含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌株的构建与鉴定

目的:构建含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261(减毒鼠伤寒沙门氏菌)疫苗菌.方法:将质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入LB5000(鼠伤寒沙门氏菌)进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,抗生素筛选后挑取单个菌落扩增进行抽提质粒和PCR鉴定,SL3261疫苗菌与HepG2细胞体外共培养,荧光显微镜和RT-PCR分别检测GFP(绿荧光蛋白)的表达和4-1BBL基因的转录.结果:导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261经抽提质粒电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带,质粒PCR获得了约930 bp的条带,200个HepG2细胞感染SL3261为201±46 CFU、SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,含质粒SL3261在体外感染HepG2细胞的能力同原细菌基本相同(P＞0.05).感染含质粒SL3261的HepG2细胞观察到GFP表达,感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞经RT-PCR检测到约930 bp的目的条带.结论:成功构建了能携带大鼠4-1BBL基因真核表达质粒的SL3261疫苗菌.     

重组质粒pcDNA3.1-IL-15转染对小鼠骨髓DC上表面分子的表达及功能的影响

目的: 探讨重组质粒pcDNA3. 1 IL- 15对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表面共刺激分子的表达及免疫功能的影响。方法: 构建真核表达质粒pcDNA3. 1 IL- 15, 以其转染小鼠骨髓DC。用流式细胞仪检测转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达, 并分析转染的DC刺激脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞亚群的变化。用MTT比色法检测转染的DC刺激T细胞增殖的作用。用ELISA法检测T细胞产生IFN- γ的水平。结果: pcDNA3. 1- IL- 15转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达均有不同程度的升高。重组质粒转染的DC可诱导小鼠脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞增殖, 但CD4 /CD8 T细胞的比值降低。结论: 重组质粒pcDNA3. 1 -IL- 15转染可提高DC表面共刺激分子的表达并增强其免疫功能。     

Sel1L 对小鼠骨髓源树突状细胞的影响

目的:研究Sel1L(Suppressor/ enhancer of Lin-12-like)基因对小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)分化及其功能的影响。方法:利用Cre-Loxp 重组系统构建Sel1L 基因敲除小鼠模型,用ELISA 和实时荧光定量法检测BMDCs 分泌细胞因子IL-6、IL-12 的表达;用免疫印迹法(Western bolt)检测BMDCs 细胞中Sel1L蛋白的表达;用流式细胞术检测BMDCs 细胞CFSE、细胞表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及其对特异性CD4⁺ T 细胞抗原提呈能力的影响。结果:Sel1L的缺失抑制BMDC诱导分化过程中的增殖效率,上调DCs 分泌因子的能力和MHC-Ⅰ的表达,减少MHC-Ⅱ的表达,并抑制BMDCs 细胞对OVA323-339 抗原特异性T 细胞的增殖。结论:Sel1L 缺失可以抑制小鼠骨髓源树突状细胞的分化,下调DC 对OVA 特异性的CD4⁺ T细胞的抗原提呈功能。     

雷帕霉素和地塞米松对小鼠树突状细胞分化成熟的调控

目的：观察雷帕霉素（rapamycin，Rap）和地塞米松（dexamethasone，Dex）对堵养的小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）分化发育的影响。方法：（1）用GM-CSF＋IL-4定向诱导C57BL／6小鼠骨髓细胞分化为DC，分别加入Rap或Dex，然后用脂多糖（LPS）刺激。在倒置显微镜和扫描电镜下，动态观察DC形态学E的变化。（2）通过流式细胞术（荧光抗体双标记法）测定CD11c^＋细胞的比例及CD86和MHC-Ⅱ类分子表达的变化。（3）通过单向混合淋巴细胞反应（MLR）观察，Rap和Dex处理的DC刺激BALB／c小鼠同种异基因T细胞增殖的情况。结果：（1）经Rap和Dex处理后，DC在形态学上呈现稳定不成熟状态。（2）Rap处理的细胞表面CDIlc和MHC-Ⅱ类分子的表达仅有轻度降低，而CD86的表达明显降低。Dex处理的细胞表面CDIlc的表达与Dex的剂量呈负相关，CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达均明硅降低。两种药物处理的DC均可抵抗LPS的促成熟作用。（3）MLR的结果显示，Rap和Dex处理的DC刺激同种异基因BALB／c小鼠T细胞增殖的能力均较低。结论：Rap和Dex均可使DC处于稳定的不成熟状态。与Dex相比，Rap对骨髓造血F细胞向DC分化的过程影响较小，而且在抑制DC表面协同刺激分子CD86表达的同时，对MHC-Ⅱ类分子的表达影响较小。     

