Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达鼠IL-4受体拮抗体蛋白的研究

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达鼠IL-4受体拮抗体 (mIL-4RA)蛋白.方法 PCR方法扩增小鼠IL-4 C118截断型基因,定向克隆入转移质粒pFastBacHTB中,转化感受态DH10Bac细胞,在DH10Bac细胞内重组pFastBacHTB与杆粒发生转座.筛选阳性克隆,提取重组杆粒,转染sf9昆虫细胞株,获取完整重组杆状病毒.反复感染sf9细胞,扩增病毒同时表达目的 蛋白;用ELISA方法进行蛋白鉴定并初步定量.结果 经核苷酸序列测定及PCR方法,鉴定成功获得含mIL-4RA基因的重组杆粒;通过杆粒转染后sf9细胞所表现出来的细胞病变,推断成功转染并获得重组杆状病毒;最后ELISA方法初步定量sf9细胞培养上清中mIL-4RA蛋白表达量为(1.15±0.12) ng/mL.结论 本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达mIL-4RA蛋白,为进一步研究其生物学活性及功能奠定了实验基础,同时亦为其他蛋白质的真核表达提供了方法学的参考.     

hGITRL_(aa52-177)蛋白在杆状病毒系统中的表达

目的 利用杆状病毒系统表达hGITRLaa52-177蛋白.方法 PCR扩增获得hGITRL胞外段(hGITRLaa52-177)基因,克隆入pFastBacHTa转移载体,在E.coli DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,得到重组杆粒,转染Tn细胞表达目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定目的蛋白的表达.结果 重组载体 pFastBacHTa-hGITRLaa52-177以及重组杆粒Bacmid-hGITRLaa52-177构建正确,在Tn细胞内成功表达6×His-hGITRLaa52-177重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blotting显示重组hGITRLaa52-177蛋白相对分子质量约为Mr 18 000.结论 杆状病毒-昆虫表达系统获得 hGITRLaa52-177蛋白,为进一步从蛋白质水平研究hGITR/hGITRL对机体免疫调节的影响奠定了基础.     

轮状病毒NSP4胞质区在杆状病毒系统的表达及其黏膜佐剂效应评价

目的：应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达轮状病毒（RV）非结构蛋白NSP4的胞质区（CF）片段（47～175 aa）,并初步检测其黏膜免疫佐剂效应。方法：将RV NSP4-CF基因片段定向克隆至转座载体pFastBac1,转化DH10Bac并筛选重组杆粒Bac-NSP4-CF。脂质体介导Bac-NSP4-CF转染sf9细胞,收获细胞并传代培养。测定病毒滴度,Western blot检测目的蛋白表达情况。纯化后的重组NSP4-CF与卵清蛋白（OVA）滴鼻共免疫小鼠,并检测其黏膜免疫佐剂效应。结果：在杆状病毒系统中成功获取了NSP4-CF重组蛋白,Western blot检测可见约16 kD的特异性条带;重组NSP4-CF与OVA共免疫小鼠后,小鼠血清OVA特异性IgG、IgA抗体水平与肠道SIgA水平较OVA单独免疫组均有升高（P<0.05）;ELISPOT检测结果表明NSP4-CF佐剂组（5μg）分泌IFN-γ的脾细胞平均数均高于OVA组（P<0.05）。结论：经昆虫细胞表达系统可获得RV NSP4胞质区（47～175 aa）重组蛋白,该蛋白与模式抗原经黏膜途径免疫小...     

肠道病毒71型VP1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达

目的利用昆虫杆状病毒表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化。方法首先通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组质粒pFast Bac1-VP1转入DH10BacTM感受态细胞,通过转座从而获得重组质粒bacmid-VP1,采用脂质体Cellfectin Reagent将重组质粒bacmid-VP1转染Sf9细胞。通过SDS-PAGE、Western blot法检测目的蛋白的水平,经镍离子亲和层析,纯化VP1蛋白。结果 SDS-PAGE及Western blot法检测获得蛋白的相对分子质量与预期结果一致。Bradford分析纯化后蛋白的浓度为70μg/m L,纯化度达90%。结论利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白。     

重组人凝血因子Ⅷ在昆虫表达系统的分泌表达及鉴定

目的克隆人凝血因子Ⅷ（Human Coagulation FactorⅧ,rhFⅧ）基因cDNA,利用bac-to-bac杆状病毒表达系统制备具有高凝血活性rhFⅧ。方法利用PT-PCR和overlap PCR技术扩增人FⅧ基因,亚克隆至转移载体pFastBac HTB,进一步转化至感受态细菌DH10Bac（含穿梭载体Bacmid）中,同源转座、氨苄青霉素及蓝白斑筛选阳性克隆质粒Bacmid/rhFⅧ;PCR法鉴定重组质粒后转染昆虫细胞Sf9;利用病毒感染High five细胞进行蛋白表达,通过SDS-PAGE、Western blot及凝血活性检测方法分析蛋白表达。结果完成了rBac-rhFⅧ重组杆状病毒的制备,实现了rhFⅧ在昆虫细胞中的重组表达,rhFⅧ相对分子质量为184 kDa左右,SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致,同时具有良好的促凝血作用。结论利用杆状病毒-昆虫表达系统成功制备了具有一定促凝血活性的rhFⅧ,为人凝血因子Ⅷ进一步的开发及应用奠定了基础。     

