Syncytin蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的克隆人syncytin基因并在大肠杆菌中表达,并用表达后的融合蛋白制备syncytin蛋白多克隆抗体。方法 PCR扩增人syncytin基因编码区的DNA片段,将其克隆入原核表达质粒pET30a(+),转化大肠杆菌BL21,诱导产生syncytin-His融合蛋白。采用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA、Western-Blot和免疫组织化学等方法来检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功表达并纯化了syncytin-His融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白主要以包涵体形式存在;ELISA法测定抗体效价为1:10 000;Western-Blot和免疫组织化学结果显示所制备的抗体能特异性识别syncytin蛋白。结论成功制备和鉴定了人syncytin多克隆抗体,多克隆抗体特异性强和效价高,为下一步研究Syncytin的生物学功能奠定了基础。     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

人NYD-SP28基因原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建人NYD-SP28基因原核表达载体,表达其原核蛋白,制备其多克隆抗体,以探讨其在精子发生中的作用。方法:以原始质粒为模板,用PCR法扩增人的NYD-SP28基因开放阅读框全长,将其克隆到原核表达质粒pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-NYD-SP28。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导原核蛋白的表达,纯化蛋白以免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法测定抗体的滴度。结果:成功构建了用于原核蛋白表达的重组质粒,并在BL21菌中表达NYD-SP28原核蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到NYD-SP28原核蛋白。用纯化的NYD-SP28蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度达到1/10万。结论:成功构建人NYD-SP28原核表达载体,并获得了高纯度的NYD-SP28蛋白及鼠抗NYD-SP28多克隆抗体,为进一步研究NYD-SP28的功能奠定了基础。     

QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b( )原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,应用纯化的融合蛋白,分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并以Western blot进行检测。结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上,应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度,特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白,并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

猪新基因BCL-G_L的克隆与原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆猪的BCL-GL基因,进行原核表达,并制备出其多克隆抗体。方法:以提交NCBI的人的BCL-GL基因序列为种子序列,对猪的ESTs数据库进行比对拼接,得到contig序列。根据这个序列设计克隆引物,以猪脾脏总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR得到克隆序列。克隆序列经测序验证后,连接到原核表达载体pET-32a,构建成重组表达载体pET32a-BCL-GL,然后将重组载体转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达。经His-标签融合蛋白纯化试剂盒纯化得到纯化蛋白制备豚鼠多克隆抗体。结果:抗体ELISA效价为1∶800,Western blot反应特异性良好。结论:成功地克隆了猪BCL-GL基因,并进行了原核表达,制备了特异性豚鼠抗BCL-G血清,为进一步研究其功能奠定基础。     

Rig-I蛋白C端Helicase结构域的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的:为Rig-I蛋白结构与模式识别功能的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测试剂。方法:PCR法克隆小鼠Rig-I基因Helicase区编码序列(726～2240bp,编码241～746位氨基酸),构建带组氨酸标签的原核表达载体pET15b-mRig-I-H,阳性克隆经酶切、测序鉴定后转化E.coliBL21进行诱导表达。目的蛋白电泳分离并割胶纯化后免疫家兔制备抗血清。抗血清用ELISA、Western blot、细胞免疫荧光方法进行鉴定。结果:目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,制备的抗Rig-I抗体效价达到1∶100000,Western blot、细胞免疫荧光结果显示该抗体能够有效地对细胞内Rig-I蛋白的表达水平进行检测。结论:成功地对mRig-I-H进行了原核表达、纯化,抗mRig-I-H的多克隆抗体具有较高的特异性,为进一步研究Rig-I尤其是Helicase区的结构与功能奠定了坚实的基础。     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

