蚯蚓纤溶酶对犬纤溶酶活性和血小板聚集功能的影响

目的研究口服蚯蚓纤溶酶（ＥＦＥ）对纤溶系统和血小板聚集功能的影响。方法正常雄性Ｂｅａｇｌｅ犬，体重６．５～９ｋｇ，经口给蚯蚓纤溶酶，经前肢静脉取血。以Ｓ－２２５１为发色底物，测定血浆纤溶酶活性；５０μｍｏｌ／ＬＡＤＰ为诱导剂测定血小板聚集率。结果（１）单剂量ＥＦＥ４０、８０ｍｇ／ｋｇ后血浆纤溶酶活性升高（Ｐ＜０．０５），８０ｍｇ／ｋｇ组高于４０ｍｇ／ｋｇ组（Ｐ＜０．０５）。连续给药１０ｄ，４０、８０ｍｇ／ｋｇ组均有多个时间点纤溶酶活性升高（Ｐ＜０．０５），但两组间无差异。（２）单剂量ＥＦＥ４０ｍｇ／ｋｇ，或经口给阿司匹林８ｍｇ／ｋｇ后３ｈ，血小板聚集均被抑制（Ｐ＜０．０５）；而在单剂量ＥＦＥ８０ｍｇ／ｋｇ或经口给淀粉后３ｈ，血小板聚集功能均无变化。结论ＥＦＥ经口给药可提高血浆纤溶酶活性，并在一定剂量下可抑制血小板的聚集。     

蚯蚓纤溶酶夺犬纤溶酶活性和血小板聚集功能的影响

研究口服蚯蚓纤溶酶对纤溶系统的和血小板聚集功能的影响。方法 正常雄性Ｂｅａｇｌｅ犬，体重６．５－９ｋｇ，经口给蚯蚓纤溶酶，经前肢静脉取血，以Ｓ－２２５１为发色底物，测定血浆纤溶酶活性；５０μｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ为诱导剂测定血小板聚集率。结果（１）单剂量ＥＦＥ４０，８０ｍｇ／ｋｇ后血浆纤溶酶活性升高，８０ｍｇ／ｋｇ组高于４０ｍｇ／ｋｇ组。连续给药１０ｄ，４０，８０ｍｇ／ｋｇ组均有多个时间点纤溶酶活性各     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其动力学性质研究

目的：建立一种高效的蚯吲纤溶酶（ＥＦＥ）的分离纯化技术,并研究其特性。方法：蚯蚓经组织匀浆、缓冲液抽提与选择性热变性,再经抑制剂１,６－己二胺（ＨＤ）偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析。结果及结论：分离纯化得到具有强烈纤溶活性的酶组分（ＥＦＥ－Ｆ１、２,ＥＦＥ－Ｆ３）。其中ＥＦＥ－Ｆ３对合成底物Ｓ－２２８８和Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ Ｐ的Ｋｍ分别是０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ和０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ,ＨＤ的Ｋｉ为１ｍｍｏｌ／Ｌ;该酶热稳定性强,能抗４ｍｏｌ／Ｌ脲。     

高活力蚯蚓纤溶酶的纯化及性质研究

由电泳得知赤子爱胜蚓ＥｉｓｅｎｉａＦｏｅｌｉｄｅ有６种纤溶酶同工酶。经纯化从中得到一种具强纤溶活性的单组分酶。收率为粗酶粉总活力的１９．１％。该酶分子量为３００００Ｄ,比活为６６６７Ｕ／ｍｇ,在ｐＨ４～１１及２５℃～５５℃温度范围内稳定。     

