纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2与骨髓基质干细胞的体外培养*☆

背景：纳米级羟基磷灰石支架材料复合骨形态发生蛋白2因子组织构建模式组合后对骨髓基质干细胞的作用是叠加促进或抑制作用以及其生物相容性如何？ 目的：验证纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2与骨髓基质干细胞在体外共同培养下的生物相容性和成骨性。 方法：将兔骨髓基质干细胞体外培养、传代和扩增,经鉴定后将第3代细胞分别接种在对照组、骨形态发生蛋白2组、纳米羟基磷灰石组、纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组4种培养液中。 结果与结论：对照组和纳米羟基磷灰石组的细胞倍增时间较骨形态发生蛋白2组、纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组两组长;骨形态发生蛋白2组和纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组细胞增殖能力及碱性磷酸酶测量值明显大于对照组和纳米羟基磷灰石组(P < 0.01)。提示纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2的组织构架不仅与骨髓基质干细胞之间具有良好的生物相容性,还可发挥骨形态发生蛋白2促进骨髓基质干细胞增殖和定向分化成骨的作用。 关键词：纳米羟基磷灰石;骨形态发生蛋白2;骨髓基质干细胞;生物相容性;支架;碱性磷酸酶 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.12.009 中图分类号: R318  文献标识码: B       

骨形态发生蛋白基因在骨组织工程领域的研究进展

运用基因增强的组织工程学技术修复骨缺损具有广阔的临床应用前景，骨形态发生蛋白基因是目前骨组织工程研究最重要的目的基因。如何选择合适类型的骨形态发生蛋白基因、基因转染载体、靶细胞、转染途径以及在缺损局部持续高效表达出具有生物活性的骨形态发生蛋白是目前亟待解决的关键问题。对以上各方面的最新进展进行了综述，并对今后的发展方向进行了展望。     

骨形态发生蛋白2和7共转染骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白最主要的作用是诱导骨形成,但因提取困难、代谢速度快、难以准确控制其使用浓度、价格昂贵等限制了其在体外和体内相关研究中的应用。 目的：构建含特异细胞生长因子基因骨形态发生蛋白2,7的腺病毒载体,观察骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因共转染对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。 方法：将全骨髓贴壁法分离得到兔骨髓间充质干细胞传至第3代,分为5组,空白组和常规诱导组分别以常规培养基和成骨诱导分化培养基培养;骨形态发生蛋白2, 7腺病毒转染组：分别单独以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7腺病毒进行转染;联合转染组：以2种骨形态发生蛋白腺病毒联合转染。 结果与结论：转染第7天,联合转染组成骨相关基因Runx-2、Osx、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶mRNA表达均较其他各组增高(P < 0.05);骨形态发生蛋白2,7腺病毒转染组上述指标较空白组和常规诱导组增高(P < 0.05)。转染第14天,联合转染组4个指标均较其他各组明显增高(P < 0.05);同时,4个指标表达均高于第7天(P < 0.05)。病毒转染后第7天,联合转染组Ⅰ型胶原和骨钙素蛋白表达均较其他组明显增高(P < 0.05)。提示对骨髓间充质干细胞进行骨形态发生蛋白2腺病毒和骨形态发生蛋白7腺病毒共转染后,较单基因转染和成骨诱导液诱导更能促进成骨相关基因和蛋白的表达。     

仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原的制备及其细胞相容性

背景：目前骨组织工程常用的支架材料主要有无机材料、有机高分子材料及天然衍生材料等,上述材料各有优缺点,为了充分发挥各类材料的优势,弥补其不足,目前多采用联合材料制备复合支架。 目的：制备新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原,并观察其对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化的影响。 方法：制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;采用真空吸附法将骨形态发生蛋白7多肽与支架材料复合,高效液相色谱仪检测骨形态发生蛋白7多肽在体外的释放规律;将骨髓间充质干细胞接种到复合骨形态发生蛋白7多肽的仿生支架材料上,以未复合多肽的支架材料作为对照,检测支架材料表面细胞增殖、黏附率、生长形态及碱性磷酸酶活性。 结果与结论：壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原支架材料呈多孔状,孔径10~100 µm;骨形态发生蛋白7多肽可以从支架材料中缓慢释出;在复合多肽的仿生支架材料表面,骨髓间充质干细胞的黏附及向成骨细胞方向分化能力均明显强于对照组(P < 0.05),而增殖能力与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)。说明新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原是一种理想的骨组织工程支架材料,具有良好的细胞相容性。     