人Fkbp19的多克隆抗体的制备

目的:制备针对人Fkbp19的多克隆抗体,为进一步研究Fkbp19基因的功能奠定基础。方法:利用鉴定正确的重组原核表达载体pET21a-Fkbp19,在大肠杆菌BL21-DE3中诱导表达,应用Ni-NTA亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot及免疫荧光的方法检测抗体对乳腺癌细胞中内源性Fkbp19蛋白的识别能力。结果:成功地在大肠杆菌中实现了His-Fkbp19融合蛋白的表达,经纯化后免疫家兔得到了高滴度的多克隆抗体,该抗体可以用Western blot的方法检测内源性Fkbp19蛋白。结论:所制备的多克隆抗体可以用于Fkbp19的Western blot检测。     

人高迁移率族B1的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的以原核表达的人高迁移率族B1(High mobihty group box 1,HMGB1)蛋白为免疫原免疫日本大耳白兔,制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法将人HMGB1 cDNA克隆于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导HMGB1表达,Ni^2 -NTA层析纯化后,用其免疫兔。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。结果成功表达并纯化了人HMGB1蛋白,纯化后纯度可达96％;ELISA法测定抗体效价为1：25600;Western blot结果显示所制备的抗体可特异性与人HMGB1蛋白结合。结论成功制备了兔抗人HMGB1多克隆抗体,为进一步研究HMGB1与相关疾病的关系打下了基础。     

昆虫抗冻蛋白DAFP的原核表达、纯化和抗血清制备

目的:制备昆虫抗冻蛋白DAFP特异性的鼠抗血清。方法:根据GenBank已发表的Dendroides canadensis抗冻蛋白基因序列(gi:2737939),人工合成加拿大拟步甲虫(Dendroides canadensis)的抗冻蛋白基因(dafp),并克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和pMAL-p2x中,在大肠杆菌中进行表达。表达的融合蛋白经Glutathione Sepharose4B纯化后,免疫小鼠制备抗DAFP的抗血清,抗体的效价及特异性分别采用ELISA和Western blot进行检测。结果:SDS-PAGE检测表明,人工合成的dafp基因在大肠杆菌中可表达相对分子质量(Mr)为38000的可溶性融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠所制备的抗体,其ELISA滴度为1∶5000,Western blot证实BL21/pGEX-4T-1-dafp菌和TB1/pMAL-p2x-dafp菌的表达产物可特异性地与该抗体结合。结论:在大肠杆菌中成功地表达了DAFP的融合蛋白并制备出抗融合蛋白的鼠抗血清,为进一步研究DAFP的特性奠定了基础。     

小鼠BTLA胞外功能区基因克隆表达及其对DC表面B7分子表达的影响

目的:研究重组谷胱甘肽S-转移酶(GST)-小鼠B/T细胞弱化因子包外功能区(mBTLAext)融合蛋白(GST-mBT-LAext)对小鼠树突状细胞系DC2.4表面B7分子表达的影响。方法:采用RT-PCR技术从小鼠脾细胞总RNA中逆转录mB-TLAcDNA。将其胞外功能区基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组表达质粒pGEX-4T-2/mBTLAext并转化E.coliBL21(DE3),以1mmol/L的IPTG诱导表达。提取包涵体,经变性、负性后,采用GlutathioneSepharose4B柱纯化可溶性的GST-mBTLAext。将不同浓度的GST-mBTLAext加入到DC2.4的培养体系中,采用流式细胞术检测其对DC上B7-1和B7-2表达的影响。结果:成功地克隆了mBTLA基因,并构建了重组原核表达载体。变性、复性,经GlutathioneSepharose4B柱纯化,获得了可溶性的GST-mBTLAext融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定表明,融合蛋白的相对分子质量(Mr)为43000,同预期的结果一致。流式细胞术检测显示,GST-mBTLAext可上调DC2.4上B7-1的表达并呈剂量依赖性,这一作用可被抗GST-mBTLAext血清阻断。未检测到GST-mBT-LAextDC2.4上B7-2的表达有影响。结论:BTLA对DC2.4表面B7分子表达的上调可能是BTLA-HVEM途径反向信号对DC作用的结果,对进一步研究其对DC生物学行为的影响及其分子机制具有重要的理论意义。     