DEC1基因表达对人食管癌ECA109细胞增殖及侵袭能力的影响

目的分析DEC1基因表达水平在对人食管癌ECA109细胞增殖和侵袭能力的影响,并探讨其可能机制。方法取人食管癌ECA109细胞,分别将质粒pc DNA3.1(-)/DEC1(研究组)和pc DNA3.1(-)(对照组)转染至该细胞并获得重组细胞。Western blot技术对细胞周期蛋白cyclin D1、基质金属蛋白酶9(MMP9)以及DEC1蛋白表达进行检测;采用Transwell实验、平板集落实验以及CCK-8实验对细胞增殖和侵袭能力进行检测。结果研究组细胞DEC1蛋白表达水平高于对照组(P<0.05),而cyclin D1、MMP9表达低于对照组(P<0.05)。研究组细胞增殖和侵袭能力低于对照组(P<0.05)。结论 DEC1表达水平可对人食管癌ECA109细胞增殖和侵袭能力造成一定影响;抑制cyclin D1和MMP9表达可能为其作用机制。     

蚯蚓纤溶酶对家兔溶栓、纤溶和抗凝作用的影响

本实验表明蚯蚓纤溶酶(QM_(85))不仅具有体外溶解血栓的作用,而且口服300万mm~2/kg或静注10万mm~2/kg可加速急性肺动脉栓塞的溶栓效应,与生理盐水组比较有显著性差异。QM_(85)还能使兔血浆纤维蛋白原含量下降,“3P”试验阳性,凝血时间,复钙时间和凝血酶原时间延长。     

抗阿霉素人食管癌Eca-109细胞生物学特性研究

目的： 建立并研究抗阿霉素人食管癌细胞株（Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ） 的生物学特性。方法： 采用递加培养液中药物浓度建立Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞株,测试该细胞株对多种抗肿瘤药物的敏感性,采用光镜及扫描电镜观察其形态变化,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ） 分析法检测ｍｄｒ １ 表达,采用荧光分光光度法检测细胞内ＧＳＨ 水平。结果： 建立了低程度的抗阿霉素Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞株,该细胞株细胞大小不均匀,边界不如Ｅｃａ １０９ 细胞整齐,有明显皱褶,未见微毛,集落形成率明显下降,对长春新碱、放线菌素Ｄ、三尖杉酯碱、丝裂霉素Ｃ、鬼臼乙叉甙及顺铂呈不同抗性,对氟尿嘧啶仍敏感,ｍｄｒ １ 基因呈低表达,细胞内ＧＳＨ 水平升高,结论：Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞为多药抗药性细胞株。     

RNAI沉默Grp94基因对人食管癌ECA109细胞迁移及侵袭能力的影响

目的 探讨RNAI沉默Grp94基因表达对人食管癌ECA109细胞迁移及侵袭能力的影响和可能机制.方法 设计、合成靶向Grp94基因的siRNA基因片段,应用脂质体包埋转染食管癌ECA109细胞,采用Real-time PCR和Western blot法分别检测转染后的细胞内Grp94、基质金属蛋白酶MMP2及MMP9的表达,采用Transwell实验检测沉默Grp94基因对细胞迁移及侵袭能力的影响.结果 SiGrp94组中Grp94mRNA和蛋白水平显著下调(P＜0.01),MMP2、MMP9表达明显下调(P＜0.05);SiGrp94组细胞迁移及侵袭能力明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 沉默Grp94基因可明显抑制ECA109细胞的迁移及侵袭能力,Grp94可能通过影响MMP2、MMP9参与其中.     

靶向沉默人基因MDC1 表达对食管癌细胞放射增敏作用的实验研究

目的 利用RNA干扰技术抑制食管癌细胞ECA109细胞MDC1基因表达,观察其对细胞周期和放射敏感性的影响.方法 构建MDC1基因的干扰质粒pMDC1-shRNA,与慢病毒包装质粒混合物共同转染293T细胞,收集病毒液,感染ECA109细胞,采用Real-Time PCR和western blotting测定MDC1在mRNA水平和蛋白水平的表达.采用流式细胞术和克隆形成实验,检测RNA干扰对ECA109细胞放射敏感性的影响.结果 成功构建pMDC1-shRNA质粒,转染ECA109细胞.获得稳定转染细胞株ECA109/MDC1,基因MDC1在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显降低;5 Gy射线照射后12 h、24 h、48 h,ECA109/MDC1的G2M期比例明显低于阴性对照组和空白对照组;ECA109、ECA109/NEGATIVE、ECA109/MDC1细胞的D0值分别为3.06 Gy、2.90 Gy、1.88 Gy;SF2值分别为0.91、0.89、0.84;Dq值分别为1159、1.47、1.20,显示ECA109/MDC1的D0值、SF2值、Dq值均明显降低.结论 RNAi技术可以有效地抑制食管癌细胞ECA109中基因MDC1的表达,从而增强ECA109细胞对放射线的敏感性.     