锌指蛋白3调节骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2是参与骨骼生长发育和修复的重要因子,近年来的研究发现锌指蛋白3参与调节转化生长因子β信号的转导,该研究以此为基础开展研究。目的：探讨抑制锌指蛋白3对骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。方法：以小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2细胞为研究对象,设置绿色荧光蛋白、骨形态发生蛋白2、锌指蛋白3、骨形态发生蛋白2+锌指蛋白3重组腺病毒转染组,增强骨形态发生蛋白2表达,抑制锌指蛋白3表达。采用碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶的表达;RT-qPCR检测骨形态发生蛋白2、锌指蛋白3及成骨、成血管标志物mRNA转录水平;免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原、血管内皮生长因子及内皮黏蛋白表达水平;茜素红染色及半定量分析检测钙盐沉积水平;裸鼠皮下成骨实验检测异位骨块形成情况。结果与结论：(1)骨形态发生蛋白2重组腺病毒能诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化,与骨形态发生蛋白重组腺病毒组比较,骨形态发生蛋白2+锌指蛋白3重组腺病毒组成骨标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、成骨细胞特异性转录因子、骨钙素、Runt相关转录因子2及成血管标志物神经轴突导向因子、血管内皮生长因子、血管性血...     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。 方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1 d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。 结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异(P < 0.05);诱导7 d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14 时骨钙素免疫细胞化学染色、21 d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义(P < 0.05),第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

骨形态发生蛋白基因在骨组织工程领域的研究进展

运用基因增强的组织工程学技术修复骨缺损具有广阔的临床应用前景,骨形态发生蛋白基因是目前骨组织工程研究最重要的目的基因。如何选择合适类型的骨形态发生蛋白基因、基因转染载体、靶细胞、转染途径以及在缺损局部持续高效表达出具有生物活性的骨形态发生蛋白是目前亟待解决的关键问题。对以上各方面的最新进展进行了综述,并对今后的发展方向进行了展望。     

骨形态发生蛋白2抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的优选浓度

BACKGROUND:Bone morphogenetic protein 2 cannot only promote osteogenesis, but also at different concentration ranges regulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes. Therefore, it is very important for the prevention and treatment of osteoporosis, if the range of concentrations of bone morphogenetic protein 2 can be found to regulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes, after the induction of bone marrow mesenchymal stem cells. OBJECTIVE:To determine the optimal concentration of bone morphogenetic protein 2 to inhibit the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into adipocytes. METHODS:Bone marrow samples were obtained from the femur and tibia of rats. Primary cultured bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by adherent culture method in vitro. Flow cytometry was used to identify the surface antigens of passage 2 bone marrow mesenchymal stem cells. Cells at passages 2 and 3 were taken and cultured in adipogenic induction medium for 3 days followed by the addition of 0.5, 5, 50, 100, 200 μg/L bone morphogenetic protein 2, or culture medium of bone marrow mesenchymal stem cells (control group), respectively. RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells cultured were identified by the flow cytometry. Oil red O staining results showed that the increasing number of lipid droplets was shown in bone marrow mesenchymal stem cells induced by bone morphogenetic protein 2 under the increasing concentration of 0.5 to 50 μg/L; while the number of lipid droplets in bone marrow mesenchymal stem cells decreased after 17 days of induction with bone morphogenetic protein 2 under the concentration of 100 to 200 μg/L. These findings indicate that 100 μg/L bone morphogenetic protein 2 can inhibit adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cell, so as to reduce the formation of adipocytes in rats. Therefore, 100 μg/L bone morphogenetic protein 2 is better to inhibit adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.     

骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释载体的生物相容性

背景：目前硫酸钙主要被作为抗生素载体和成骨因子载体。 目的：观察骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释系统的体外缓释效果及与种子细胞的生物相容性。 方法：制备骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释系统,检测其体外释放性能。将SD大鼠骨髓间充质干细胞经体外诱导培养、扩增后,种植于骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释载体和单纯的注射式硫酸钙支架上行体外培养。 结果与结论：骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释支架具有缓释骨形态发生蛋白2的效果,持续时间可达31 d。骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释支架与大鼠骨髓间充质干细胞具有优良的生物相容性,并且相同时间点支架上的细胞黏附率、细胞数量及细胞碱性磷酸酶活性均明显高于注射式硫酸钙支架;扫描电镜发现两组材料上均有细胞生长,骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释支架上的细胞在支架表面和孔隙内生长良好,细胞突起接触融合,细胞密集区域可见细胞外基质形成,大量细胞包绕在材料表面;注射式硫酸钙支架上的细胞黏附数量较少,生长情况不及骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙缓释支架上的细胞。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:天然骨形态发生蛋白2在体内无法实现缓释、持续诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,如何获得内源性骨形态发生蛋白2蛋白是目前研究的热点.目的:探讨腺病毒介导人骨形态发生蛋白2转染兔骨髓间充质干细胞的成骨分化能力及其可能机制.方法:采用腺病毒介导人骨形态发生蛋白2基因转染第3代兔骨髓间充质干细胞,转染后48 h采用qR...     

活性短肽修饰纳米晶胶原基骨修复拔牙后剩余牙槽嵴

背景：各种原因导致的牙齿拔除后都会造成剩余牙槽嵴的吸收,导致颌骨骨量不足,不利于患者后期接受义齿和种植牙的修复治疗。 目的：通过建立大鼠拔牙后剩余牙槽嵴模型,观察纳米晶胶原基骨/活性肽P17-骨形态发生蛋白2对拔牙窝修复及牙槽嵴吸收的影响。 方法：将36只健康SD大鼠随机分为实验组、对照组和单纯材料组,均拔除右侧下颌中切牙,实验组在拔牙窝内即刻植入纳米晶胶原基骨/活性肽P17-骨形态发生蛋白2材料,对照组在拔牙窝内植入纳米晶胶原基骨/骨形态发生蛋白2材料,单纯材料组在拔牙窝内植入纳米晶胶原基骨材料。 结果与结论：①牙槽嵴的相对长度：术后2,4,8周,实验组与对照组均大于单纯材料组(P < 0.05),实验组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。②组织学观察结果：术后2,4,8周,实验组与对照组新生血管和新骨形成的速度和质量均优于单纯材料组。③新生骨面积占骨缺损面积的百分比：术后2,4,8周,各组随时间增长不断增加,实验组与对照组大于单纯材料组(P < 0.05),对照组大于实验组。表明纳米晶胶原基骨/活性肽P17-骨形态发生蛋白2具有良好的骨诱导能力,拔牙后即刻植入可促进拔牙创的愈合,延缓剩余牙槽嵴的吸收。     

Limited but heterogeneous osteogenic response of human bone marrow mesenchymal stem cells to bone morphogenetic protein-2 and serum