TLR2激动剂Pam3CK逆转IL-10转染小鼠髓样树突状细胞免疫功能的研究

目的:观察TLR2激活剂Pam3CK对IL-10转染小鼠髓样树突状细胞免疫功能影响。方法:转染IL-10至小鼠髓样树突状细胞(mDC),TLR2配体Pam3CK刺激48小时,利用流式细胞仪检测DC表面标志MHCⅡ、CD80、CD86及FasL等分子的表达;ELISA检测细胞产生IL-6、TNF-α。结果:IL-10抑制mDC表达CD80、CD86、MHCⅡ类分子,降低其分泌IL-6、TNF-α,促进其表达FasL,而TLR2激动剂刺激增加了IL-10转染DC表达MHC-Ⅱ类分子及CD80、CD86,促进其产生IL-6及TNF-α,抑制了FasL表达。结论:TLR2激动剂可逆转IL-10诱发的DC免疫应答低下。     

重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)转染DC培养上清诱导HepG2株凋亡的研究

目的:探讨人类乙肝核心抗原重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)转染人外周血单核细胞来源树突状细胞后,细胞培养上清诱导肝癌细胞株HepG2凋亡的作用及机制。方法:构建真核表达质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa,c),将其转染人外周血来源DC,用培养上清诱导HepG2的凋亡。用流式细胞仪检测已转染DC表面CD80和CD86的表达,检测培养上清诱导HepG2凋亡的变化。用ELISA法检测转染后DC培养上清的IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-4和IL-10的水平。结果:pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)转染DC表面CD80和CD86的表达均有明显升高(P0.01)。转染后上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-12的表达增强(P0.01),Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达下降(P0.05),pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)组培养上清对HepG2细胞具有促凋亡作用,随着培养时间延长,细胞凋亡率逐渐增加,HepG2细胞在诱导后24小时凋亡率达到最大,为18.4%。结论:重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISSa)转染培养上清能明显促进肝癌细胞株HepG2的凋亡。     

烟草烟雾提取物促进髓样树突状细胞共刺激分子的表达北大核心CSCD

目的通过体外实验研究烟草烟雾提取物(CSE)对小鼠髓样树突状细胞(mDC)成熟的影响及可能的机制。方法小鼠骨髓来源的单个核细胞加入粒-单集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液诱导出可供实验用的高纯度的未成熟DC(iDC),分空白对照组和CSE刺激组;CSE刺激组按15 mL/L的终浓度加入CSE,两组继续培养24 h,流式细胞检测技术检测mDC的共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达。结果空白对照组的mDC低表达CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ;CSE刺激后mDC表达CD40、CD80和MHC-Ⅱ比空白对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论烟草烟雾提取物促进小鼠骨髓来源的mDC的CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表达。     

烟草烟雾提取物促进髓样树突状细胞共刺激分子的表达

目的通过体外实验研究烟草烟雾提取物(CSE)对小鼠髓样树突状细胞(mDC)成熟的影响及可能的机制。方法小鼠骨髓来源的单个核细胞加入粒-单集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液诱导出可供实验用的高纯度的未成熟DC(iDC),分空白对照组和CSE刺激组;CSE刺激组按15 mL/L的终浓度加入CSE,两组继续培养24 h,流式细胞检测技术检测mDC的共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达。结果空白对照组的mDC低表达CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ;CSE刺激后mDC表达CD40、CD80和MHC-Ⅱ比空白对照组明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论烟草烟雾提取物促进小鼠骨髓来源的mDC的CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表达。     

逆转录病毒介导乙型肝炎病毒C基因在树突状细胞中的转移

目的：探讨逆转录病毒介导乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因在骨髓来源的树突状细胞(DC)的转移效率，以及对DC成熟和功能的影响。方法：用含有HBV C基因的重组逆转录病毒载体，感染处于分裂期的小鼠骨髓祖细胞，感染后的骨髓细胞在GM—CSF和IL—4存在的条件下继续培养获得成熟的DC，用PCR、RT—PCR，分析目的基因的整合与转录；用Western blot和流式细胞仪，分析HBcAg的表达及基因转移效率，以及检测感染前后DC CD80和MHC—Ⅱ类分子的表达以及分泌IL—12能力的变化；通过将基因转移后的DC与淋巴细胞进行混合培养，检测其体外诱导CTL的能力。结果：逆转录病毒感染后并不影响骨髓来源的DC成熟，对其表面分子CD80和MHC-Ⅱ类分子的表达和分泌IL-12的能力没有影响。目的基因能整合到DC的基因组DNA中，并能转录和翻译。约28％的DC能表达HBcAg，感染后的DC体外能诱导T细胞应答。结论：逆转录病毒能有效地将HBV C基因转移到骨髓来源的DC中，对DC的成熟和功能无明显影响，并能诱导CTL应答，这将有助于开展以DC为基础的慢性乙肝的免疫治疗。     

