20例均有bcr-abl融合基因阳性,其中11例应用伊马替尼治疗患者中9例患者Ph染色体和bcr-abl融合基因消失,提示遗传学缓解率为81.8%。9例应用常规化疗的患者随诊3年,Ph染色体和bcr-abl融合基因均未转阴。结论 Ph染色体和bcr-abl融合基因动态监测对慢性粒细胞白血病患者诊断、治疗、病情监测及预后判断有重要临床意义。     

DNA芯片技术在恶性血液系统疾病研究中的应用

DNA芯片是近年发展起来的生物高新技术,其基本原理是运用微阵列技术将大量DNA片断附着在固相载体表面或原位合成寡核苷酸制成高密度DNA微点阵,用标记探针与其杂交,进行高通量的基因检测。目前DNA芯片技术已日趋成熟并且应用于基因组水平进行基因表达、突变、测序和多态性分析等。本文对DNA芯片技术在白血病和淋巴瘤研究中的应用进行介绍。     

慢性粒细胞白血病患者胸腺输出功能与bcr-abl mRNA水平的关系

本研究了解慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者体内T细胞受体重排删除环(Tcell receptor rearrangement excision circles,TREC)的含量与bcr-abl mRNA水平的关系,进而明确CML患者的胸腺近期输出功能测定对疾病预后判断的意义.实时定量PCR检测15例CML-CP患者外周血TREC含量及bcr-abl融合基因转录本的水平,并追踪检测6例患者bcr-abl水平的变化.结果发现:在CML初发时患者外周血TREC含量与bcr-abl融合基因水平无明显的相关性;随访2年后,TREC含量高的患者bcr-abl水平下降幅度更大,而在修稿造血干细胞移植的2例患者中,移植前TREC含量相对较高者,移植1年后连续3次均检测不到bcr-abl,另1例则检测到低水平的bcr-abl.结论:CML患者胸腺输出功能较高者,可能对机体抵抗残留CML细胞有一定的帮助.     

异基因造血干细胞移植后慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因水平的动态变化

背景:bcr-abl融合基因不仅是慢性粒细胞白血病的诊断标准,其水平的变化也是判断病情或疗效的惟一指标,尤其是bcr-abl融合基因的动态变化对于异基因造血干细胞移植效果的评估和预后判断可能更为重要.目的:了解慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后bcr-abl融合基因水平的变化情况. 设计:回顾性病例分析.对象:2001-04/2007-01在广东省人民医院血液科收治的确诊1年内行异基因造血干细胞移植的慢性粒细胞白血病患者22例,中位年龄31.5岁,患者对治疗均签署知情同意书,治疗方案经医院医学伦理委员会批准.方法:所有同胞供者均采用粒细胞集落刺激因子行外周血干细胞动员.所有患者均采用改良BU/CY联合FLU预处理方案,供受者血型不相合者于移植前7 d、1 d行血浆置换以降低血型抗体滴度.患者经深静脉输入同胞供者平均单个核细胞数为5.48×108/kg,平均CD34 细胞数为10.45×106/kg.由于移植和随访时间不同,每例患者收集标本3～14份,共130份外周血标本.主要观察指标:通过实时荧光定量PCR法检测22例患者异基因造血干细胞移植后不同时间130份外周血标本中bcr-abl融合基因的水平.结果:移植后6个月内,bcr-abl融合基因总体水平逐渐降低,移植后1、3、6个月bcr-abl阴性患者的比例分别为33.33%、53.33%和84.62%,bcr-abl高水平阳性(bcr-abl/abl ≥ 0.02%)患者的比例分别为58.33%、33.33%和15.38%,低水平阳性(bcr-abl/abl < 0.02%)患者的比例分别为8.33%、13.33%和0.移植6个月后,多数患者连续多次检测不到bcr-abl融合基因,其中持续阴性者9例(69.23%),低水平波动者1例(7.69%),低水平持续阳性者1例(7.69%),复发2例(15.38%);复发的2例患者移植后6个月内连续检测bcr-abl融合基因水平均未降低至0,且3次检测结果中2次属于高水平阳性.结论:异基因造血干细胞移植后,慢性粒细胞白血病患者bcr-abl融合基因总体水平逐渐下降,但不同患者bcr-abl变化情况各异,通过实时定量PCR检测可明确其变化趋势.     

酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗慢性粒细胞白血病的研究

目的:研究特异性酪氨酸激酶抑制剂STI571对慢性粒细胞白血病(简称慢粒)细胞增殖、凋亡、周期调控及bcr-abl融合基因表达的影响,为慢粒的基因治疗提供理论依据。方法:细胞培养慢粒急变细胞系K562细胞株,通过MTT检测STI571作用下细胞存活率,流式细胞仪检测周期变化,电镜及DNA电泳检测细胞凋亡,半定量RT-PCR检测STI571对bcr-abl融合基因表达的影响。结果:STI571作用后K562细胞中G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少。流式细胞图中的二倍体峰前可见一明显亚二倍体峰———凋亡峰(apoptosispeak),提示STI571能明显诱导K562细胞凋亡。电镜发现STI571作用于K562细胞12～72h后,诱导出各期凋亡细胞及凋亡小体。半定量PCR灰度扫描结果显示bcr-abl基因的mRNA表达下降,电泳检测扩增产物,荧光亮度减弱。结论:STI571能明显抑制白血病细胞增殖,细胞阻滞于G0/G1期,且具有明显的诱导凋亡作用,反馈抑制bcr-abl融合基因的表达。     

急性淋巴细胞白血病bcr/abl融合基因表达及其与免疫表型的关系

采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了M-bcr/abl和m-bcr/abl两种类型融合基因在48例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的表达,并且绝大多数病例同时进行了免疫表型和DNA倍体的流式细胞术分析。结果表明,25%(12/48)的病例M-bcr/abl或m-bcr/abl融合基因阳性,m-bcr/abl阳性率略高。分析bcr/abl阳性病例的免疫表型,发现大多数病例为B系标志阳性,但部分T系标志阳性的病例也检测出M-bcr/abl或m-bcr/abl,说明bcr/abl阳性ALL病例以B系标志阳性者居多,T系标志阳性的ALL病例也可为bcr/abl阳性。     

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。     

筑巢式PCR检测22例慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因结果分析

目的：探讨bcl/abl融合基因在慢性粒细胞白血病（CGL）的诊断、治疗和预后判断的价值。方法：对22例CGL患者作筑巢式逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测bcr/abl融合基因。结果：22例CGL患者中21例bcr/abl融合基因阳性，阳性率为95．5％。结论：筑巢式KPCR是一种快速、敏感而准确的检测方法。     

巢式聚合酶链反应对231例白血病融合基因的检测

目的:探讨巢式逆转录聚合酶链反应(巢式RT-PCR)动态检测白血病bcr/abl、PML/RARa及AML/ETO融合基因在白血病诊断、治疗、预后判断的价值。方法:应用巢式PCR法对231例急慢性白血病患者bcr/abl、PML/RARa及AML/ETO融合基因作检测,同时结合患者细胞形态学及临床转归予以分析。结果:94例慢性粒细胞白血病患者中,79例bcr/abl融合基因阳性,阳性率为84.0%;55例急性淋巴细胞白血病患者中,20例bcr/abl融合基因阳性,阳性率为36.4%;50例急性早幼粒细胞白血病患者中,29例PML/RARa融合基因阳性,阳性率为58.0%;32例急性粒细胞白血病M2患者中,9例AML/ETO融合基因阳性,阳性率为28.2%。结论:巢式PCR是一种快速、敏感而准确的检测方法,可为白血病患者提供分子生物学的诊断依据,并可作为微小残留病的监测指标之一。     

慢病毒介导shRNA稳定干扰P210bcr/abl基因表达的体内外研究

P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病(CML)发生、发展中起重要作用。针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂(如伊马替尼)治疗CML非常有效,但容易产生耐药性。P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/ablshRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系,并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率,用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力;用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/ablmRNA和蛋白的表达。结果发现,P210bcr/ablshRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/ablmRNA及蛋白表达明显下降,并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性,与不表达P210bcr/ablshRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比,伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内,移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。结论:稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。     

蛋白转导结构域-bcr/abl融合基因的构建和表达

目的 构建含蛋白转导结构域（PTD）与慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因片段的质粒，并在大肠杆菌中表达。方法 PCR扩增的CML bcr/abl基因片段，经DNA测序后，与合成编码PTD的DNA片段一起手稿质粒pET-16b，构建表达载体pEPb，转化大肠杆菌并进行了PTD－bcr/abl蛋白的诱导表达和纯化。结果 跨越bcr/abl断裂点的523bp的目的片段被有效地扩增，DNA序列分析表明所构建的含PTD－bcr/abl融合基因的质粒与设计相同。PTD－bcr/abl融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化。结论 成功地获得了PTD－bcr/abl融合蛋白片段的基因表达产物，为进一步研究CML的免疫治疗奠定了基础。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测白血病bcr/abl mRNA