白藜芦醇对人下咽鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的放射增敏作用

目的研究白藜芦醇对人下咽鳞状细胞癌（FADU）裸鼠移植瘤的放射增敏作用。方法放射增敏实验方案：43只移植瘤裸
鼠随机分为4组：对照组、单纯放射治疗组、单纯药物（白藜芦醇）治疗组及增敏（放射+白藜芦醇药物治疗）组,绘制生长曲线,计
算抑瘤率。对瘤体行CD31免疫荧光组化染色并进行微血管计数。结果增敏组肿瘤体积最小,瘤质量最轻,与其他3组比较差
异具有统计学意义（P<0.05）,抑瘤率达76.64%。增敏组MVD显著降低,与对照组、单纯药物组和放疗组比较差异具有统计学
意义（P<0.05）。结论白藜芦醇对FADU鳞状细胞癌裸鼠移植瘤通过抑制放疗后微血管形成实现放射增敏效果。
     

人食管癌Eca-109细胞膜肿瘤抗原的筛选

目的:从人食管癌Eca109细胞入手,筛选出食管癌高效细胞膜肿瘤抗原的大致范围。方法:采用敏感的序列特异性引物聚合酶链反应(PCRSSP)来确定Eca109细胞人主要组织相容性复合体(HLA)基因分型,用HLA血清学分型技术筛选健康志愿者;改良的Neville法结合超滤法纯化膜蛋白并分组:<3000、3000～10000、<10000、10000～30000、30000～100000、>100000、总膜蛋白共7个组,各组抗原负载树突状细胞(DC),以DC激活的T淋巴细胞为效应细胞,Eca109细胞为靶细胞,设效靶比为81、161、321,用MTT法检测效应细胞杀伤率。结果:Eca109细胞HLA的基因分型为A03,A24;B35,B37;DRB101,DRB112;DR52;DRB3;筛选到1例表型为A03杂合子的健康志愿者。根据MTT检测,在效靶比为81、161和321时,膜蛋白相对分子质量小于10000组的肿瘤细胞杀伤率与未使用去垢剂的总膜蛋白组相比差异无统计学意义(P>0.05),而相对分子质量小于3000组的杀伤率最高,与各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Eca109细胞膜蛋白中存在能引起特异性的抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞免疫反应的肿瘤抗原,相对分子质量小于3000的膜蛋白成分中可能存在人食管癌的高效肿瘤抗原。     

人食管癌Eca-109细胞膜蛋白的分离和纯化

目的:建立人食管癌Eca109细胞系膜蛋白分离和初步纯化方法。方法:使用改良的Neville法提取细胞膜,在pH6.3的条件下,用去垢剂TritonX100和辛基β葡糖苷把细胞膜上的蛋白溶解下来,以超滤法纯化膜蛋白并分组。结果:在pH6.3的条件下,适当的去垢剂与膜蛋白质量之比使用去垢剂辛基β葡糖苷时为61;使用TritonX100时为21。超滤法将膜蛋白分为相对分子质量<3000、3000～10000、<10000、10000～30000、30000～100000、>100000共6个组分。结论:获得适当的去垢剂与膜蛋白质量比,并获得了不同的膜蛋白组分,为进一步研究人食管癌Eca109细胞肿瘤抗原奠定了基础。     

LIGHT-Fc基因转染对食管癌细胞株Eca109抑制作用的初步研究

目的探讨LIGHT对人食管癌细胞的体外抑制效应.方法以DOTAP脂质体介导LIGHT-Fc基因转染人食管癌细胞株Eca109,通过绘制细胞生长曲线及MTF比色法观察LIGHT-Fc转染对Eca109细胞生长的影响,用RT-PCR法检测LIGHT受体在Eca109细胞上的表达.结果LIGHT-Fc基因的表达可以抑制Eca109细胞的生长.在低血清培养时,Eca109/LIGHT细胞的生长曲线较对照组明显降低;MTT比色显示Eca109/LIGHT的细胞活力与对照组相比有显著性差异(P＜0.05).结论LIGHT-Fc基因转染对人食管癌Eca109细胞具有体外抑制作用,但全面评价有待进一步的研究.     