负载滋养层细胞抗原对小鼠树突状细胞表型及功能的影响

目的 研究负载滋养层细胞抗原对小鼠髓源性树突状细胞(DC)分化成熟过程的影响,获得致耐受性DC.方法 体外使用粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导小鼠骨髓细胞定向分化、经LPS刺激获得成熟DC;通过外胎盘锥组织块培养法获得滋养层细胞,制备可溶性抗原,加入DC培养体系.流式细胞术检测DC表面共刺激分子及MHC-Ⅱ的表达,ELISA法检测DC分泌IL-10和IL-12的浓度,混合淋巴细胞培养评估 DC刺激同种T细胞增殖、活化的功能.结果 成熟DC表型为CD40high CD80highCD86highMHC-Ⅱhigh,分泌大量的IL-12和极少量的IL-10 ,体外能有效刺激T细胞的增殖;负载滋养层细胞抗原的DC表型为CD40midCD80lo wCD86lowMHC-Ⅱlow,在分泌大量IL-12的同时IL-10也明显升高,不能有效刺激T细胞增殖,并使T细胞分泌细胞因子呈现明显Th2偏倚.结论 负载滋养层细胞抗原后的DC表面共刺激分子及MHC-Ⅱ表达降低,刺激T细胞增殖能力下降;其自分泌和促使T细胞旁分泌的细胞因子呈现Th2偏倚,是一种耐受性DC.     

核转录因子RelB抑制途径对骨髓树突状细胞表面分子表达的影响研究

目的探讨核转录因子RelB抑制途径对小鼠骨髓树突状细胞（bone marrow dendritic cells）的表面分子表达的影响,为致耐受树突状细胞的研究提供新方法。方法 rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导培养体系培养小鼠骨髓树突状细胞,免疫磁珠方法纯化;用慢病毒载体制备RelB shRNA慢病毒,与小鼠骨髓树突状细胞共培养,流式细胞术观察树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40的表达,设LPS-DC对照组、未处理组和LPSRNAi RelB DC组。结果核转录因子RelB抑制的树突状细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40均低水平表达,显著低于成熟DC表面分子的表达（P〈0.05）,且经LPS刺激后（LPS RNAi RelB DC）DC表面上述三类分子的表达水平仍显著低于LPS-DC组（P〈0.05）,与未处理组（immature DC）表面分子表达水平相当。结论核转录因子RelB抑制的骨髓树突状细胞表面分子表达水平低,呈现出致耐受的树突状细胞的特点,是致耐受树突状细胞研究的一种新方法。     

转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞诱导个体化免疫治疗的体外实验

目的探讨转染自体胃癌细胞总RNA的树突状细胞(DC)体外介导抗胃癌的免疫效应。方法制备短期培养的原代胃癌细胞。用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α体外诱导胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)中DC的发育和成熟,并转染自体肿瘤细胞总RNA,激活自体T细胞产生CTL,用CCK-8试剂盒检测CTL的杀伤活性。应用流式细胞术及混合淋巴细胞培养技术检测DC的免疫功能状态。用ELISA法测定IL-12和INF-γ的水平。结果转染自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC,不仅可高表达MHC-I、II类分子及CD80、CD83和CD86协同刺激分子,并可获得高效刺激自体或异体T细胞增殖的能力。转染RNA的成熟DC,分泌IL-12的水平及其刺激产生的CTL培养上清液中INF-γ的水平显著高于单纯成熟DC及未成熟DC;且CTL对自体胃癌细胞的杀伤率显著高于异体组。结论转染自体胃癌细胞总RNA的成熟DC能够体外诱导产生对自体肿瘤细胞具有高度抗原特异性杀伤活性的CTL。     

Lipopolysaccharide preferentially induces 4-1BB ligand expression on human monocyte-derived dendritic cells

