受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)调控人结肠癌HT-29细胞程序性坏死的分子机制

 目的  研究受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)在人结肠HT-29细胞程序性坏死过程中的作用,并探讨E3泛素连接酶三重结构域包含蛋白16 (tripartite domain containing protein 16,Trim16)对其作用的潜在调控机制。方法  用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)建立HT-29细胞的程序性坏死模型,采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测其对凋亡、坏死细胞数目的影响。分别用Western blot和qRT-PCR检测RIPK1在细胞程序性坏死中的表达。构建稳定表达Flag标记的RIPK1的HT-29细胞株,采用Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现与RIPK1有相互作用的新蛋白。应用Ni-NTA pulldown试验检测筛选出的E3泛素连接酶对RIPK1泛素化的调控。结果  TNFα能够成功诱导HT-29细胞程序性坏死。HT-29细胞在TNFα和半胱天蛋白酶抑制剂z-VAD处理后,表现出RIPK1、RIPK3、混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)表达水平显著增加,并伴随着炎性因子白介素1α(IL1α)和白介素6(IL6)水平明显升高。Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现一个与RIPK1有相互作用的E3泛素连接酶Trim16,体外实验表明Trim16可以增强RIPK1的泛素化程度,其可能调节RIPK1在程序性坏死过程中的作用。结论  RIPK1在TNFα和z-VAD诱导人结肠癌HT-29细胞的程序性坏死过程中起重要作用,E3泛素连接酶Trim16对此过程可能有重要调控作用。     

程序性细胞坏死参与急慢性损伤脑内神经元死亡的研究进展

 程序性细胞坏死是一种新发现的细胞死亡形式。这类死亡细胞形态类似坏死,而其死亡过程受胞内主动机制的调节,由此改变了坏死细胞不受内在机制调控的经典概念。当细胞膜上死亡受体与其配体结合,细胞内凋亡因子caspase-8被抑制时,激活受体相互作用蛋白（receptor interaction protein,RIPK1/RIPK3）激酶及关键底物——混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL）的信号通路,从而触发细胞发生程序性细胞坏死。后者参与多种疾病的病理过程,如肿瘤、免疫炎症、神经退行性疾病、脑缺血损伤等。本文就程序性细胞坏死的信号通路、重要调控分子及在神经损伤相关疾病致病机制进行综述,并对研究方法和分析工具药物进行了归纳总结。     

RIPK1/RIPK3依赖的细胞程序性坏死在清除兼性胞内菌感染中的作用

程序性坏死是一种与炎症相关的细胞死亡模式,与依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶调控的凋亡不同,这种细胞死亡模式受受体互作蛋白激酶(RIPK)1和3调控。在兼性胞内菌感染过程中,宿主会运用多种策略使隐藏在细胞内的兼性胞内菌重新暴露于抗菌机制面前。许多研究报道表明宿主细胞的程序性坏死是其中一种重要的策略,有助于兼性胞内菌感染的清除。在本文中,我们将探讨在宿主细胞内发生的由RIPK1/RIPK3途径介导的程序性坏死机制,以及其在清除兼性胞内菌感染中的意义。     

RIPK1抑制糖皮质激素体外诱导的间充质干细胞凋亡

 目的  研究受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)抑制糖皮质激素(glucocorticoid,GC)体外诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的凋亡效果及其调控机制。方法    将SD大鼠来源的MSC,分为3组:GC+MSC组,GC+RIPK1-MSC组和生理盐水+MSC组(对照组)。通过形态学观察、MTT分析、AO/EB 染色、Hoechest 333342 染色、Live/Dead 染色、TUNEL凋亡检测及Western blot分析等方法确定抑制效果,并分析其中涉及的关键蛋白和信号通路。结果   GC诱导24 h后,MSC发生凋亡,并证实RIPK1可对抗这种凋亡。RIPK1上调伴随TRAF2/cIAP1/cFLIPL水平升高,其为对抗凋亡的关键蛋白通路。结论     RIPK1可抑制GC诱导的MSC凋亡,为早期阻遏股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)提供了新思路。     

