慢性阻塞性肺疾病激素不敏感与糖皮质激素受体核内转移的相关性

 目的  研究慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD)对糖皮质激素不敏感是否与糖皮质激素受体 (glucocorticoids receptor,GRα)的核内转移有关。方法  将来自12例健康人、15例轻中度哮喘患者和15例COPD患者的人外周血单个核细胞 (peripheral blood molecule cells,PBMC)进行体外培养。ELISA方法检测其IL-8蛋白质水平,并计算地塞米松 (Dex)半抑制浓度。PBMC在Dex中培养0.5~6 h,通过Western blot检测GRα蛋白质水平,GRα的核内转移则通过免疫荧光和共聚焦显微镜来观测和分析评估。结果  COPD患者PBMC较轻中度哮喘患者和健康志愿者对Dex相对不敏感。Dex半抑制率 (IC50Dex)与糖皮质激素受体GRα核内转移呈负相关 (r=-0.54,P=0.000 8)。Dex可诱导增加各组PBMC中的总GRα,但GRα胞内分布各组间存在差异。Dex可明显增加健康人及哮喘患者核内的GRα,但并未增加COPD患者核内GRα。健康人及哮喘患者的PBMC中,Dex预处理能显著抑制TNF-α诱导的IL-8分泌,而在COPD患者的PBMC中这种抑制作用不明显。结论  COPD对糖皮质激素的不敏感与GRα核内转移有关。GRα核内转移受抑制可能是造成糖皮质激素在COPD患者中发挥抑制炎性作用欠佳的原因之一。     

激素抵抗型哮喘发病机制的研究进展

 激素抵抗型哮喘治疗困难，一直是哮喘研究的重点和难点。研究发现糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）异常、组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase，HDAC2）活性降低等经典机制在激素抵抗型哮喘发病中起重要作用。此外，Th细胞免疫失衡、感染、肥胖及非编码RNA、细胞自噬等因素在激素抵抗型哮喘中的作用也是近年研究的热点。本文对以上激素抵抗型哮喘发病机制的研究进展予以综述，以提高对激素抵抗型哮喘的认识，为未来的治疗提供方向。     

大鼠肺泡巨噬细胞Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1表达变化及其调节糖皮质激素受体功能的研究

目的：在模拟大鼠肺泡巨噬细胞炎症合并糖皮质激素治疗的条件下，阐明Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1（BAG-1）的表达变化及其对糖皮质激素受体（GR）功能的调节作用。方法：Western blot检测脂多糖（LPS）和地塞米松（Dex）作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1表达变化；免疫共沉淀法检测核蛋白中BAG-1与GR相互结合作用；相对荧光素酶法检测GR转录激活活性。结果：LPS和Dex作用后，细胞总蛋白中BAG-1L表达增加，BAG-1S表达无变化；核蛋白中只能检测到BAG-1L，表达量在LPS作用24h内逐渐增加；细胞核内BAG-1L与GR在LPS和Dex作用后存在着相互结合，同时GR转录激活活性逐渐降低，其变化与核蛋白中BAG-1L表达变化呈负相关。结论：LPS和Dex作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1L表达增加，与GR结合后共同转核，并抑制GR活性。该机制可能是感染条件下糖皮质激素抵抗的重要因素。     

糖皮质激素对人卵巢癌细胞系3AO细胞细胞外信号调节酶1和2活性的影响

目的 观察糖皮质激素对人卵巢癌细胞系3AO细胞中丝裂原激活的蛋白激酶家族成员细胞外信号调节酶(ERK)1和2活性,以及ERKI/2抑制剂PD98089对3AO细胞增殖的影响.方法 采用Western印迹法检测地塞米松(Dex)作用前后及未经药物处理(对照)组的ERKI和2蛋白活性,细胞增殖通过细胞计数完成.结果 Dex(1X10-7mol/L)处理3AO细胞5 min即出现ERK1和ERK2磷酸化程度降低.且两者呈同步变化;随着时间延长,ERK1和ERK2磷酸化程度明显降低,4 h时分别为处理前的26%和15%,具有时间依赖性;同时具有浓度抑制性,其中最大抑制出现在浓度为1X10-6 mol/L时,抑制率为85%;糖皮质激素受体(GR)拮抗剂RU486不能逆转这些效应.应用ERKI/2抑制剂PD98059处理3AO细胞,能够显著抑制细胞增殖,抑制程度与Dex组相同;而PD98059与Dex合用时可以增强两者单独应用时的抑制效应.结论 Dex能够以不依赖GR的方式,快速抑制ERK蛋白活性,ERK信号通路可能参与抑制细胞增殖的过程.     

