环介导等温扩增技术在诊断结核病中的研究进展

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是利用两对特殊设计的引物和链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下对目的片段进行特异、高效扩增的技术。LAMP技术具有简单、快速、特异、灵敏、经济等优点,因此在结核分枝杆菌的现场快速检测和基层应用中具有广阔前景。基于此,本文主要阐述了LAMP 技术的基本原理和特点、诊断结核病的主要分子标志物,以及利用不同的分子标志物和各种类型的新型技术在诊断肺结核、肺外结核、耐药性结核病中的应用。LAMP 技术在诊断结核病中已经得到了广泛的应用,且具有较高的灵敏性和特异性,但该技术仍存在部分缺陷。本文综述了近年来LAMP 技术在结核病中的应用进展,并对其发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为结核病的快速诊断提供合理的研究方向。     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增法（LAMP）是一种新的核酸扩增法.该方法在一定温度下一步即可完成扩增反应.由于其扩增效率极高、反应简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点,LAMP法已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断.本文介绍了LAMP方法的原理及其在微生物分子检测方面的应用.     

寄生虫病环介导等温扩增技术研究进展

<正>寄生虫病在人类传染病中有着非常重要的影响。及时有效的寄生虫病诊断是疾病防治的首要环节。寄生虫病检测手段有病原学、免疫学和分子生物学等。病原学检查是常用的确诊方法,但易导致漏诊或误诊。免疫学检测在敏感性、特异性方面比病原学法有所提高,但却存在交叉反应、不能区分现症患者或既往感染等问题。分子生物学方法在寄生虫病检测中敏感性和特异性比前两者更高,同时也存在着一些不足,如操作繁琐、仪器昂贵、扩增耗时     

环介导等温核酸扩增检测缓冲液成分的探索

目的 探索环介导等温扩增(LAMP)检测反应体系缓冲液,为我国野战/灾害等紧急输血的血液筛查提供技术支持.方法 通过对LAMP体系不同组分的梯度分析对检测结果的影响进行研究.结果 扩增效率随着反应体系内Mg2+浓度的增高而降低;LAMP反应的扩增效率随着反应体系内Betain浓度的增高而增高.随着Calcein浓度的降低,LAMP反应体系内的绿色荧光逐渐减弱.结论 建立的反应体系具有较好的反应灵敏度及特异性,与成品化的试剂相似,可适用于临床血液病原体筛查.     

环介导等温扩增技术的研究进展

<正>随着检验医学的发展,一些分子生物学技术,如PCR[1]、链置换扩增(strand displacement amplifica-tion,SDA)[2]、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)及再生式序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction,3SR)[3]、等,在医学检验与诊断方面发挥了重要的作用。     

环介导等温扩增技术诊断疟疾准确性的meta分析

目的 通过对环介导等温扩增技术(LAMP)诊断疟原虫准确性的meta分析,探索产生诊断不稳定的原因,评价诊断效果.方法 检索中外数据库中以镜检为金标准的LAMP诊断实验,用Cochrane提供的QUADAS量表进行质量评价,用RevMan5.3做诊断meta分析,通过Meta-Disc1.4软件进行异质性检验和评价.结...     

环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养在涂阴肺结核中的诊断价值

目的探讨环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification metliod,LAMP,新型的核酸扩增技术)联合结核分枝杆菌快速培养(BACTEC MGIT 960,结核分枝杆菌检测仪)在痰涂片阴性肺结核中的诊断价值。方法收集疑似肺结核患者90例,随机分成A、B、C组,A组通过指南推荐涂阴肺结核诊断,B组通过LAMP确诊,C组通过LAMP联合BACTEC MGIT 960确诊,并给予抗结核治疗2个月后随访所有入组患者胸部CT变化情况,分别比较涂阴肺结核诊断方法、LAMP及LAMP联合BACTEC MGIT 960的诊断可靠性。结果涂阴肺结核指南推荐诊断阳性率40.0%,LAMP阳性率53.3%、联合检测阳性率60.0%,差异无统计学意义。联合检测敏感性88.9%,特异性91.7%均明显升高。结论在实际临床中,环介导等温扩增技术联合结核分枝杆菌快速培养(BACTEC MGIT 960)在痰涂片阴性肺结核诊断中特异性及敏感性高。     

环介导等温扩增技术在寄生虫分子诊断、检测中的应用

环介导等温扩增技术应用4条不同的引物特异地识别目标基因上的6段区域,在一个恒温的环境中进行链置换反应,是一种简单、快速、特异、敏感并且低成本的对已知基因的检测方法.本文就环介导等温扩增技术的原理及其在寄生虫分子诊断和检测中的应用作一综述.     