抑制TNFR/RIPK信号通路对神经细胞凋亡的影响及机制研究

【摘要】 目的 研究抑制TNFR/RIPK信号通路对急性脊髓损伤（ASCI）大鼠神经细胞凋亡的影响及作用机制。方法 160只雄性SD大鼠,随机分为空白对照组、假手术组、模型组、Nec 1组,每组又根据时间点分为12h、24h、3d、7d四个亚组。采用动脉夹钳夹法制作ASCI模型,空白对照组不做任何处理,假手术组仅暴露脊髓,不损伤脊髓,模型组和Nec 1组用动脉瘤夹脊髓全横截面1min,缝合伤口。空白对照组、假手术组和模型组注射给予生理盐水,Nec 1组注射坏死性凋亡抑制剂Necrostain 1（Nec 1）溶液1μl/kg,1次/d,分别给药12h、24h、3d、7d。给药后以BBB评分对各组大鼠后肢神经功能恢复情况进行评分,完成评分后,取10只给药7d的大鼠脊髓,进行HE染色、Nissl染色、碘化丙啶（PI）染色、Tunel染色;另取10只给药7d的大鼠,取脊髓,用Western Blot检测RIP1、RIP3、Bcl 2蛋白表达情况。结果 模型组和Nec 1组各时间点的BBB评分均显著低于空白对照组和假手术组（P＜005）,Nec 1组各时间点的BBB评分显著高于模型组（P＜005）。造模7d后,模型组脊髓出现坏死、空洞现象,大量炎性细胞浸润,坏死区域面积显著高于假手术组（P＜005）;尼氏体呈细颗粒状,神经元数量减少、染色浅、排列无序,坏死性凋亡细胞较多;PI红染细胞、Tunel阳性细胞数、凋亡小体数量,以及RIPK1、RIPK3、Bcl 2蛋白表达水平显著多于假手术组（P＜005）。给予Nec 1治疗7d后,Nec 1组脊髓坏死组织较模型组少,空洞现象得到改善,炎性细胞浸润现象好转,Nec 1组坏死区域面积显著低于空白对照组和假手术组（P＜005）;尼氏体着色的神经元细胞染色较深,颗粒变粗,存活神经元数量显著高于模型组（P＜005）;PI红染细胞数、凋亡小体数,以及RIPK1、RIPK3蛋白表达水平显著少于模型组（P＜005）,Bcl 2蛋白表达水平显著高于模型组（P＜005）。结论 坏死性凋亡抑制剂Nec 1能通过抑制TNFR/RIPK信号通路,下调RIPK1、RIPK3、上调Bcl 2的表达来缩小ASCI损伤面积,缓解炎症浸润,减少损伤周围神经元数量,改善神经元功能,提高损伤神经元及胶质细胞存活率,改善大鼠BBB评分,抑制坏死性凋亡。     

胎球蛋白–A调控糖尿病肾病 足细胞损伤机制研究

目的 研究胎球蛋白–A（fetoglobulin–a,Fetuin–A）调控糖尿病肾病足细胞的损伤机制。方法 选取健康SD成年大鼠5只,获取大鼠肾小球基膜（glomerular basement membrane,GBM）足细胞,分为上调Fetuin–A组、下调Fetuin–A组。采用反转录–聚合酶链反应（real time polymerase chain reaction,RT–PCR）技术检测Fetuin–A、足细胞表达,观察细胞增殖、凋亡,免疫组化法检测肾组织肿瘤坏死因子–α（tumor necrosis factorα,TNF–α）、混合系列蛋白激酶结构域蛋白（mixed–lineage kinase domain–like protein,MLKL）、受体相互作用蛋白激酶1（receptor–interacting protein kinase 1,RIPK1）水平,蛋白质印迹（Western blot,WB）法检测Wilms瘤基因1（wilms,tumor gene 1,WT1）、特异蛋白1（specific protein 1,Sp1）表达水平。结果 与对照组比较,下调Fetuin–A组Fetuin–A、TNF–α、MLKL、RIPK1表达水平、细胞吸光度值、细胞凋亡率均较低,WT1、Sp1表达水平较高;上调Fetuin–A组Fetuin–A、TNF–α、MLKL、RIPK1表达水平、细胞吸光密度值、细胞凋亡率均较高,WT1、Sp1表达水平较低（P<0.05）;与下调Fetuin–A组比较,上调Fetuin–A组Fetuin–A、TNF–α、MLKL、RIPK1表达水平、细胞吸光度值、细胞凋亡率较高,WT1、Sp1表达水平较低（P<0.05）。结论 Fetuin–A靶向作用于Sp1抑制足细胞生长失常。     