人脂联素基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统探讨人脂联素(ADPN)基因在Sf9昆虫细胞中的高效表达。方法利用PCR方法扩增人脂联素基因,与pFastBac1质粒连接,转化入含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌DH10Bac中,筛选发生转座作用的重组穿梭载体Bacmid-ADPN并转染Sf 9昆虫细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf 9细胞形态变化明显,能够表达出与脂联素多克隆抗体相结合的蛋白,蛋白分子质量约为30 ku。结论人脂联素基因在真核细胞中成功得到表达,为进一步研究其生物学活性和作用机制奠定基础。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达

目的：在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的表达载体pFBDHTa—G2S0．7，并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统，将嵌台基因重组至杆状病毒穿梭质粒hacmid中，并筛选含有G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，在昆虫细胞中表达该融合蛋白。对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测。结果：构建了的含G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞后，可表达相应大小的融合蛋白。该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别。结论：利用杆状病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

抗汉滩病毒双链抗体重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达

目的应用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统构建具有抗汉滩病毒(HTNV)G2糖蛋白(GP)鼠源性mAb 3G1与抗HTNV核蛋白(NP)鼠源性mAb 1A8嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达抗HTNV双链抗体并对表达产物进行初步鉴定。方法构建含有嵌合基因的杆状病毒表达载体ScFv-pFBD-ScFv‘,转化DH10Bac致敏菌,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上,快速筛选出含有抗HTNV双链抗体嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中进行表达,并利用间接免疫荧光试验检测表达产物。结果构建了含抗HTNV双链抗体嵌合基因之重组杆状病毒,并在昆虫细胞中表达出特异性抗体,该抗体能被兔抗人Q抗体所识别并可与HTNV NP和GP特异性结合。结论成功地在昆虫细胞中表达出抗HTNV双链抗体,且该抗体具有与HTNV NP抗原和GP抗原结合的活性。     

SETD4蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统的表达

目的　通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4（SET domain-containing 4）蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。 方法　提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至pFastBac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。 结果　经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 kD处可检测到目的条带。 结论　成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。     

H5N1禽流感病毒headless HA基因在杆状病毒中的表达

目的 建立能有效表达禽流感病毒A/Hubei/1/2010( H5N1)无头HA( headless HA)的杆状病毒系统.方法 利用RT-PCR扩增获得headless HA基因,克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,命名为pFastBac1headless HA.将pFastBac1headless HA转化到DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒Headless HA-Bac.利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,并进行Western Blot和红细胞凝集试验检测.结果 Headless HA在Sf9细胞中能有效表达,不能使红细胞发生凝集.结论 本研究为利用headless HA表达蛋白研制广谱流感疫苗奠定了基础.     

High Expression of Insulin-like Growth Factor H (IGF-Ⅱ) Using Bac-to-Bac Expression System

Objective In order to obtain mature insulin-like growth factor- Ⅱ ( IGF- Ⅱ ), we used Bac-to-Bac baculovirus expression system. Methods Firstly the IGF- Ⅱ cDNA was cloned into a donor plasmid pFastBac1 and the recombinant pFastBac1 was then introduced into competent cells DH 10Bac. Recombinant bacmids were constructed by transposing a mini-Tn7 element from a donor plasmid pFastBac1 to the mini-attTn7 attachment site on the bacmid where the Tn7 transposition functions were provided in trans by a helper plasmid, and then used to transfect Sf9 insect cells to get recombinant baculovirus. The recombinant baculovirus was used to infect insect cells. Results Agarose gel analysis showed that recombinant donor plasmid pFastBac1 was constructed successfully; Agarose gel analysis of PCR products confirmed recombinant bacmid ; SDS-PAGE and Western Blotting showed that a 7KD protein band appeared. Conclusion The mature IGF- Ⅱ with immunogenecity has been expressed and produced by using Bac-to-Bac expression system.     