激活蛋白-1对香烟烟雾提取物诱导气道 黏蛋白5AC基因表达的调控作用

目的：了解激活蛋白-1（AP-1）参与调控香烟烟雾诱导的气道黏蛋白（MUC）5AC表达的作用机制,探讨此过程中AP-1活化的可能信号途径。 方法：体外培养人气道上皮细胞BEAS-2B,给予香烟烟雾提取物（CSE）刺激,干预实验用c-Jun 的显性负性突变体TAM67转染细胞阻断AP-1的DNA结合活性;用SP600125和PD98059预处理分别阻断c-Jun氨基端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（ERK）的活性。以ELISA法检测MUC5AC蛋白含量,Western印迹检测磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化ERK（ p-ERK）和磷酸化P38（ p-P38）含量,RT-PCR检测MUC5AC mRNA 表达水平, EMSA测定AP-1的 DNA结合活性。 结果：CSE（1 g/L）刺激后MUC5AC mRNA表达水平和蛋白含量明显高于对照组（均P＜0.01）,AP-1 的DNA结合活性也明显强于对照组（P＜0.01）,伴随p-ERK和p-JNK蛋白含量显著增加,与对照组相比,差异有统计学意义（均P＜0.01）,而P38含量无明显变化(P＞0.05);与CSE组相比,TAM67转染细胞后MUC5AC mRNA表达水平和蛋白含量均显著降低 (P＜0.01);与CSE组相比,用SP600125或PD98059处理细胞后可明显抑制AP-1的 DNA结合活性 (均P＜0.05),并下调MUC5AC蛋白含量和mRNA的表达（均P＜0.05）。 结论：AP-1参与调控CSE诱导的气道MUC5AC基因表达的过程,此过程是由JNK和ERK信号转导通路激活AP-1,再由AP-1与MUC5AC启动子上AP-1 DNA反应元件结合后在转录水平上调MUC5AC的表达而实现的。     

腺苷、白介素—1及茶碱对哮喘患者外周血单核细胞A2腺苷受体mRNA表达的影响

目的 通过研究腺苷、白介素（IL）－1、茶碱对哮喘患者外周血单个核细胞（PBMCs)表达A2a及A2b腺苷受体（A2aAR及A2bAR)mRNA的影响,探讨A2aAR及A2bAR在哮喘发病中的作用,为临床使用茶碱提供理论依据。方法 11例正常人及哮喘患者PBMCs经Ficoll液分离,分对照组,腺苷组、腺苷＋IL－1组及腺苷＋茶碱4组,体外培养18小时,收集细胞,采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法和图象分析半定量法检测A2aAR及A2bAR mRNA表达。结果 正常人及哮喘患者各组PBMCs表达A2aARmRNA无明显差异（P＞0．05）。哮喘患者PBMCsA2bAR mRNA表达较正常人增加（P＜0．01）,腺苷、IL－1促进哮喘患者（P＜0．01）。腺苷及IL－1对哮喘患者PBMCsA2bAR mRNA表达的影响与血清TIgE水平呈正相关（P＜0．05）,与FEV1％呈负相关P＜0．05）。结论 PBMCs A2bARmRNA表达的影响与血清TIgE水平呈正相关（P＜0．05）,与FEV1％呈负相关P＜0．05）。结论 哮喘患者PBMCs表达A2bmRNA增加,腺苷及IL－1促进其表达,且与患者机体过敏状态及气道阻塞程度相关,茶碱能抑制A2bAR mRNA表达;腺苷、IL－1及茶碱对PBMCs表达A2aAR mRNA无明显影响。     