27-羟基胆固醇与胆固醇对裸鼠食管鳞癌和人食管癌细胞增殖的影响

目的 旨在探讨胆固醇和27-羟基胆固醇对食管鳞癌增殖、侵袭和迁移能力的生物学行为及对细胞因子MCP-1分泌的影响。 方法 动物体内实验:通过建立裸鼠食管鳞癌动物模型,给予高胆固醇饮食(高胆固醇饮食组,n=4)和正常饮食(对照组,n=4),观察胆固醇在体内对食管鳞癌肿瘤生长的影响,第5周实验终止时,对两组瘤体体积进行测量并计算抑瘤率。细胞实验:观察胆固醇(浓度分别为0、0.123、0.148、0.185、0.269、0.370 mg/mL)和27-羟基胆固醇(浓度分别为0、1、5、10、20 μmol/mL)对正常食管鳞癌细胞(ECA109)和基因cyp27a1、cyp7b1敲除后的ECA109细胞增殖能力的影响,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同药物浓度干预下细胞的增殖活性。采用划痕实验和侵袭实验(胆固醇0.185 mg/mL,27-羟基胆固醇1 μmol/mL)检测肿瘤细胞的侵袭效应。利用慢病毒转染敲除27-羟基胆固醇的上游基因cyp27a1和下游基因cyp7b1,重复上述实验,探讨27-羟基胆固醇合成或代谢基因敲除对ECA109细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响,并通过ELISA实验检测基因敲除后对肿瘤细胞单核细胞趋化因子-1(MCP-1)分泌的影响。两组不同时间瘤体体积和CCK-8吸光度值采用两因素方差分析,交互作用有统计学意义时进一步行简单效应分析。多组间数据均值差异比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用LSD法。 结果 动物实验结果表明:裸鼠异种移植肿瘤体积在高胆固醇饮食组与对照组分别为(5.055±0.774)cm³和(1.866±0.618)cm³,抑瘤率为-170.79%,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞实验结果表明:(1)胆固醇可以促进ECA109细胞和上游基因cyp27a1敲除后的ECA109细胞增殖,胆固醇低浓度下促进上游基因cyp27a1敲除后的ECA109细胞增殖(P均<0.05);27-羟基胆固醇可以抑制ECA109细胞增殖,但促进下游基因cyp7b1敲除后的ECA109细胞增殖(P均<0.05);(2)胆固醇和27-羟基胆固醇对于ECA109细胞迁移能力无影响(F=2.418,P=0.170),27-羟基胆固醇的上游基因cyp27a1和下游基因cyp7b1敲除对ECA109细胞迁移能力无影响(F=0.602,P=0.578);(3)基因敲除后细胞与对照组相比,细胞侵袭能力发生改变(F=3.992,P=0.047),其中下游基因cyp7b1敲除后,侵袭能力受到抑制(P<0.05);上游基因cyp27a1敲除对ECA109细胞侵袭能力无影响(P>0.05);(4)与正常ECA109细胞相比(151.883±2.948),基因敲除可以使肿瘤细胞MCP-1因子的分泌发生改变(F=553.538,P<0.001)。上游基因cyp27a1敲除后,细胞的MCP-1因子分泌增多(213.823±4.572),下游基因cyp7b1敲除后,细胞的MCP-1因子分泌减少(107.240±4.121)(P均<0.001)。 结论 胆固醇在体内外均可刺激ECA109细胞的增殖;27-羟基胆固醇抑制ECA109细胞增殖,胆固醇促进ECA109细胞的增殖,并且具有浓度依赖性;上游基因cyp27a1敲除可以增强胆固醇在低浓度下对细胞增殖能力的影响,但对细胞侵袭能力无影响;下游基因cyp7b1敲除可以改变27-羟基胆固醇对细胞增殖活性的影响,并抑制细胞的侵袭能力;27-羟基胆固醇上游基因cyp27a1敲除可促进细胞MCP-1因子的分泌,下游基因cyp7b1敲除抑制MCP-1因子的分泌。     

