使用多重巢式PCR对我国HIV-1主要流行株亚型鉴定方法的建立

目的 建立一套新的亚型鉴定方法，仅仅使用巢式PCR，一次扩增，即可对我国HIV-1主要流行株B、C和CRF01-AE进行亚型鉴定。方法 从HIV阳性样本中提取核酸，使用能覆盖HIV-1型M组gag区的引物进行第一轮扩增，第二轮扩增则使用分别检测B、C、CRF01-AE亚型的三套特异性引物进行扩增，三套引物放在同一个反应管中。反应产物经琼脂糖电泳后观察，不同亚型的位置不同，以此来判断亚型。另外设计一套引物，专门检测我国重组株CRF07-BC和CRF08-BC。所有样品均经过基因测序、系统进化树分析，以进行结果验证。结果 在检测的119份样品中，经基因测序和系统进化树分析证实B亚型样品43份(欧美B11份，泰国B32份)，C、CRF01-AE、A和D亚型样品分别为54份、17份、3份和2份。其中C亚型的样品，有52份属于CRF07-BC和CRF08-BC。而经过上述多重巢式PCR方法检测到的B亚型样品为35份(81．4％)，C亚型46份(85．2％)和CRF01-AE13份(76．5％)。另外，检测CRF07-BC和CRF08-BC重组株的引物特异性地检测到43份(82．7％)样品。上述结果与基因分析结果吻合，各个亚型之间无交叉，一种亚型的特异性引物只对该亚型有反应，而对其他亚型无反应，特异性达到100％。虽然有时会有非特异扩增带，但一般不影响结果判断。结论 我们建立了一套简单快速的H1V-1亚型鉴定方法，不需基因测序，即可检测我国主要流行株B、C、CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC。该方法具有高度特异性和敏感性，可以作为初筛方法在我国及其他国家HIV-1实验室推广使用。     

广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株env基因V3环序列变异及其与生物表型的关系

目的研究广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株env基因V3环序列变异及其与生物表型间的关系。方法从广西主要流行区收集来的50份HIV-1感染者血液样本中提取前病毒DNA，使用巢式聚合酶链反应（nested-PCR）扩增HIV-1 env基因片段并进行亚型鉴定，选择38份CRF01-AE重组型HIV-1毒株env，基因V3环及邻近区域的序列进行系统树和氨基酸变异分析。结果38份CBF01-AE重组毒株中36份与分离于广西地区的CRF01-AE.97CNGX2f和泰国代表毒株THCM240接近，另外2份与中非共和国代表株90CF402聚成一簇；CRF01-AE重组毒株V3环顶端四肽存在着4种类型：CPCQ、GPGR、GPGH和GPGA；根据V3环关键氨基酸推测辅助受体使用情况，结果显示：71．05％的CRF01-AE重组毒株可能使用CCR5作为辅助受体，28．95％不能对其辅助受体的使用情况做出预测。结论广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株V3顶端四肽变异较大，而且大部分毒株可能为NSI型。这可为广西该毒株的防治和诊断试剂的更新提供参考。     

广州市吸毒强戒人员HIV-1基因亚型分布的初步研究

目的分析吸毒人群HIV感染者中HIV-1的基因序列特征,初步确定其感染的基因亚型和各亚型的流行趋势。方法在Genbank中查找HIVgag基因的序列,设计巢式PCR引物。从全血中提取样本的基因组DNA,进行巢式PCR,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序,所获序列与国际参考株序列进行比对,确定基因型或亚型。结果对36例HIV-1感染者样本进行扩增,PCR共检测出29例阳性样本,27例测序成功,其中16例为CRF08-BC重组亚型、7例为CRF07-BC重组亚型、4例为CRF01-AE重组亚型,15例阴性对照均无目的条带。结论在广州吸毒强戒人员HIV-1型中以CRFBC亚型为主,其次为CRF01-AE亚型。应加强对HIV-1毒株亚型的监测,以制定更好的防治策略。     

湖北省HIV-1流行株gag基因序列测定及亚型分析

目的 了解湖北省HIV-1感染者流行毒株亚型分布和流行趋势.方法 随机采集湖北省HIV-1感染者的抗凝全血标本,分离血浆,提取病毒RNA,用套式聚合酶链反应扩增HIV-1病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 对80份HIV-1感染者的样品进行扩增,得到了62份样品的HIV-1基因片段.共发现7种HIV-1亚型和流行重组株.泰国B'亚型占11.3％ (7/62),欧美B亚型占4.8％ (3/62),G亚型占4.8％ (3/62),CRF07-BC占22.6％ (14/62),CRF08-BC占6.5％(4/62),CRF01-AE占48.4％(30/62),CRF15-01B占1.6％ (1/62).在湖北省发现了CRF15-01B和G亚型.结论 湖北省存在多种HIV-1亚型和流行重组型,CRF01-AE、CRF07-BC两种重组亚型毒株为目前湖北省HIV-1流行优势毒株,应加强对HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略.     