炎症性肠病中的坏死性凋亡：一个潜在的治疗靶点（英文）

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)的发病率近年来呈快速上升趋势,目前尚无有效的方法防止其复发。程序性细胞死亡对维持内环境稳态至关重要。坏死性凋亡作为一种新发现的程序性细胞死亡方式,其在IBD中的作用值得探讨。坏死性凋亡由受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)、RIPK3和混合系激酶区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)介导,导致细胞肿胀、质膜破裂、细胞内容物流出,继而引起细胞死亡并促进炎症的发生。研究发现IBD患者病变标本的坏死性凋亡水平升高,在IBD动物模型中抑制坏死性凋亡能够减轻炎症程度,表明坏死性凋亡与IBD的发病机制相关。然而,由于细胞坏死性凋亡调控的复杂性及其相关信号分子功能的多样性,其具体机制仍未明确。坏死性凋亡在IBD的发病过程中可能发挥了重要的调控作用,为进一步探究IBD的治疗靶点提供了新的思路和方法。     

Notch1在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中的作用及机制

目的：探讨Notch1信号通过转化生长因子β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1）调控对乙酰氨基酚（acetyl-para-aminophenol,APAP）诱导的肝损伤（APAP induced liver injury,AILI）的作用机制。方法：髓系特异性 Notch1敲除（Notch1^M-KO）和对照floxed Notch1（Notch1^FL/FL）小鼠通过腹腔注射APAP构建AILI模型。留取小鼠血清标本,用全自动生化分析仪及酶联免疫反应分析法检测肝功能和细胞因子。留取小鼠肝组织标本,HE染色观察肝组织病理损伤情况,使用 Suzuki评分评估肝组织损伤程度,免疫印迹法检测TAK1、磷酸化TAK1（p-TAK1）、p65、磷酸化p65（p-p65）、Caspase-8（Casp-8）、 受体相互作用蛋白激酶 1（receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1）、磷酸化混合谱系激酶域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein,p-MLKL）的表达,免疫荧光染色观察CD11b、p-TAK1的表达及活性氧（reactive oxygen species ROS）水平。 结果：小鼠腹腔注射APAP后,肝脏病理提示肝细胞体积增大,窦道淤血,出现广泛的坏死。与Notch1^FL/FL对照组相比,Notch1^M-KO 小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）明显升高, 血清炎性因子水平上升,HE染色显示肝细胞体积增大更明显,伴大面积坏死及炎性细胞浸润,DCF探针检测显示原代肝细胞内ROS增加。肝组织p-TAK1表达增加,Casp-8的表达减少,RIPK1、p-MLKL表达增加。结论：在AILI中,髓系特异性Notch1敲除可活化TAK1,降低Casp-8水平,激活RIPK1-MLKL坏死性凋亡通路,加重肝损伤的发生。     

急性肺损伤的发病机制及丹参治疗研究进展

急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是指由严重感染、创伤等不同病因所致的肺泡毛细血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺间质的急性弥漫性损害,严重的ALI或ALI的最终严重阶段被定义为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。目前认为是多种效应细胞如中性粒细胞（PMN）、肺泡巨噬细胞、肺泡毛细血管内皮细胞等的活化及其释放的细胞因子和多种炎症介质在肺内形成的网络作用导致了肺泡-毛细血管膜损伤。     

丙酮酸乙酯对脓毒症急性肺损伤大鼠的 作用及其机制研究

目的 探讨丙酮酸乙酯（EP）对脓毒症急性肺损伤（ALI）大鼠的作用及其可能的作用机制。 方法 选取健康成年雄性SD 大鼠40 只,采用随机数字表法分为对照组、假手术组、ALI 组和EP 组,每组10 只。 ALI 组和EP 组采用盲肠结扎穿孔法复制大鼠脓毒症模型,假手术组仅翻动盲肠,不做结扎穿孔。EP 组术后 腹腔注射EP 溶液（40 mg/kg,间隔6 h）,对照组、假手术组和ALI 组腹腔注射等量乳酸林格液（间隔6 h）。 模型复制24 h 后心脏采血处死大鼠。酶联免疫吸附试验检测肺组织匀浆中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、 Toll 样受体4（TLR4）及核因子κB（NF-κB）的表达;计算肺组织湿干重比;HE 染色后光镜下观察肺组 织病理结构变化。结果 ALI 组、EP 组HMGB1、TLR4 及NF-κB 水平高于假手术组（P <0.05）,且EP 组 低于脓毒症ALI 组（P <0.05）;对照组与假手术组HMGB1、TLR4 及NF-κB 水平比较,差异无统计学意义 （P >0.05）。ALI 组、EP 组肺组织湿干重比高于假手术组（P <0.05）,且EP 组低于ALI 组（P <0.05）;对照 组与假手术组肺组织湿干重比比较,差异无统计学意义（P >0.05）。对照组和假手术组肺组织结构完整,肺泡 间隔无水肿、炎症;ALI 组肺泡结构破坏严重,肺泡间隔增宽,肺间质明显渗出、出血和大量炎症细胞浸润; EP 组肺泡结构较完整,与ALI 组相比,肺间质渗出、出血及炎症细胞浸润症状明显减轻。结论 EP 可能通过 抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路,减轻肺组织炎症反应,改善肺损伤程度从而对脓毒症ALI 发挥保护作用。     