慢性HBV感染者外周血单个核细胞中miR-194-5p和MagT1表达水平检测及其意义

目的：检测慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者外周血单个核细胞（PBMCs）中miR-194-5p和镁离子（Mg²⁺）转运蛋白1（MagT1）表达水平,阐明其可能的临床意义。方法：收集40例健康体检者（健康对照组）、40例HBV携带者（HBV携带组）、40例轻中度慢性乙型肝炎（轻中度CHB组）和40例重度慢性乙型肝炎（重度CHB组）患者的临床资料。采集各组研究对象外周血并利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs,采用RT-PCR法检测各组研究对象PBMCs中miR-194-5p及MagT1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组研究对象PBMCs中MagT1蛋白表达水平,检测各组研究对象外周血和PBMCs中Mg⁺水平,流式细胞术检测各组研究对象PBMCs中CD8+T淋巴细胞表面分子程序性死亡受体1（PD-1）和自然杀伤细胞受体2群D分子（NKG2D）表达水平。在293T细胞中分别转染miR-194-5p mimic质粒（miR-194-5p mimic组）和miR-NC质粒（miR-NC组）,应用双荧光素酶报告基因实验检测2组293T细胞中荧光素酶活性。结果：与健康对照组比较,HBV携带组、轻中度CHB组和重度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg²⁺水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平均明显降低（P<0.05）,miR-194-5p mRNA及CD8+T淋巴细胞表面分子PD-1表达水平升高（P<0.05）。与HBV携带组和轻中度CHB组比较,重度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg²⁺水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平均降低（P<0.05）,miR-194-5p mRNA及CD8+T细胞表面分子PD-1表达水平降低（P<0.05）。与HBV携带组比较,轻中度CHB组患者PBMCs中MagT1 mRNA和蛋白表达水平、Mg²⁺水平及CD8+T淋巴细胞表面分子NKG2D表达水平降低（P<0.05）,miR-194-5p mRNA及CD8+T淋巴细胞表面分子PD-1表达水平升高（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验,MagT1是miR-194-5p靶基因。结论：miR-194-5p可能通过靶向下调MagT1表达,引起MagT1介导的Mg²⁺内流障碍,造成CD8+T淋巴细胞免疫活性降低,导致乙型肝炎慢性发展。     

人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中糖皮质激素受体的表达及其调节

目的研究地塞米松(Dex)在MCF-7细胞中是否具有糖皮质激素受体(GR)的表达,以及Dex对其受体表达的调节。方法采用氨基安替比林法测定GR拮抗剂(RU486)作用MCF-7细胞后能否阻断糖皮质激素的效应,采用放射配体结合分析法检测MCF-7细胞中GR的表达及Dex对其调节作用。结果 RU486可完全阻断Dex对MCF-7细胞活性的诱导作用;在细胞中存在高亲和力、低容量GR;Dex明显降低GR结合活性,且具有时间、剂量依赖性。结论在MCF-7细胞中存在GR,Dex调节MCF-7细胞增殖分化的作用通过 GR介导,Dex对MCF-7细胞GR的结合活性具有向下调节作用,且呈时间、剂量依赖性。     

红霉素对哮喘大鼠外周血单个核细胞磷酸化JNK表达的影响

目的：探讨哮喘大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）JNK磷酸化表达的变化及红霉素对其影响。方法：分离培养正常对照组、哮喘组、红霉素处理组大鼠的PBMCs。分别采用ELISA方法检测细胞上清液中IL-4,IL-5浓度,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western Bloting技术检测PBMCs JNKmRNA、磷酸化JNK的表达。结果：哮喘组PBMCs JNK磷酸化蛋白、mRNA表达水平及细胞上清液中IL-4,IL-5的浓度较正常对照组显著升高（P＆lt;0.05）,红霉素处理组JNK mRNA、磷酸化蛋白表达水平及细胞上清液中IL-4,IL-5的浓度较哮喘组显著降低（P＆lt;0.05）。通过直线相关分析发现,PBMCs JNK磷酸化蛋白与细胞上清液中IL-4,IL-5的表达水平之间均呈显著正相关（r分别为0.74和0.66,P均＆lt;0.05）。结论：JNK可能参与支气管哮喘的病理生理过程。红霉素可能通过作用于JNK这一靶点发挥其抗炎效应。     