环介导等温扩增技术在寄生虫检测中的应用研究

随着分子生物学技术的快速发展,以检测核酸为基础的分子生物学技术如PCR、再生式序列复制以及链置换扩增技术等广泛应用于医学和生物学等领域,在病原体的检测以及疾病诊断方面发挥着重     

环介导等温扩增技术对结核分枝杆菌检测的临床应用价值

目的评估环介导等温扩增技术(LAMP)对肺结核的诊断价值。方法回顾性分析2017年4月至2018年9月郑州大学第一附属医院进行LAMP检测的413例患者,其中LAMP检测标本情况为肺泡灌洗液266例、痰标本147例。根据临床诊断情况将患者分为肺结核病组和非肺结核病组。将患者抗结核治疗前的LAMP结果与最终临床诊断及痰涂片结果进行比较,评价其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比。应用χ~2检验对肺结核患者肺泡灌洗液及痰标本的阳性率差异进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果 413例中119例(28.8%)为临床诊断的肺结核病患者,其中65例LAMP阳性,LAMP的综合敏感度为54.6%(65/119)。294例(71.2%)为非肺结核病患者,其中276例LAMP检测结果为阴性,特异度为93.9%(276/294),阳性预测值为78.3%(65/83),阴性预测值为83.6%(276/330),阳性似然比为11.42,阴性似然比为0.32。LAMP在痰涂片阳性标本中的敏感度为95.2%,在痰涂片阴性标本中的敏感度为45.9%,特异度为93.9%。在临床诊断肺结核患者中肺泡灌洗液标本和痰标本中LAMP的阳性率分别为63.2%(48/76)和39.5%(17/43)(χ~2=6.183,P<0.05)。结论 LAMP检测痰标本和肺泡灌洗液标本中的结核分枝杆菌用于结核病诊断具有良好的特异度。在临床诊断的肺结核患者中,LAMP对肺泡灌洗液标本检出的阳性率高于痰标本。     

霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌.方法 针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法.通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性.结果 活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×10~2 cfu/ml.在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×10~3 cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×10~4 cfu/ml.检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%.结论 建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查.

Abstract：

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Method Based on the ompW nucleic sequence of Vibrio cholerae, a pair of primers was designed for LAMP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of LAMP were tested using 47 baterial strains and simulated contaminated sites. Results The results of viable bacterium count showed that LAMP was capable of detecting Vibrio cholerae at a level as low as 1.6×10~2 cfu/ml. The minimal detectable concentration was 1.6×10~3 cfu/ml for simulated contaminated samples such as feces and seawater, and 1.6×10~4 cfu/ml for contaminated milk. All the 21 strains of Vibrio cholerae yielded positive results in LAMP, and the 26 strains of other bacteria all showed negative results, with a detection specificity of 100%. Conclusion The established LAMP method has high specificity and sensitivity for detecting Vibrio cholerae and is applicable in field monitoring and epidemiological study of Vibrio cholerae.     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法(LAMP)并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA(Pv-rDNA)的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当(χ2=0.34,P>0.05);特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义(χ2=9.67,P<0.05)。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for diagnosis of dengue

Background

Dengue is an emerging public health problem causing serious morbidity and mortality in tropical developing countries. Early, sensitive and specific diagnosis is paramount for clinical decision making. Currently available diagnostic tests are limited in scope and utility. This study highlights applicability of RT-LAMP in dengue diagnosis.

Methods

100 dengue confirmed cases, 100 dengue negative cases and 79 healthy negative controls from dengue epidemic between Sep 2009 to Jul 2011 were included. Dengue cases were profiled using WHO guidelines 2006, haematological and biochemical parameters evaluated and diagnosed using NS1 antigen, IgM and IgG enzyme immunoassay, RT-PCR and RT-LAMP. Positive cases were serotyped, genotyped and various tests were compared.

Results

Mean haematocrit, PT, PTT, platelet count, activated lymphocytes, serum fibrinogen, transaminases, bilirubin, lactate dehydrogenase, protein and sodium were significantly elevated in DHF/DSS as compared to DF. NS1 antigen, RT-PCR and RT-LAMP were sensitive during 1–3 days while μ-capture IgM EIA was specific after 5–7 days of initial infection. DEN-1 genotype III was predominant.

Conclusion

Deranged haematocrit and liver function tests are indicators of the severity of the disease. RT-LAMP is rapid, cost effective, highly sensitive and specific qualitative and quantitative technique which can detect dengue infection in both early and intermediary stages when NS1 antigen titres are not in the detectable range and the IgM antibody titres have just started to rise. Its superiority over existing techniques, amenability for automation and promising utility in low resource healthcare setups and field conditions raise it as the new gold standard for dengue diagnosis.     

Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for diagnosis of dengue

Background

Dengue is an emerging public health problem causing serious morbidity and mortality in tropical developing countries. Early, sensitive and specific diagnosis is paramount for clinical decision making. Currently available diagnostic tests are limited in scope and utility. This study highlights applicability of RT-LAMP in dengue diagnosis.

Methods

100 dengue confirmed cases, 100 dengue negative cases and 79 healthy negative controls from dengue epidemic between Sep 2009 to Jul 2011 were included. Dengue cases were profiled using WHO guidelines 2006, haematological and biochemical parameters evaluated and diagnosed using NS1 antigen, IgM and IgG enzyme immunoassay, RT-PCR and RT-LAMP. Positive cases were serotyped, genotyped and various tests were compared.

Results

Mean haematocrit, PT, PTT, platelet count, activated lymphocytes, serum fibrinogen, transaminases, bilirubin, lactate dehydrogenase, protein and sodium were significantly elevated in DHF/DSS as compared to DF. NS1 antigen, RT-PCR and RT-LAMP were sensitive during 1–3 days while μ-capture IgM EIA was specific after 5–7 days of initial infection. DEN-1 genotype III was predominant.

Conclusion

Deranged haematocrit and liver function tests are indicators of the severity of the disease. RT-LAMP is rapid, cost effective, highly sensitive and specific qualitative and quantitative technique which can detect dengue infection in both early and intermediary stages when NS1 antigen titres are not in the detectable range and the IgM antibody titres have just started to rise. Its superiority over existing techniques, amenability for automation and promising utility in low resource healthcare setups and field conditions raise it as the new gold standard for dengue diagnosis.     

LAMP技术检测弓形虫感染方法的建立

目的建立一种快速、简便的检测弓形虫感染的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法根据弓形虫RH株SAG1基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化扩增体系与参数。通过与常规PCR方法的比较,评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。利用建立的LAMP初步检测人工感染弓形虫4 d后白兔与大鼠的肌肉组织。结果 LAMP法检测弓形虫基因组DNA的灵敏度是传统PCR方法的100倍。LAMP法检测与其他常见寄生原虫、寄生虫无非特异性阳性结果。LAMP法检测人工接种动物的肌肉组织,阳性率达到100%,对照组为0,差异有统计学意义(P0.01)。结论 LAMP法检测弓形虫感染快速简便、敏感性高、设备要求低,具有较好的应用前景。     

环介导等温扩增技术在检测痰标本结核分枝杆菌中的应用

目的评价结核分枝杆菌环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测试剂盒的临床应用效果。方法选取肺结核患者183例（肺结核组）和非肺结核患者120例（对照组）。采用涂片抗酸染色、罗氏培养法和LAMP对痰标本进行检测,采用结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒（TB- PCR）检测罗氏培养与LAMP结果不符的标本,分析LAMP与罗氏培养的检出率及两者的符合率。结果去除经鉴定为非结核分枝杆菌的10例标本,涂片抗酸染色、罗氏培养法和LAMP的阳性检出率分为64.1%（111/173）、64.7%（112/173）、78.6%（136/173）。LAMP与抗酸染色、罗氏培养阳性检出率的差异有统计学意义（P＜0.01）,抗酸染色与罗氏培养比较差异无统计学意义（P＞0.05）。以罗氏培养为金标准,LAMP检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为88.5%（108/122）、82.3%（149/181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163）,LAMP检测与罗氏培养的符合率为84.8%（257/303）。结论结核分枝杆菌环介导等温扩增技术的灵敏度和特异度高,具有简单易行、快速准确的特点,在肺结核患者的早期诊断中将发挥重要作用。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

树鼩粪便中沙门氏菌LAMP检测方法建立及应用

目的建立树鼩粪便沙门氏菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行初步应用。方法根据沙门氏菌种属特异性基因inv A(侵袭蛋白基因A)的保守序列,设计合成特异性LAMP引物。分别设定十个反应温度即57℃~66℃和十个反应时间即24~42 min进行优化,并测定本方法的特异性和灵敏度;同时进行普通PCR实验,作为本方法的验证和比较。用建立的LAMP法对91份野生来源的树鼩稀便样品进行检测。结果优化反应条件选出反应温度为62℃,反应时间34 min;该方法对沙门氏菌的灵敏度可达3.36×101CFU/m L,比普通PCR方法高10~100倍;对10种树鼩来源的肠道细菌进行LAMP检测,只有沙门氏菌属的肠炎沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌检测为阳性,其余为阴性;对91份野生树鼩粪便样品进行LAMP检测,阳性检出率为20.88%;LAMP法的所有反应可在40 min内完成。结果可通过肉眼观察颜色变化直接判定。结论所建立的LAMP方法具有便捷、快速、灵敏、特异等特点,可用于树鼩粪便中沙门氏菌的大规模快速检测。