硒酸酯多糖对人食管鳞癌Eca109细胞增殖及凋亡的影响

目的研究硒酸酯多糖(KSC)对人食管鳞癌Eca109细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同浓度KSC对Eca109细胞增殖的影响;流式细胞术观察KSC对Eca109细胞凋亡的影响;Westernblot技术检测KSC对Eca109细胞核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达水平的影响。结果 KSC可明显抑制Eca109的增殖(P<0.05),并呈时间及浓度依赖性;经KSC作用后,Eca109细胞的凋亡率随KSC作用时间的延长(24、48、72h)及KSC浓度的增加(30、60、120μg/mL)而明显升高(P<0.01);KSC(60、120μg/mL)显著下调Eca109细胞核中NF-κB蛋白水平(P<0.01)。结论 KSC对Eca109细胞具有抑制增殖、诱导凋亡作用,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

吉非替尼对鼻咽癌细胞株CNE2放疗增敏作用

目的应用吉非替尼作用于鼻咽癌细胞株CNE2,观察其放疗增敏作用。方法体外培养鼻咽癌细胞株CNE2,以MTT实验检测细胞增殖抑制情况及吉非替尼对细胞放射敏感性的影响;用克隆形成法绘制细胞存活曲线,获得不同处理条件下的放射增敏比。以流式细胞术(FCM)分析细胞周期变化和凋亡情况。结果 MTT显示与单纯照射组比较,联合吉非替尼照射组细胞生存率显著降低(0.582±0.012vs0.398±0.016,P=0.0020);FCM显示吉非替尼联合放射组S期细胞显著下降(P=0.000),而G2/M期细胞比值显著增加(P=0.000),吉非替尼和放射线可协同作用,使CNE2细胞的周期再分布显著变化。结论吉非替尼可增强鼻咽癌细胞株CNE2放射敏感性,其机制可能与改变细胞周期的分布相关。     

Effects of Oxymatrine on the Apoptosis of Human Esophageal Carcinoma Eca109 Cell Line and Its Mechanism

The effects of Oxymatrine （Oxy） on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma Ecal09 cell line and the mechanism were investigated. The human esophageal carcinoma Eca 109 celis were cultured in vitro. The Oxy-induced apoptosis of Eca 109 cells was assayed by using flow cytometry. The expressions of p-ERKII2, Cyclin D1, p21^waf/cipl, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. Flow cytometry revealed that Oxy could induce the apoptosis of Eca l09 cells. Western blot showed that Oxy of different concentrations suppressed the expressions of p-ERK1/2, Cyclin D1 and Bcl-2, but up-regulated the expression of p21waf/cip1 and Bax, and the ratio of Bax/Bcl-2 was increased. It was suggested the Oxy could induce the apoptosis of Eca l09 cells, which might be related to the upregulation of p21waf/cip1 and the downregulation of p-ERK1/2, Cyclin D1 and p21^waf/cip1. The possible pathway may be related to Bcl-2/Bax.     

LIGHT-Fc基因转染上调食管癌细胞ICAM-1的表达

目的探讨LIGHT对人食管癌细胞的体外抑制效应的可能机制.方法以DOTAP脂质体介导LIGHT-Fc基因转染人食管癌细胞株Eca109,通过免疫组织化学及流式细胞仪检测来观察LIGHT-Fc转染对Eca109细胞上ICAM-1表达水平的影响.结果 Eca109细胞表达LIGHT-Fc基因上调了细胞表面ICAM-1的表达水平.结论 LIGHT-Fc基因转染上调人食管癌细胞株上ICAM-1的表达可能是其体外抑瘤效应的一种机制,但全面评价有待进一步的研究.