转染人骨形态发生蛋白-2基因的羊骨髓间充质干细胞的异位成骨研究

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)基因转染羊骨髓间充质干细胞(MSCs)后的成骨活性。方法实验分为3组:(1)hBMP-2转染细胞组,(2)半乳糖苷酶基因(βgal)转染细胞组,(3)未转染细胞组。从羊骨髓中分离培养MSCs,基因转染后利用免疫沉淀和Westernblot方法检测BMP-2的表达,并在体外进行碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色、ALP定量测定、透射电镜观察。分别将细胞悬液注入裸鼠股后部肌内,分期进行X线和组织学检查。结果Westernblot检测发现只有hBMP-2转染细胞组的MSCs表达并分泌hBMP-2。该组于转染后第12d,ALP活性达高峰,与其它两组比较,差异有显著性意义;于16d后出现钙结节,而其它两组未见。透射电镜观察见hBMP-2转染细胞组的细胞内粗面内质网、线粒体和溶酶体增多。裸鼠肌内注射细胞悬液后3周,hBMP-2转染细胞组即有异位成骨,6周时明显增多,其它两组仅见纤维组织形成或微量成骨。结论hBMP-2基因转染能诱导羊MSCs分化为成骨细胞,并在裸鼠体内诱导成骨。     

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

目的　研究脂肪间充质干细胞 (MSCs)在特定培养条件下向成骨细胞分化 ,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法　取 3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫 ,消化法获得脂肪MSCs,用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化 ,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Westernblotting检测细胞分化的情况。结果　从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs,能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下 ,脂肪MSCs的ALP活性增高 ,VonKossa染色出现钙结节 ,OPN、BMP - 2免疫细胞化学染色阳性 ,Westernblotting检测到诱导后细胞OPN、BMP - 2的表达 ,且随诱导时间延长表达增强。结论　从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs,并能在体外稳定增殖传代 ,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞 ,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一     

脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

目的研究脂肪间充质干细胞(MSCs）在特定培养条件下向成骨细胞分化，探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫，消化法获得脂肪MSCs，用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化，组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况。结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs，能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下，脂肪MSCs的ALP活性增高，Von Kossa染色出现钙结节，OPN、BMP-2免疫细胞化学染色阳性．Western blotting检测到诱导后细胞OPN、BMP-2的表达，且随诱导时间延长表达增强。结论从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs，并能在体外稳定增殖传代，经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞，有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

BMP-2重组腺病毒转染肌源细胞体内外成骨的实验研究

目的探讨经重组腺病毒(Ad—BMP-2)转染的肌源细胞(muscle—derived cells)可否表达骨形成发生蛋白-2(BMP-2)及其体内外的成骨作用．方法Ad—BMP-2在体外转染肌源细胞后回植体内，观察其转归及成骨活性一结果经Ad—BMP-2转染的肌源细胞中有BMP-2的表达，该细胞中有碱性磷酸酶、培养基中有骨钙素的存在，细胞植入体内后可诱导成骨。结论经Ad—BMP-2转染的肌源细胞在生物体内外均具有骨诱导活性.     

人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究

目的 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)分离培养的生物学特性及其向成骨、成脂诱导分化的能力.方法 从人脐血中分离扩增MSCs,显微镜下观察其形态及生长情况,绘制生长曲线,电镜下观察超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标志物;成骨、成脂诱导后以碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色鉴定MSCs成骨分化潜能,油红O染色鉴定成脂分化潜能.结果 人脐血MSCs为成纤维细胞样,漩涡状贴壁生长排列,传至第110代细胞形态无明显变化;电镜下显示为低分化细胞;细胞表面不表达CD34和CD45,强表达CD29、CD44和CD90;成骨诱导后可检测到ALP表达及钙化结节形成;成脂诱导后可检测到脂滴形成.结论 人脐血中可分离出MSCs,与其他来源的MSCs具有类似的生物学特性及多向分化潜能,脐血有可能成为骨组织工程种子细胞的来源.     

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响

目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓基质细胞(MSC)，对其体外诱导后表达成骨表型的影响，探讨EGFP作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，并转染骨髓基质细胞，G418进行筛选。将转染后稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞(MSC-EGFP)进行成骨诱导扩增，以未转染的MSC为对照组，分别检测成骨诱导后碱性磷酸酶(AKP)活性，骨钙蛋白(OCN)含量和成骨细胞转录因子(Cbfal)的表达。结果 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，转染后获得稳定表达绿色荧光蛋白的MSC-GFP，其体外经成骨诱导后，同样能表达成骨特征性表型，AKP，OCN，Cbfal表达和未转染组无明显差别。结论 MSC转染EGFP后，不影响其体外成骨诱导后成骨表型的表达，EGFP可作为骨组织工程种子细胞(MSC)良好的示踪剂。     