程序性坏死：缺血再灌注损伤中的新靶点

程序性坏死是新发现的一种细胞死亡方式,在凋亡通路抑制条件下,死亡受体与配体结合可调控非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖的程序性细胞死亡,具备典型的坏死样形态学特征,可触发显著的炎症反应。含死亡域的受体相互作用蛋白激酶1/3在程序性坏死的调节中发挥特异性激酶作用,且可被坏死性抑制剂特异性抑制。程序性坏死在缺血再灌注损伤中的重要作用备受关注,研究已发现其在心、肾、脑组织及视网膜等缺血再灌注损伤中可作为细胞死亡的主要形式。     

中介素1-53对急性肺损伤大鼠SP-A及IL-18的影响

目的探讨脂多糖致急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液（BALF）中表面蛋A（pulmonary surfactant associated protein A,SP-A）浓度及肺组织单核巨噬细胞中白介素18（interleukin 18,IL-18）的表达水平及中介素1-53（intermedin 1-53．IMD1-53）的影响。方法 将36只雄性Vistar大鼠随机分为正常组（A组）、急性肺损伤组（B组）、中介素1-53干预组（C组）,于2h,4h分别测定血气分析,后处死大鼠,测定肺组织湿／干比（W／D）、ELISA法检测BALF中SP-A的浓度、免疫组化法检测肺单核巨噬细胞内IL-18表达及各时间点肺组织病理变化。结果 与A组比较,B组动脉血PO2和BALF中SP-A浓度降低显著（P〈0．05）,湿干比及单核巨噬细胞中IL-18表达增加（P〈0．05）,肺组织充血水肿明显。与C组相比,上述改变得以逆转,肺损伤程度明显减轻（P〈0．05）。结论中介素1-53可通过抑制SP-A的减少和IL-18的生成在急性肺损伤早期起到一定的保护作用。     

白介素17对急性肺损伤时肺水肿液清除的影响

目的 探讨白介素17(IL-17)对急性肺损伤(ALI)小鼠肺水清除的影响及可能机制.方法 IL-17基因敲除鼠和野生型C57BL/6鼠各16只,随机各等分为两组(一共4组,每组8只),分别经气道给与磷酸缓冲盐溶液和脂多糖(LPS)干预,给药48 h后处死.比较各组肺湿干质量比(W/D)、支气管肺泡灌洗液中白介素8(IL-8)水平和肺组织钠通道(ENaC)蛋白表达情况.并采用HE染色观察肺组织病理改变,免疫组化法了解肝激酶B1(LKB1)表达差异.结果 与接受LPS干预的野生型鼠比较,IL-17敲除型鼠在接受LPS处理后W/D由9.739±3.3降至5.351±0.56,IL-8由67.50±7.33 pg/mL降至41.00±3.16 pg/mL,差异有统计学意义.病检结果提示IL-17敲除型鼠肺泡腔内水肿液聚集减少,肺损伤评分显著降低.Western blotting和免疫组化结果示接受LPS刺激的IL-17敲除型鼠ENaC表达更多,LKB1丢失相对较少.结论 敲除IL-17不仅可以减轻ALI小鼠肺组织炎症程度,还可以减少ENaC蛋白丢失,促进肺水清除,其保护作用可能与LKB1有关.     