Although there are numerous reports describing the in vivo bone forming capability of recombinant human bone morphogenetic proteins-2 (rhBMP-2), studies have reported limited effects on human mesenchymal stem cells (hMSCs). However, the reasons for these discrepancies are not well understood. The aim of this study was to investigate the responsiveness of hMSCs to osteoinductive signals, focusing on rhBMP-2 and the effect of serum on that responsiveness. Human MSCs from six donors were analysed. When those cells were treated with osteoinduction medium including dexamethasone (Dex), alkaline phosphatase (ALP) activities increased in all cell lines. On the other hand, rhBMP-2-containing medium failed to increase ALP activity. When five different sera were used for cultivation and induction with rhBMP-2, ALP activities increased in two of them, but not in the others. The expression of BMP-2 antagonist noggin was induced in almost all combinations regardless of the responsiveness to rhBMP-2. On the other hand, the expression of follistatin showed significant variations depending on the serum and cell line. However, the expression did not correlate with the responsiveness to rhBMP-2. The results from this study showed limited but heterogeneous osteogenic response of hMSCs to rhBMP-2 and that the results are affected by the choice of serum. This fact should be concerned for the successful and effective clinical application of rhBMP-2.     

骨形成蛋白-7基因逆转录病毒载体的构建及其表达

目的：实现骨形成蛋白—7(BMP—7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法：构建重组BMP—7逆转录病毒表达载体。通过PT67包装细胞克隆，嘌呤霉素筛选、扩增，获得含BMF—7基因的逆转录病毒液，直接感染骨髓基质干细胞，用免疫组化方法检测BMP—7的表达。结果：成功地构建了重组BMP—7逆转录病毒表达载体，并可在骨髓基质干细胞中表达BMP—7。结论：重组逆转录病毒表达载体转染的靶细胞可表达BMP—7，为组织工程中骨和软骨种子细胞的研究奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞在骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙载体上的成骨

背景：将生长因子复合到支架上构建复合材料可同时具备骨诱导和骨传导作用。 目的：观察骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨的影响。 方法：取生长状态良好的第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞悬液,分3组培养：实验组将细胞悬液滴加到骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合材料表面,对照组在细胞悬液中加入骨形态发生蛋白2,空白对照组正常培养。 结果与结论：3组细胞随培养时间延长逐渐增多,实验组细胞数量最多,明显多于对照组及空白对照组(P < 0.05)。实验组培养不同时间点碱性磷酸酶活性高于对照组及空白对照组(P < 0.05)。体外实验显示骨形态发生蛋白2/注射式硫酸钙复合载体可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架与骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

文题释义： 3D打印技术：是通过计算机设计3D模型,按照某一坐标轴切成无限多个剖面,然后层层打印堆叠形成一个实体的立体模型,使用3D打印技术制备的骨组织工程支架能对支架的内部结构和外形进行自由可控的构建,在支架个性化、精确性、机械强度、孔隙调节、空间结构复杂性方面有独特优势。 纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合材料：羟基磷灰石是人体和动物骨骼的主要无机成分,具有良好的骨诱导性,纳米羟基磷灰石由于良好的生物相容性和骨整合能力被广泛用作骨缺损的修复材料;聚己内酯是一种已被FDA批准的生物材料,具有良好的机械性能、生物相容性及降解性。两种材料复合物的多孔结构能够为细胞生长、组织再生及血管化提供有利条件。 背景：聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合材料是在常用骨组织工程材料基础上结合3D打印技术制备的新型复合支架材料,目前对于该复合材料的体外生物相容性研究较少。 目的：通过体外实验探讨3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架材料的细胞相容性。 方法：利用3D打印技术分别制备聚己内酯及聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架,表征两组材料的微观结构、孔隙率及力学性能。将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于两组支架表面,CCK-8法检测细胞增殖率,扫描电镜和Live/Dead染色观察细胞在支架上的生长情况。 结果与结论：①两组支架均呈三维网状相互连通结构,纤维呈规律有序的排列、相互交错,纤维表面无空隙,纤维间距、直径较为均一;两组支架的孔隙率比较差异无显著性意义(P > 0.05);复合支架的弹性模量高于单纯聚己内酯支架(P < 0.05);②两组支架表面培养1 d的细胞增殖比较差异无显著性意义(P > 0.05),复合支架表面培养4,7 d的细胞增殖快于单纯聚己内酯支架(P < 0.05);③Live/Dead染色结果显示,两组材料均具有良好的细胞相容性,细胞活性较高,同时复合支架上的贴壁细胞更多一些;④扫描电镜显示,细胞在两种材料上生长形态良好,并紧密黏附于支架表面及微孔附近,同时可见分泌的细胞外基质呈丝状包绕于细胞周围;⑤结果表明,3D打印技术制备的聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架孔隙较丰富,具备良好的力学性能,细胞相容性良好,可作为骨组织工程的支架材料。 ORCID: 0000-0002-7083-6458(胡超然) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