应用多重巢式PCR法快速鉴定广西HIV-1主要亚型

目的 建立快速鉴定广西HIV-1主要流行亚型CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和C的多重巢式PCR方法.方法 针对HIV-1 gag基因设计CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和C亚型特异性引物,建立多重巢式PCR法,用该法鉴定来自广西的HIV-1毒株的亚型,并与基因测序法的鉴定结果比较.结果 多重巢式PCR法能正确鉴别5种已知亚型的样本,10份HIV阴性样本均无扩增,在72份未知亚型样本中,正确鉴定出66份,分别属于CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B亚型,多重巢式PCR法的灵敏度为91.7%,特异度达100%.结论 多重巢式PCR法能准确鉴定广西CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型毒株,是一种简便、快速、低成本的亚型鉴定方法.     

2006年北京市外来人口中HIV-1感染者流行毒株gag基因序列测定和亚型分析

目的了解北京市外来人口中HIV-1亚型的特点和流行规律。方法随机采集北京市2006年外来人口中新确证HIV-1感染者的抗凝全血标本80份，分离血浆，提取病毒RNA，用套式聚合酶链反应扩增病毒gag基因，并进行序列测定和亚型分析。结果系统进化分析确定北京市外来人口HIV-1毒株属于8个亚型，分别为B亚型4份，泰国B亚型15份，C亚型1份，CRF01-AE亚型5份，CRF02-AG亚型1份，CRF07-BC亚型29份，CRF08-BC亚型3份，CRFl5—01B亚型1份。结论北京市外来人口中己存在8种HIV-1亚型和流行重组型，应该加强对HIV-1亚型变异的监测。     

26例有偿献血员HIV-1基因分型与变异特征

目的分析某地区有偿献血人员中流行的人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）gag、pol、env基因亚型及基因变异特征。方法提取HIV-1感染者外周血单核细胞（PBMC）DNA,经巢式PCR（NestedPCR）扩增gag（p17-p24）、pol（PR＊RT）、env（C2-V5）基因片段,纯化测序后用MEGA5．0等生物学软件对核苷酸序列进行分析。结果23份样本为B亚型,2份为B亚型与C亚型重组,1份为CRF01-AE与B亚型重组。PR区未发现蛋白酶抑制剂主要耐药性突变,RT区检测到核苷类逆转录酶抑制剂耐药性突变M184V和非核苷类逆转录酶抑制剂耐药性突变K101E,G190A。结论流行于该地区的HIV-1毒株以B亚型为主。大多数毒株对常规抗病毒药物仍然敏感,使用HARRT治疗方案依然有效。CXCR4型辅助受体的毒株顶端四肽多为GPGR（91．7％）,提示GPGR可能与疾病的进展有关。     

淮安市经异性性传播的HIV感染者中HIV-1病毒基因亚型特征分析

目的 了解淮安市经异性性传播HIV感染者中HIV-1病毒基因亚型分布及其流行特征.方法 从60名异性性传播HIV-1感染者血液中提取DNA或RNA,用巢式PCR或RT-PCR方法扩增gag、env基因区片段,测定序列并分析.结果 60份标本中,确定了48份标本的基因亚型,发现有4种HIV-1亚型和重组型.其中CRF01_AE亚型占62.5％,CRF07_BC亚型占22.9％,CRF08_BC亚型占6.3％,B亚型占6.3％.结论淮安市异性性传播感染HIV者中,流行着CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B亚型这4种亚型病毒株,CRF01_AE为主要流行亚型.     

中国HIV-1主要流行重组株B/C Tat基因第一外显子序列特征分析

目的 研究我国人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)流行重组株B/C Tat基因第一外显子变异特点,探讨这些变化对其功能的影响.方法 从确诊的HIV-1感染者全血样本中提取基因组DNA,经套式聚合酶链反应(PCR)扩增和测序.使用GCG和Bioedit软件中的程序进行系统进化树和氨基酸变异分析,同时进行网上三级结构预测.结果 总计154份样品中CRF07-BC为120份,CRF08-BC为34份,两种亚型有较广泛的分布,CRF07-BC与标准株的平均基因离散率为(5.748±1.352),CRF08-BC与标准株的平均基因离散率为(1.259±1.931).结论 我国流行重组株CRF07-BC比CRF08-BC有较长的流行时间,CRF07-BC与CRF08-BC基因第一外显子氨基酸相比,主要为半胱氨酸富含区和核心区的变化.在这两个区位点变化可能影响Tat与细胞因子如cyclin T1的结合能力,而成为CRF07-BC在我国流行中获得传播优势的原因.     