慢性阻塞性肺疾病患者转录因子、糖皮质激素受体的表达

目的：探讨慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者转录因子活化蛋白-1（AP-1）、核因子-κB（NF-κB）、糖皮质激素受体（GR）的表达水平及不同治疗后的变化。方法：36例COPD急性发作期患者随机分为激素治疗组（18例）与非激素治疗组（18例）,18例健康者为对照组;激素治疗组给予续贯的糖皮质激素治疗及常规治疗,非激素治疗组给予除激素之外的常规治疗,用荧光定量RT-PCR方法测定外周血单核细胞c-jun（代表AP-1）、核转录因子κB（NF-κB）、糖皮质激素受体（GR-α和GR-β）mRNA的表达水平。结果：COPD患者c-jun、NF-κB表达水平始终高于健康对照组;治疗后与治疗前相比,激素治疗组c-jun和NF-κB显著下降,非激素治疗组NF-κB有显著下降,c-jun有下降趋势,但差异无统计学意义。治疗前COPD患者GR-α表达水平显著低于健康对照组,GR-β表达水平显著高于健康对照组;治疗后COPD患者GR-α表达水平较治疗前升高,GR-β表达水平较治疗前下降。激素治疗组治疗前C-jun、NF-κB、GR-α、GR-β分别为0.093±0.047、0.122±0.062、0.062±0.035、0.102±0.026;非激素治疗组分别为0.094±0.053、0.123±0.045、0.065±0.034、0.095±0.031;两组比较,差异无统计学意义,P〉0.05;激素治疗组治疗3个月时C-jun为0.054±0.024,非激素治疗组治疗3个月时C-jun为0.076±0.015,两组比较差异有统计学意义,P〈0.05。结论：COPD患者c-jun、NF-κB、GR-α和GR-β的表达量与健康者存在差异,这可能是COPD炎症反应的基础,这些可能成为治疗COPD炎症反应的新靶向。     

腺苷、白介素-1及茶碱对哮喘患者外周血单核细胞A2腺苷受体mRNA表达的影响

目的通过研究腺苷、白介素(IL)-1、茶碱对哮喘患者外周血单个核细胞(PBMCs)表达A2a及A2b腺苷受体(A2aAR及A2bAR)mRNA的影响,探讨A2aAR及A2bAR在哮喘发病中的作用,为临床使用茶碱提供理论依据。方法11例正常人及哮喘患者PBMCs经Ficoll液分离,分对照组、腺苷组、腺苷+IL-1组及腺苷+茶碱4组,体外培养18小时,收集细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和图象分析半定量法检测A2aAR及A2bARmRNA表达。结果正常人及哮喘患者各组PBMCs表达A2aARmRNA无明显差异(P>0.05)。哮喘患者PBMCsA2bARmRNA表达较正常人增加(P<0.01);腺苷、IL-1促进哮喘患者PBMCs表达A2bARmRNA(P<0.05);茶碱对正常人及哮喘患者PBMCs表达A2bARmRNA均有抑制作用(P<0.01)。腺苷及IL-1对哮喘患者PBMCsA2bARmRNA表达的影响与血清TIgE水平呈正相关(P<0.05),与FEV1%呈负相关P<0.05)。结论哮喘患者PBMCs表达A2bARmRNA增加,腺苷及IL-1促进其表达,且与患者机体过敏状态及气道阻塞程度相关,茶碱能抑制A2bARmRNA表达;腺苷、IL-1及茶碱对PBMCs表达A2aARmRNA无明显影响。     