同种异体骨髓基质细胞肌肉内成骨分化的实验研究

目的 观察并探讨同种异体兔骨髓基质细胞在未接受免疫抑制剂的正常兔肌肉内移植后的免疫原性、存活及成骨状况.方法 首先通过兔谱系差异选择供、受体,并采用淋巴细胞反应进一步证实免疫学错配,之后抽取兔骨髓、体外分离培养、获取骨髓基质细胞,体外加矿化条件培养液诱导成骨、并对成骨特性予以鉴定后,将异体骨髓基质细胞移植入受体兔肌肉内,从淋巴细胞转化率、淋巴细胞杀伤活性、组织学检查、种子细胞体内成活及成骨情况等方面检测. 结果 术后各检测时间,异体骨髓基质细胞移植未诱发淋巴细胞大量增殖反应(P>0.05),淋巴细胞杀伤活性与自体组差异无统计学意义(P>0.05),移植区未见到大量炎性细胞浸润,经组织学及免疫组化染色证实异体骨髓基质细胞在受体组织内存活,8周后于异体肌肉中形成骨组织. 结论 同种异体骨髓基质细胞移植,未诱发免疫排斥反应,在无免疫抑制剂应用的情况下,移植细胞在受体肌肉内存活、并形成骨性组织.     

骨形成蛋白-2基因转染人骨髓间质干细胞诱导异位成骨的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人骨形成蛋白—2基因(Adv—hBMP—2)转染人骨髓间质干细胞(MSCs)的诱导成骨能力。方法 从人骨髓中分离培养获取MSCs，分为三组：①Adv—hBMP—2转染细胞组；②Adv—βgal转染细胞组；③未转染细胞组。分别于体外行western immunoblot试验、碱性磷酸酶(ALP)和Von Kossa染色、ALP定量测定，以及裸鼠肌内诱导成骨试验。共9只裸鼠，双例股后肌群内注射，每组6例。结果 Adv—hBMP—2组MSCs可分泌BMP—2蛋白；转染后第9天ALP染色多数细胞为阳性，其它两组ALP染色阳性细胞少见；ALP活性第3天开始升高，12天达高峰为14．76单位，与其它两组比较有统计学意义(P＜0．05)；于第21天后出现钙结节，而其它两组未见。裸鼠肌内注射后4周Adv—hBMP—2组X线片均有异位成骨，Adv—βgal转染细胞组未见明显成骨，未转染细胞组仅有少量骨形成。组织学检查发现：Adv—hBMP—2组也可见典型的板层骨和骨髓腔形成，Adv—βgal组主要为纤维组织，未转染组也可见散在骨小粱形成。结论 Adv—hBMP—2基因转染可诱导人骨髓问质干细胞成骨。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养诱导成骨能力的研究

目的：观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养生长时的生物学特性，及诱导分化为成骨细胞的能力。方法：取成年大鼠2只，处死后分离、培养骨髓基质细胞，第8天时添加矿化液诱导培养，细胞经传代后绘制生长曲线。应用倒置相差显微镜、透射电镜观察其生长特性，并进行甲苯胺蓝染色，Won Kossa染色，碱性磷酸酶染色。结果：培养的大鼠骨髓基质细胞呈成纤维细胞样生长，增殖活跃。经诱导后，细胞碱性磷酸酶活性高，连续培养30天，Von-KaSSR染色显示有局灶状钙盐沉积。结论：MSCs易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质细胞在体外即具有很强的成骨能力，为研究其作为骨组织工程种子细胞植入体内成骨奠定基础。     

Ectopic bone formation of human bone morphogenetic protein-2 gene transfected goat bone marrow-derived mesenchymal stem cells in nude mice

onemorphogenetic proteins (BMPs)haveapowerfulcapacitytoelicitnewboneformation .ThereareseveraldeliverymethodsofBMPsintreatingbonedefects ,oneofwhichisgenetherapy .Retrovirus,adenovirusandadeno associatedvirushavebeenutilizedtodeliverBMPgene .1,2 Sincethedirectuseofthesevectorshasseveraldisadvantages ,wehavedevelopedexvivo genetherapytechniquewhichinvolvestheisolationandcultivationofautologousbonemarrow derivedmesenchymalstemcells (MSCs) ,transfectionofthecellsinvitroandimplantationofthesec…     