河北省HIV-1流行株基因序列测定及亚型分析

目的 了解河北省HIV-1流行株的亚型分布和流行趋势.方法 从感染者的血浆样品中提取病毒RNA,逆转录后采用套式PCR扩增HIV-1 gag和env基因的部分片段,对PCR产物直接进行核苷酸序列测定,所获序列与各亚型国际参考株序列比对,确定基因型并进行系统进化树分析.结果 对154份HIV-1感染者的样品进行扩增,得到了148份样品的HIV-1基因片段.发现6种HIV-1亚型和重组型,以及2例未定型.其中B'亚型61例(41.2%)、CRF01_AE 59例(39.9%)、CRF07_BC 16例(10.8%)、CRF08_BC 6例(4.1%)、C亚和B01亚型各2例(1.4%).在河北省首次发现了B01亚型.结论 2009年河北省存在多种HIV-1亚型和流行重组型,主要是B'亚型和CRF01_AE重组型,应加强对HIV-1毒株亚型变异的监测,及时调整防治策略.     

Rapid identification of human immunodeficiency virus type 1 CRF01_AE and BC recombinants by subtype-specific PCR

A subtype-specific PCR approach is described for the identification of HIV-1 intersubtype CRF01_AE and BC recombinants, the two predominant subtypes in Southern China. Primers were designed based on the env and gag regions of the HIV-1 genome. Nested PCRs with primers targeting the env region were performed to amplify subtype C, CRF01_AE, or BC recombinants. To differentiate BC recombinants from subtype C virus, a BC recombinant specific gag PCR was then performed. In order to identify the CRF07_BC and CRF08_BC recombinant forms, an additional PCR step was included. Four HIV-1 samples of known subtype, 77 samples with unknown-subtype, and 30 HIV-negative control samples were tested by the new assay. The results of this PCR-based subtyping approach were compared with that of a sequence-based phylogenetic analysis. In total, 73 (94.8%) samples were amplified by the subtype-specific PCR reactions, of which 39 were identified as CRF01_AE, 14 as CRF07_BC, and 20 as CRF08_BC. The sensitivity of this assay was 90.7% for the CRF01_AE recombinant and 100% for BC recombinants. The specificity was 100% when used to identify 30 HIV-negative samples. The reproducibility was 93.8% for CRF01_AE, and 100% for BC recombinants. This subtype-specific PCR technique represents a simple, rapid, and low-cost assay for the identification of HIV-1 CRF01_AE and BC recombinants in Southern China.     

Differentiation of subtypes B and E of human immunodeficiency virus type 1 by polymerase chain reaction using novel env gene primers

Novel sets of env gene PCR primers for distinguishing human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) subtypes B and E were designed. These primers anneal to different regions of the env gene and amplify DNA fragments of distinct sizes in a subtype-specific manner. Blood samples from 11 HIV-1 carriers in Thailand and 46 carriers in Japan were examined by PCR. The new env primers detected HIV-1 proviral DNA in 100% (11/11) and 88% (37/42) of the subtype B and E infection cases, respectively. The env primers also detected proviral DNA in saliva and breast milk samples in seven of 11 cases and two of three cases, respectively. The PCR subtyping results matched completely with those obtained by nucleotide sequencing of the env V3 region. The results suggest that the PCR using the env primers designed in this study may be an accurate and cost-effective method for differentiating subtypes B and E of HIV-1 in a large number of clinical samples. However, subtype E specific primer cross-react with subtype A, C, G, the new primer in this study is useful for regions in South East Asia where subtype E is predominant.     

北京市性传播HIV-1感染者流行毒株gag基因序列测定和亚型分析

目的 了解北京市性传播HIV-1感染者流行毒株亚型特点和流行规律.方法 随机采集北京市2008年新确证性传播HIV感染者的抗凝全血标本100份,分离血浆,提取病毒RNA,用套式聚合酶链反应扩增病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 系统进化分析确定北京市性传播HIV-1感染者流行毒株存在8个亚型或流行重组型,分别为B亚型22份,B'亚型8份,C亚型1份,CRF01_AE 38份,CRF02_AG 2份,CRF07 BC 9份,CRF08_BC 3份,疑似C/CRF01_AE重组型1份.结论 CRF01_AE和B亚型分别占45.2%和26.2%,为性传播感染者主要的亚型,应该加强我市HIV-1亚型流行情况的监测.

Abstract：

Objective To investigate the subtype distribution and sequence characteristics of HIV-1 strains prevalent among sexual infectors in Beijing. Methods We collected the blood samples from 100HIV sexual infectors in Beijing during 2008 and separated plasma specimens. RNA was extracted from the plasma and the gag gene was amplified by RT-PCR and nest-PCR. The PCR products were sequenced directly and phylogenetic analyses of gag gene was performed using the MEGA4 software. Results Among 100 HIV-1 plasma samples,84 gag gene fragments were amplified and analyzed. Eight HIV subtypes including B(22 strains), B'(8 strains),C( 1 strain) ,CRF01_AE (38 strains) ,CRF02_AG (2 strains) ,CRF07_BC(9 strains) ,CRF08_BC(3 strains) and C/CRF01_AE recombinant like strain( 1 strain) were identified circulating in Beijing. Conclusion CRF01 _AE and subtype B were predominant in Beijing account for 45.2% and 26.2% and the surveillance of HIV gene variation should be paid more attention.