骨髓间充质干细胞分离培养的研究进展

骨髓间充质干细胞具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能。随着对其细胞免疫学研究的深入 ,目前已建立了多种分离纯化并扩增的方法 ,为其在细胞工程和组织工程上的应用提供了基础     

3种组织来源的间充质干细胞体外成骨能力的比较

目的比较成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)、人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和人胎盘间充质干细胞(P-MSCs)的成骨能力。方法用含10%胎牛血清的DMEM/Ham's F-12培养液培养3种MSCs,CCK8法检测增殖能力,流式细胞仪鉴定3种细胞。碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色观察细胞经成骨诱导后成骨分化蛋白-ALP的分泌和矿化钙结节的沉积。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法检测MSCs骨再生相关基因的表达。Western blot方法检测MSCs成骨再生相关基因的蛋白表达。结果 MSCs在第3天进入对数增殖期。3种细胞的表面标志物阳性率:CD44、CD90和CD105均高于98%。3种MSCs成骨诱导9 d时,3种MSCs的实验组均表达大量成骨分化蛋白-ALP,成骨诱导18 d时3种MSCs均呈现较好的矿化能力;3种MSCs成骨诱导9 d时,实验组RUNX2和ALP基因显著性高表达(P0.05),成骨诱导18 d时,实验组RUNX2和骨钙素(OCN)亦显著性高表达(P0.05);3种MSCs成骨诱导9 d时,实验组均检测到RUNX2和ALP的蛋白表达;成骨诱导18 d时,实验组细胞亦检测到RUNX2和OCN的蛋白表达。结论 UC-MSCs和P-MSCs具有良好的成骨分化能力,有望作为骨组织工程的种子细胞用于治疗骨缺损。     

骨形态发生蛋白12诱导骨髓间充质干细胞构建组织工程肌腱

背景：以往肌腱损伤的修复方法有端端吻合、自体肌腱移植、同种异体肌腱或人工肌腱移植等,但均有其各自缺点。 目的：探讨以家兔骨髓间充质干细胞为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,聚羟基乙酸复合材料作为支架材料,预构组织工程化肌腱重建家兔跟腱缺损的可能性。 方法：家兔抽取股骨近端骨髓,分离所得细胞传代至第2代,加入10 μg/L骨形态发生蛋白12诱导分化,并与Ⅰ型胶原溶液按一定比例移植于预张的聚羟基乙酸缝线上预制组织工程化肌腱备用。将家兔制备成跟腱缺损模型,分别采用不同方法修复跟腱缺损：组织工程化肌腱修复,Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线修复,丝线行端端修复。修复12周对各组肌腱行形态学、力学及组织病理学观察。 结果与结论：修复12周家兔肌腱组织病理切片：组织工程化肌腱组可见大量梭形纤维母细胞顺应力学方向排列均匀分布于胶原中,纤维细胞明显增多,胶原致密;Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸缝线组可见部分纤维组织增生伴少许肉芽组织形成,胶原纤维呈松散网丝状,细胞排列紊乱分布不均;丝线组可见纤维组织旁见大量肉芽组织形成。修复12周家兔肌腱生物力学强度：骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度明显优于Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸组,与丝线缝合组差异无显著性意义;但骨形态发生蛋白12+聚羟基乙酸重建肌腱的力学强度低于正常肌腱。提示以自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞,骨形态发生蛋白12诱导,以聚羟基乙酸为支架,可望构建组织工程化肌腱。构建的组织工程肌腱具有一定的生物力学特性,能用于修复跟腱缺损。