种植转染VEGF165基因骨髓基质细胞的脱蛋白异体骨在裸鼠体内的成骨

目的:探讨脱蛋白骨支架种植转染血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓基质细胞体内的成骨作用.方法:从狗的髂骨穿刺骨髓分离骨髓基质细胞,应用脂质体转染VEGF165基因,以RT-PCR检测转染的基因表达.随机选取4周龄BALB/C裸鼠30只,随机分为3组,各组10只.实验组A为脱蛋白骨 转染pcDNA3-hVEGF165基因的骨髓基质细胞;实验组B为脱蛋白骨 骨髓基质细胞;对照组C为单纯植入脱蛋白骨 DMEM.在脊柱两侧分开肌间隙,每只裸鼠植入2块脱蛋白骨材料至肌腹内.术后4、8周处死取材,经大体观察、组织形态学与免疫组化方法检查细胞材料复合物植入后的成骨作用及VEGF表达.结果:组织学检查A、B组均有成骨,并随时间延长而新骨增多,但其中转基因的A组其成骨作用明显,并在植入4周后免疫组化可见VEGF表达呈阳性;对照组C无成骨现象.结论:转染VEGF165基因骨髓基质细胞复合脱蛋白骨在体内具有较好的成骨作用.     

MSCs与CD34~+单核细胞共培养联合脱细胞支架植入体内构建兔阴茎海绵体

目的研究将异体骨髓间充质干细胞(MSCs)和CD34~+单核细胞(MNCs)共培养体系种植于脱细胞海绵体支架上在兔体内构建阴茎海绵体组织的可行性。方法分别从兔骨髓与兔外周血中提取并鉴定MSCs与CD34~+MNCs,将两种细胞组分以107/mL的密度种植于制备好的兔阴茎海绵体脱细胞胶原支架上,同时将相同密度的MSCs、CD34~+MNCs分别种植于支架上,培养4天后植入一种兔阴茎海绵体缺损模型中。3个月后对工程化组织进行取材,行HE及Masson三色染色等组织学检测。结果 MSCs和CD34~+MNCs共培养组近白膜处的海绵体保留了正常海绵体结构,而MSCs组、CD34+单核细胞组及空白支架组以疤痕增生为主,尽管较之CD34~+单核细胞组及空白支架组,间充质干细胞组疤痕组织中的血管数目较多(P0.05)。结论我们的研究证明了将MSCs和CD34~+MNCs的共培养体系种植于脱细胞支架上植入兔体内可以构建出一段组织学上与原生海绵体相似的组织;CD34~+MNCs在体内主要通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

血管内皮生长因子165基因转染的骨髓基质细胞异位成骨的初步研究

目的：将血管内皮生长因子165（VEGF165）基因转染的大鼠骨髓基质细胞（MSCs）和β-磷酸三钙复合后,植入原大鼠肌肉中,探索转染外源基因的MSCs异位成骨能力。方法：SD大鼠12只,在全麻及无菌条件下取其左侧股骨的骨髓基质细胞,并用矿化液诱导培养。在脂质体介导下将构建成功的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165转染到诱导培养的MSCs,G-418筛选阳性细胞克隆,将阳性克隆细胞和未转染的MSCs共同接种于β-磷酸三钙上,体外培养7天后,植入原大鼠肌肉内。分别于4周、8周和12周处死动物,观察异位成骨情况。结果：骨髓基质细胞-β-磷酸三钙复合体植入肌肉后,材料周围血管生长较多,随着植入时间的延长,小的骨岛逐渐融合为大的骨块,并有骨髓腔样结构,表现出较好的异位成骨能力。结论：应用VEGF165基因转染MSCs作为种子细胞植入体内后,有利于发挥VEGF165的血管化作用,同时促进组织工程骨的成骨速度,将会成为组织工程骨血管化探索的方向。     

犬骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究

目的：研究犬骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外定向诱导,向血管内皮细胞（ECs）方向分化,探讨其作为组织工程血管种子细胞的可行性。方法：获取犬骨髓单个核细胞,体外分离出MSCs。将分离的MSCs接种于含EBM-2完全培养液的培养瓶,向内皮样细胞定向诱导分化;LG-DMEM完全培养液培养的MSCs作为对照组。对MSCs表型进行流式细胞仪鉴定;诱导的内皮样细胞进行CD31、Ⅷ因子免疫细胞化学鉴定和摄取Dil-Ac-LDL、结合FITC-UEA的双染色功能鉴定。结果：流式细胞术检测培养的原代MSCs表面标志CD44表达呈阳性,而CD34表达则呈阴性;诱导分化的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,与成体内皮细胞相似;诱导的内皮样细胞Ⅷ因子染色和CD31免疫荧光染色均呈明显阳性,对照组细胞为阴性;诱导的内皮样细胞Dil-Ac-LDL摄取实验和FITC-UEA结合实验,细胞呈阳性表现。结论：在体外用骨髓MSCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞,为组织工程血管内皮化提供了一种可行的种子细胞来源。     