人金属硫蛋白MT-2a的原核表达、纯化及其抗血清的制备

目的:在大肠杆菌中表达人金属硫蛋白(MT)-2a与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,并制备兔抗MT-2a抗血清。方法:人MT表达菌株BL21/GST-MT-2a经IPTG诱导、超声裂解及GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化后,以可溶性融合蛋白GST-MT-2a免疫新西兰大白兔,制备抗血清。用双向凝胶免疫扩散和ELISA检测抗血清的效价,用Westernblot检测抗血清的特异性。结果:经诱导表达及亲和层析纯化,每L菌液可获得可溶性融合蛋白GST-MT-2a38mg。以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备的抗血清,双向免疫扩散效价>1∶256,ELISA效价>1×10-7。Westernblot检测证明抗血清的特异性良好。结论:人MT-2a在大肠杆菌中得到高效表达,以纯化的GST-MT-2a可溶性融合蛋白免疫家兔得到高效价、高特异性的抗血清,为进一步研究MT-2a蛋白的生物学功能提供了重要的制剂。     

人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

目的制备抗人OX40单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治疗和药物筛选奠定基础。方法 PCR扩增人OX40胞外区的基因序列,将其构建到原核表达载体pET-32a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达OX40胞外区蛋白,经Ni柱纯化后获得目的蛋白。以纯化的OX40胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠,采用常规方法进行细胞融合,通过ELISA和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过ELISA、Western blot和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。结果成功构建人OX40原核表达质粒pET-32a(+)-OX40,并在BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定、Ni柱纯化、透析后获得OX40胞外区蛋白;以此纯化蛋白为免疫原,成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。结论克隆表达并纯化了人OX40蛋白,成功制备针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体,为进一步研究OX40/OX40L的生物学功能奠定了实验基础。     

草原兔尾鼠GST-LZP3融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 :在原核中表达并纯化草原兔尾鼠卵透明带 3 (zonapellu cida3 ,ZP3 ) ,并以其作为抗原 ,制备抗ZP3的抗血清。方法 :将LZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX 4T 1中。经酶切和序列分析后 ,用重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,并经丙基β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST LZP3融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备抗血清。抗血清的效价及特异性采用ELISA和Westernblot检测。结果 :成功地构建GST LZP3融合蛋白表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST LZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫兔子获得抗GST LZP3融合蛋白的高效价抗血清。结论 :获得原核表达的GST LZP3融合蛋白并制备了兔抗LZP3的抗血清 ,为采用免疫不育技术进行草原兔尾鼠生育控制的研究提供了重要的制剂     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.     

F10蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：表达F10蛋白，并制备兔抗F10多克隆抗体。方法：利用PCR方法扩增F10基因片段，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后连接人pET-GST原核表达载体，构建的pET-GST／F10融合重组表达质粒转化大肠杆菌B121，经IPTG诱导表达蛋白，并以亲和层析的方法进行纯化。表达产物用SDS—PAGE电泳和Western blot进行分析鉴定。以纯化的F10蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔抗F10的多克隆抗体，并以ELISA法检测抗体效价。结果：经酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的F10读码框。SDS—PAGE电泳分析显示pET—GST／F10诱导后表达一相对分子质量（Mr）约为61000的融合蛋白，与预期结果相符。目的蛋白纯化后的纯度达90％以上，Western blot证实该蛋白是GST／F10的融合蛋白。将纯化的GST／F10融合蛋白免疫家兔，得到的兔抗F10抗体效价达1：20000。结论：成功构建了人F10基因原核表达载体，并获得了高纯度的F10重组蛋白及兔抗F10抗体，为下一步研究F10基因功能奠定了实验基础。     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备

目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a( )的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a( )hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a( )中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a( )hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。