Dendritic cells (DCs) represent a promising tool for immunotherapy. A key feature in their action is to provide co-stimulatory signals for full activation of T cells. In view of recent studies demonstrating the critical role of 4-1BB co-stimulation in T cell response, it is of importance to optimize 4-1BB ligand (4-1BBL) expression on human monocyte-derived DCs (MDDCs), the DC source of many clinical studies. In this study, two types of MDDCs, generated in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-4 (GM-CSF/IL-4-DCs) or in interferon-β and IL-3 (IFN-β/IL-3-DCs), were analyzed for 4-1BBL expression in response to several known DC activators. Immature MDDCs expressed 4-1BBLs at very low levels. Lipopolysaccharide (LPS) was the only activator that preferentially triggered 4-1BBL expression on either MDDCs, but 4-1BBL-positive cells were significantly more frequently observed on LPS-activated GM-CSF/IL-4-DCs (30.2±2.6% versus 14.3±1.2%). Combinations of multiple activating signals did not bring about enhanced 4-1BBL stimulatory capacity. In addition, plasmid DNA transfection and necrotic cell pulsing of GM-CSF/IL-4-DCs for antigen loading also resulted in 4-1BBL up-regulation. However, in all circumstances, the induced 4-1BBL levels were low in comparison with CD80 co-stimulatory molecule. Finally, by demonstrating LPS-matured GM-CSF/IL-4-DCs from sorted 4-1BBL^high population augmented T cell expansion and survival, we propose that efforts are required to increase 4-1BBL levels on MDDCs achieved by current activation schemes.     

结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备

目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGHsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测Hsp65mRNA的表达。以pEGHsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株Hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到Hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGHsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。     

Expression of recombinant mouse IL-1beta significantly down-regulates NK cell mediated cytotolysis against H22 hepatoma cells]

AIM: To investigate the effect of the expression of recombinant IL-1beta in H22 hepatoma cells on its response to NK cell mediated cytotoxicity. METHODS: BALB/c mouse was stimulated by 6% of starch. Total RNA was prepared from peripheral blood monocytes (PBMCs). IL-1beta gene (843 bp) was obtained by RT-PCR. The purified PCR product digested by Xho I and EcoR I was cloned into pIRES2-EGFP to construct the recombinant pIRES2-EGFP-mIL-1beta expression vector which was verified by PCR, restriction enzyme assay (Xho I and EcoR I) and DNA sequencing. Then the purified pIRES2-EGFP-mIL-1beta plasmid was transfected into H22 hepatoma cells by jetPEI. The expression level of recombinant IL-1beta was detected by RT-PCR and confocal microscopy. The cytotoxicity of wild-type spleenic NK cells against H22 cells was assessed by MTT assay. RESULTS: After the total RNA isolated from the starch stimulated BALB/c mouse PBMC, 843 bp IL-1beta gene in length was prepared by RT-PCR. The purified PCR product digested by EcoR I and Xho I was ligated by pIRES2-EGFP to create pIRES2-EGFP-mIL-1beta expression plasmid which was verified by PCR, restriction enzyme assay and DNA sequencing. Then pIRES2-EGFP-mIL-1beta was transfected into H22 hepatoma cells by jetPEI. RT-PCR and confocal microscopy assay showed these cells expressed high level of recombinant IL-1beta expression vector. In a 4-hour based MTT assay, IL-1beta in H22 cells was more resistant to NK92 cell mediated cytotoxicity compared with the cells transfected with pIRES2-EGFP. Meanwhile, the cytolytic capacity of the spleenic NK cells separated from wild-type mouse decreased about 10% when the ratio of effector to target was 40:1. CONCLUSION: The expression of proinflammatory cytokine IL-1beta can significantly down-regulate the cytolytic activity of NK cells against H22 hepatoma cells. It plays a crucial role in the immune escape of hepatoma from NK cell mediated innate immunity.     

小鼠骨髓成熟与不成熟树突状细胞中RelB基因的表达

目的:探讨体外分离培养的小鼠骨髓来源的成熟与未成熟DC中核转录因子RelB(avianreticuloendotheliosisviral(v-rel)oncogenerelatedB)基因的表达。方法:无菌从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中取出骨髓细胞,利用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导骨髓前体细胞产生未成熟的DC,未成熟的DC在培养结束前18h经LPS刺激获得成熟的DC,用流式细胞术分析它们的表型,用RT-PCR和免疫荧光染色法检测成熟与未成熟DC中,RelBmRNA和其蛋白的表达。结果:流式细胞术分析显示未成熟的DC中MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子(CD86和CD40)呈低水平表达;而成熟的DC则呈高水平表达。RT-PCR和免疫荧光染色法检测结果均显示,RelB基因在未成熟的DC中呈低水平表达;而在成熟的DC中呈高水平表达,两者比较具有统计学意义(P<0.01)。结论:RelB基因的表达与小鼠骨髓来源的DC的成熟状态密切相关。抑制DC中RelB基因的表达,有可能诱导产生具有耐受原性的未成熟的DC。