Bone marrow stem cells for urologic tissue engineering

OBJECTIVES: Experiments in rats and dogs have demonstrated the potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for urinary tract tissue engineering. However, the small graft size in rats and a failure to identify the MSCs in engineered tissues made it difficult to assess the true potential of these cells. Our goals were to characterize MSCs from pigs, determine their ability to differentiate into smooth muscle cells (SMCs) and use them in an autologous augmentation cystoplasty. METHODS: MSCs were isolated from pigs and analyzed for common markers of MSCs by flow cytometry. SMC differentiation was determined by immunoblotting. MSCs were isolated, genetically labeled, expanded in vitro, seeded onto small intestinal submucosa (SIS) and used for autologous bladder augmentation. RESULTS: Porcine MSCs are morphologically and immunophenotypically similar to human MSCs. Culturing MSCs at low density enhances proliferation rates. MSCs consistently differentiate into mature SMCs in vitro when maintained at confluence. Labeled MSCs grew on SIS over one week in vitro and survived a 2-week implantation as an autologous bladder augment in vivo. Some label-positive cells with SMC morphology were detected, but most SMCs were negative. Notably, many cells with a urothelial morphology stained positively. CONCLUSIONS: Porcine MSCs have similar properties to MSCs from other species and consistently undergo differentiation into mature SMC in vitro under specific culture conditions. Labeled MSCs within SIS may assist tissue regeneration in augmentation cystoplasty but may not significantly incorporate into smooth muscle bundles.     

Comparison of Osteogenic Potentials of BMP4 Transduced Stem Cells from Autologous Bone Marrow and Fat Tissue in a Rabbit Model of Calvarial Defects

We compared bone marrow stem cells (BMSCs) and adipose-derived stem cells (ADSCs) of adult rabbits under identical conditions in terms of their culture characteristics, proliferation capacity, osteogenic differentiation potentials induced by adenovirus-containing bone morphogenetic protein 4 (Ad-BMP4) in vitro, and capacity to repair calvarial defects in the rabbit model by autologous transplantation ex vivo. According to the results of growth curve, cell cycle, and telomerase activity analysis, ADSCs possess a higher proliferation potential. Both of the Ad-BMP4 transduced MSCs expressed BMP4 mRNA and protein and underwent osteogenic differentiation. Up-regulated mRNA expression of all osteogenic genes was observed in differentiated BMSCs and ADSCs, but with different patterns confirmed by real-time RT-PCR. Deposition of calcified extracellular matrix was significantly greater in differentiated ADSCs compared with differentiated BMSCs. X-ray and histological examination indicated significant bone regeneration in the calvarial defects transplanted with Ad-BMP4 transduced autologous MSCs compared to the control groups. There was no significant difference in new bone formation in Ad-BMP4 transduced MSCs based on quantitative digital analysis of histological sections. The use of ADSCs often resulted in the growth of fat tissue structures in the control groups, and the fat tissue structures were not seen with BMSC cells. Our data demonstrate that BMP4 can be potently osteoinductive in vivo, resulting in bone repair. ADSCs may be an attractive alternative to BMSCs for bone tissue engineering under appropriate stimuli. But the easy adipogenic differentiation needs to be considered when choosing adipose tissue for specific clinical application.     

兔骨髓间质干细胞修复肌腱缺损效果观察

目的　观察兔骨髓间质干细胞(MSCs)修复肌腱缺损的效果。　方法　分离培养家兔MSCs,检测CD44mRNA进行鉴定。6只家兔分为实验组和对照组,每组3只。在兔跟腱处造成3cm长的缺损,实验组家兔以自体MSCs为种子细胞、以胶原聚羟基乙酸(PGA)为生物支架构建肌腱并移植于跟腱缺损处,对照组家兔仅以PGA生物支架修复跟腱缺损。于术后4、8、12周对移植部位进行大体和组织学观察。　结果　MSCs培养11d时CD44mRNA显示阳性。实验组术后8周肉眼可见移植处形成腱样组织, 12周时组织学观察可见形态一致、顺应力学方向排列于胶原中的腱样细胞,类似正常肌腱组织。对照组所形成的新生组织较实验组细小且与周围组织粘连, 12周时组织学观察见细胞排列紊乱,胶原纤维呈松散网丝状。　结论　应用组织工程技术以自体MSCs修复肌腱缺损具有可行性。     

转染人骨形成蛋白-7基因的骨髓基质细胞异位成骨实验研究

目的 观察转染人骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7,BMP-7）基因的骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）与胶原膜（BME-10X）复合培养后的异位成骨能力。方法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC,与胶原膜复合培养后,植入裸鼠皮下,8周后取材,HE、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其异位成骨能力。结果各组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,转染组和未转染组显著高于单纯膜组,转染组又显著高于未转染组（P〈0．05）。结论转染了hBMP-7基因的BMSCs具有更强的异位成骨能力,有望成为牙周组织工程理想的种子细胞,