利用穿梭质粒快速构建含乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg …

目的 应用新型杆状病毒表达系统快速构建含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒，高效表达ＨＢｓＡｇ，为ＨＢＶ诊断试剂、疫苗及治疗研究提供依据。方法 构建含有ＨＢｓＡｇ基因的供体质粒ｐＦＢ－ＢＳ，转化Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达试剂盒中的ＤＨ１０Ｂａｃ致敏菌，利用其含有的细菌Ｔｎ７转座繁忙将ＨＢｓＡｇ基因重组至穿梭质粒Ｂａｃｍｉｄ上，快速筛选出含有ＨＢｓＡｇ基因的重组杆状病毒。结果 此重组病毒能在昆虫细     

山羊IL-18成熟蛋白在昆虫细胞/杆状病毒中的表达及其活性分析

目的:在昆虫细胞/杆状病毒中表达山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白,并对其生物学活性进行分析。方法:将编码山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白的基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual上,构建重组质粒pFastBac Dual-gIL18,将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18,在Cellfectin作用下,将Bacmid-gIL18转染昆虫细胞sf9,收获感染后不同时间段的细胞,进行SDS-PAGE、Western blot检测和生物学活性分析。结果:重组蛋白获得正确表达具有良好的免疫原性;生物学活性分析表明,重组蛋白能够促进淋巴细胞增殖、诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。结论:用昆虫细胞/杆状病毒系统成功表达了gIL-18成熟蛋白,且具有良好的免疫原性和生物学活性,从而为进一步研究gIL-18作为免疫调节剂和免疫佐剂在生产上的应用奠定了基础。     

森林脑炎病毒prM-E蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫活性测定

目的为了表达森林脑炎病毒prME蛋白,为森林脑炎快速诊断试剂的研制奠定基础。方法经过RTPCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,以杆状病毒昆虫细胞表达系统成功地表达了森林脑炎病毒MDJ01株prME蛋白。结果从感染细胞上清中电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,说明重组病毒感染细胞后产生病毒样表达颗粒(viruslikeparticlesVLPs),并且分泌至细胞外。免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的重组蛋白能够与抗森林脑炎病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性。ELISA和间接免疫荧光染色证实,重组prME蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在昆虫细胞中表达的prME具有良好的抗原性,本研究为森林脑炎快速特异诊断试剂研制奠定了基础。     

人Cosmc 胞外段蛋白在昆虫细胞Sf-9 中的表达与纯化研究

目的:利用昆虫细胞Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达人Cosmc 胞外段蛋白,为体外研究Cosmc 蛋白的结构和功能奠定基础,同时也为O-连接糖基化及相关疾病的研究提供思路。方法:采用Bac-to-Bac 系统,构建重组转移质粒pFastBac1-Cosmc extracellular domain(pFastBac1-Cosmc ED),转化到含穿梭载体Bacmid 的感受态细胞DH10Bac 中,通过蓝白斑筛选和PCR 鉴定,获得重组转座子rBacmid-Cosmc ED。在脂质体介导下,重组病毒感染Sf-9 无血清细胞,在Sf-9 中表达Cosmc 胞外段蛋白,由于Cosmc N 端加有昆虫细胞信号肽HBM(Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段,所以Cosmc 胞外段蛋白表达后分泌到培养基上清中,通过SDS-PAGE 和Western blot 对表达产物进行检测,并通过Ni-NTA 亲和层析柱对其进行纯化分析。结果:SDS-PAGE 和Western blot 分析显示得到一条分子量约为33 kD 的特异性条带,与目的蛋白大小相符,质谱结果进一步证明所得蛋白为Cosmc 胞外段蛋白。结论:Sf-9 细胞中可成功表达Cosmc 胞外段蛋白,为进一步研究Cosmc 的结构和功能奠定基础。     

杆状病毒为载体的重组汉坦病毒S基因在Vero—E6细胞中的表达及其生物活性

目的 将汉坦病毒HV Z10株S基因（HV5）插入已含CMV基因的杆状病毒转移载体pDual-CMV,筛选重组杆状病毒BAC-pDual-CMV-HVS,转化Vero-E6细胞,用于血清汉坦病毒抗体的检测。方法 以pEGFP-N1质粒为模板,通过PCR扩增CMV基因序列,酶切插入杆状病毒转移载体pFastTBacDUAL,构建含CMV的转移载体pDual-CMV。酶切含HV S基因的pMD19-Z10S质粒,插入pDual-CMV,构建pDual-CMV-HVS,转化感受态DH10BAC,筛选并取重组杆状病毒基因,转染TN细胞,筛选重组杆状病毒BAC-pDual-CMV-HVS。BAC-pDual-CMV-HVS转化Vero-E6细胞,制备抗原片,用于血清中抗汉坦病毒抗体的检测并与传统方法进行比较。结果 经测序成功构建重组杆状病毒转移载体pDual-CMV-HVS,按杆状病毒表达系统操作方法,成功筛选BAC-pDual-CMV-HVS,转化VeroE6细胞,经汉坦病毒抗体阳性血清检测,HV S基因在细胞中得到表达,与传统方法一致。结论 成功筛选BAC-pDual-CMV-HVS重组杆状病毒,可用于汉坦病毒抗原片的制备,该抗原片制备方法简便、无需特殊设备,可用汉坦病毒抗体的检测。     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域（gAd）基因。方法以人基因组为模板,PCR法扩增人gad基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac。筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid—gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果显示,BacmidgAd组和对照组相比．在相对分子质量15000～25000之间多出一清晰的蛋白条带．免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合。结论人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础。