内毒素性急性肺损伤大鼠肺组织p38 mRNA及其蛋白质表达的变化

目的探讨内毒素性急性肺损伤 (ALI)大鼠肺组织p38mRNA及其磷酸化蛋白质表达的变化。方法静脉注射脂多糖 (LPS)复制大鼠ALI模型。分别采用原位分子杂交和蛋白质印迹方法检测肺组织 p38mRNA及其磷酸化蛋白质的表达 ,并观察肺组织病理学改变。结果正常大鼠肺组织有少量p38mRNA表达 ,可见于平滑肌细胞、内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞。静脉注射LPS 2小时能成功复制ALI模型 ,PaO2 显著下降 (p <0 .0 1) ,p38mRNA及其磷酸化蛋白质表达显著增加 ,分别为正常对照组的 2 .34和 2 .74倍 (p <0 .0 1)。通过直线相关分析发现 ,PaO2 与肺组织 p38mRNA和磷酸化p38MAPK表达之间分别呈显著负相关 (r=- 0 .6 5 2 ,- 0 .713,p均 <0 .0 1)。结论内毒素性肺损伤肺组织 p38mRNA及其磷酸化蛋白质的表达均上调 ,可能与ALI的病理生理过程有关。     

内毒素急性肺损伤与中性粒细胞凋亡研究现状

内毒素（endotoxin）是革兰阴性菌细胞壁的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）成分,细菌死后细胞壁崩解时释出。内毒素可诱导肺泡巨噬细胞和上皮细胞产生多种细胞因子、趋化因子和激活中性粒细胞（polymorphonucler neutrophil,PMN）并使其向损伤部位聚集,导致急性肺损伤（acute lung injury,ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respira-tory distress syndrome,ARDS）。现有资料表明PMN凋亡延迟在急性肺损伤的发生过程中起到重要作用,了解PMN凋亡调控有利于调节机体炎症反应,可为ALI开辟新的治疗路径。     

Involvement of the p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway in burns-induced lung injury

Acute lung injury (ALl) is a leading complicationin extensively burned patients, especially those with inhalation injury. It can cause hypoxia resulting in injury of remote organs and dysfunction.     

胰岛素通过mTORC2/SGK1途径上调肺泡上皮钠通道α亚基的作用机制

目的: 研究mTORC2/SGK1在胰岛素上调肺泡上皮钠通道α亚基(α-ENaC)中的作用,阐明胰岛素促进小鼠急性肺损伤(ALI)时肺水肿清除的机制。方法: C57BL/6J小鼠随机分为对照组、脂多糖(LPS)组、胰岛素组、PP242(mTORC1/2抑制剂)组和雷帕霉素(特异性mTORC1抑制剂)组,每组10只。经相应处理后分别留取标本检测小鼠肺湿/干质量比(W/D)、肺泡液体清除率(AFC),HE染色观察肺组织病理学变化,Western blotting法检测肺组织中α-ENaC表达水平及pSGK1(Ser422)磷酸化水平。结果: 与LPS组比较,胰岛素组小鼠肺组织病理评分、肺W/D明显降低(P<0.05),AFC明显增加(P<0.05)。与对照组比较,LPS组小鼠肺组织中α-ENaC蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与LPS组比较,胰岛素组小鼠肺组织中α-ENaC蛋白表达水平和pSGK1(Ser422)磷酸化水平明显升高(P<0.05);与胰岛素组比较,PP242组小鼠肺组织中α-ENaC蛋白表达和pSGK1(Ser422)磷酸化水平明显降低(P<0.05)。结论: 胰岛素通过mTORC2途径激活SGK1,上调α-ENaC表达,促进肺泡液体清除,对ALI/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的预后有一定的改善作用。     

急性肺损伤新生大鼠肺表面活性蛋白A变化的研究

目的:探讨肺表面活性物质蛋白A(SP-A)在急性肺损伤(ALI)/ARDS发病机制中的作用及其在ALI早期诊断中的意义。方法:采用内毒素(LPS)腹腔注射的方法复制新生大鼠ALI模型,应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清、BALF中的SP-A水平。结果:ALI组血清SP-A水平在1h已明显高于对照组(P<0.05),8h时达高峰值,之后虽略有下降,但仍明显高于对照组(P<0.05);ALI各组BALF中的SP-A水平与对照组相比,有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05)。结论:ALI新生大鼠SP-A的变化,可导致PS各组分比例的改变,在ALI发病机制中发挥重要作用;ALI发病初期,血清SP-A水平即可出现显著升高,反映了肺泡上皮细胞的损伤和肺毛细血管通透性的增高。因此,检测血清SP-A水平可作为ALI早期诊断的指标。