肝肾不足型重型斑秃患者血皮质醇及糖皮质激素受体mRNA的表达状况

目的探讨肝肾不足型重型斑秃患者血皮质醇、外周血单个核细胞(PBMC)中糖皮质激素受体mRNA(GRmRNA)表达状况与斑秃发病关系。方法采用化学发光法检测23例肝肾不足型重型斑秃患者血皮质醇表达水平,并用逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应分别检测该23例患者应用糖皮质激素(GC)治疗前后PBMC中GRmRNA表达水平,并与20例正常对照组相对比。结果重型斑秃组与正常对照组两组血清皮质醇水平差异无统计学意义(P>0.05),重型斑秃组治疗前、后GRmRNA表达水平均低于正常对照组(P<0.05),并且治疗后GRmRNA表达水平比治疗前更低(P<0.01)。结论重型斑秃患者存在GC-GR紊乱,GRmRNA表达水平降低可能参与了重型斑秃的发病机制。肝肾不足型重型斑秃患者PBMC中GR mRNA表达水平显著低于正常对照组,这可能是重型斑秃肝肾不足证型在受体及基因水平上的病理变化,也可能是重型斑秃肝肾不足证型的微观本质之一。     

参麦对哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体的影响

目的 观察参麦对哮喘大鼠的治疗作用以及对肺组织中糖皮质激素受体(GR)表达的影响.方法 30只SD大鼠随机分为对照组、哮喘组、激素组、参麦低剂量组、参麦高剂量组,每组6只.除对照组外,各组大鼠以卵蛋白致敏并诱发哮喘.哮喘组注射0.9%生理盐水2 mL激素组注射地塞米松0.5 mg/kg,参麦组注射地塞米松0.5 mg/kg加参麦注射液(低剂量组1 mL,高剂量组2 mL),用药14 d.比较各组肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞比例(Eos%)和细胞因子水平[白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)],用qRT-PCR检测肺组织中的GR mRNA,用Western blot印迹法检测肺组织中GR蛋白的表达.结果 哮喘组BALF中Eos%显著高于对照组、激素组、参麦高、低剂量组(P<0.001).参麦高剂量组BALF中Eos%显著低于激素组(P<0.05).哮喘组BALF中IFN-γ低于对照组、激素组、参麦高、低剂量组(P<0.01),IL-4高于对照组、激素组、参麦高、低剂量组(P<0.05).参麦高剂量组BALF中IFN-γ高于激素组(P<0.05),IL-4低于激素组(P<0.05).激素组肺组织GR mRNA表达低于对照组(P<0.05),参麦高剂量组肺组织中GR mRNA表达高于激素组(P<0.05).参麦高剂量组肺组织中GR蛋白表达显著高于哮喘组和激素组(P<0.05).结论 参麦能上调哮喘大鼠肺组织中的GR mRNA和GR蛋白的水平,这可能是参麦治疗哮喘的主要机制.     

Increased hsp70 of glucocorticoid receptor complex induced by scald and heat stress and its possible effect on the affinity of glucocorticoid receptor

Background Glucocorticoid (GC) insensitivity/GC resistance is an important etiological and prognostic factor in multiple diseases and pathophysiological processes such as scald, shock and asthma. The function of GC was mediated by glucocorticoid receptor (GR). Scald not only decreased the expression of GR but also reduced the affinity of GR, which played an important role in GC resistance in scalded rats. Whereas the molecular mechanism responsible for the decrease of GR affinity resulted from scald remains unclear. Recent studies showed that the changes of heat shock proteins (hsp) especially hsp90 and hsp70 of GR heterocomplex were associated with GR low affinity in vitro. Methods The affinity of GR in hepatic cytosols and in the cytosols of SMMC-7721 cells were determined by radioligand binding assay and scatchard plot. GR heterocomplex in cytosols were captured by coimmunoprecipation and the levels of hsp90 and hsp70 of GR complex were detected by quantitative Western blotting.Results Similar with that of hepatic cytosol of scalded rats, a remarkable decrease of GR affinity was also found in the cytosol of heat stressed SMMC-7721 cells. The level of hsp70 of GR complex in hepatic cytosol of scalded rats (30% total body surface area immersion scald) and in cytosol of heat stressed human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 were both increased by 1.5 fold, whereas no change of hsp90 in GR heterocomplex was found. According to the correlation analysis, there may be a positive relationship between increased hsp70 of GR complex and decreased GR affinity in the cytosols.Conclusions The primary results indicated that the level of hsp70 of GR heterocomplex was increased in the hepatic cytosol of scalded rats and the cytosol of heat stressed SMMC-7721 cells. The increase of hsp70 of GR complex might be associated with the decrease of GR affinity.