目的　建立荧光定量RT PCR法检测白血病融合基因bcr ablmRNA的方法 ,为白血病临床诊断及微量残留病监测提供有用工具。方法　RT PCR扩增培养的K5 6 2细胞bcr abl融合基因 ,A T载体克隆法构建定量标准模板 ,用PE770 0型检测仪 ,建立荧光定量RT PCR方法 ,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定 ;定量检测 14例慢性髓细胞白血病 (CML)患者和 4例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者外周血样本。结果　建立的荧光定量RT PCR方法 ,可检测出约 10 - 5μgK5 6 2总RNA中的bcr abl融合基因和 10个bcr abl重组质粒拷贝 ,重复性的CT值 (Cyclethreshold)管间、批间变异系数 (CV)分别为 :2 0 % ,3.7%。 14例CML患者bcr abl融合基因表达量中位数为 5 .15× 10 4 拷贝 μgRNA ,产物经电泳分析 ,其中 11例为b2a2 ,3例为b3a2 ,1例 12× 10 4 拷贝 μgRNA的CML患者 ,骨髓移植后 1个月变为 0 .2 3× 10 4 拷贝 μgRNA。 4例ALL患者中 1例有bcr abl融合基因的表达 ,为b2a2 ,表达量为 8.2×10 5拷贝 μgRNA。 结论　建立的荧光定量RT PCR方法灵敏、特异、重复性好 ,结果用拷贝数表示 ,准确可靠 ,利于统一标准。该方法能检测出b2a2、b3a2两种类型的融合基因 ,可广泛用于CML的诊断和微量残留病的检测     

慢性髓细胞白血病患者染色体分析及bcr/abl融合基因转录本定量的临床意义

目的探讨慢性髓细胞白血病(CML)患者染色体分析与bcr／abl融合基因定量的临床应用价值。方法17例CML患者采用骨髓细胞短期培养法制备染色体,应用G、R显带技术进行染色体分析,同时采用实时定量RT-PCR技术进行bcr／abl融合基因定量检测,并对其中的9例患者进行了跟踪观察。结果全部患者均检出Ph染色体及表达bcr／abl融合基因,阳性患者之间19cr／abl表达水平差异很大。常规药物治疗后稳定于慢性期的4例患者,bcr／bal表达水平轻度上升或下降,未发现新的染色体异常;进入急变期的3例患者bcr／abl表达平均上升了9．06倍,均出现新的附加染色体异常;2例异基因骨髓移植的患者bcr／abl表达水平随临床治疗而发生变化;bcr／abl变化趋势相同而细胞遗传学结果不同的患者,对药物治疗的反应不同,预后也不一样。结论染色体分析结合bcr／abl基因定量较为全面地反映了CML患者的生物学特性,与疾病进展密切相关,对CML的诊断、疗效评价、预后判断反映白血病细胞负荷有较大的临床价值。     

造血干细胞移植后白血病细胞遗传学和融合基因表达临床意义

目的 探讨造血干细胞移植后白血病细胞遗传学改变和基因表达的情况。方法 用骨髓细胞短期培养法和直接法G显带分析染色体；双色荧光原位杂交检测bcr／abl融合基因。结果 2例供者为女性的男性急性髓细胞性白血病患者allo-PBSCT后，染色体检测持续46，XX。最长生存已50个月。4例慢性髓细胞性白血病经allo-PBSCT。后，Ph染色体阳性和bcr／abl融合基因阳性1例，供者淋巴细胞输注加干扰素治疗，已生存70个月。Ph染色体阴性bcr／abl融合基因阳性2例，最长生存已27个月。Ph染色体阴性bcr／abl融合基因阴性1例，已生存14个月。2例急性髓细胞性白血病自体造血干细胞移植后检测出非特征性染色体畸变，复发后再化疗达完全缓解，最长生存期达81个月。结论 造血干细胞移植后白血病细胞遗传学检测可观察近期疗效，并指导后续治疗方法的选择。     

趋化因子MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达

本文旨在研究MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达,同时观察P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶对MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2 mRNA表达的影响.在bcr/abl融合基因阴性和阳性慢性髓系白血病细胞中,采用半定量RT-PCR方法检测MIP-1α、MCP-1、CCR-1、CCR-2mRNA的表达水平.结果表明MIP-1αmRNA和CCR-1 mRNA在bcr/abl融合基因阳性细胞中不表达,但在bcr/abl融合基因阴性细胞中表达,而MCP-1 mRNA和CCR-2mRNA在bcr/abl融合基因阳性和阴性细胞中均不表达.当P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶被抑制后,MIP-1α和CCR-1的mRNA表达水平恢复至正常水平.结论：P210bcr/abl融合蛋白抑制慢性髓系白血病细胞中MIP-1α和CCR-1 mRNA的表达,但对MCP-1和CCR-2mRNA的表达无影响.